SN∕T 5106-2019 登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法.pdf

书 书 书犐 犆犛 犆 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 登革热媒介蚊类犇犖犃条形码鉴定方法犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犻 狀 犵犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犇犲 狀 犵 狌 犲狏 犲 犮 狋 狅 狉 犿狅 狊 狇 狌 犻 狋 狅 犲 狊 发布 实施中华人民共和国海关总署发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福州海关。本标准起草人：方义亮、张建庆、林醒忠、王宇平、黄恩炯、房长天、吴荣泉。犛犖犜 登革热媒介蚊类犇犖犃条形码鉴定方法范围本标准规定了登革热媒介蚊类条形码鉴定方法中提取、基因的扩增及序列的比对分析、结果判定等。本标准适用于登革热媒介蚊类白纹伊蚊（犃犲 犱 犲 狊犪 犾 犫 狅 狆 犻 犮 狋 狌 狊） 、埃及伊蚊（犃犲 犱 犲 狊犪 犲 犵狔狆 狋 犻）成虫、幼虫、蛹、残肢不全等标本的条形码鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 医学媒介生物标本采集、制作及保存规程 卫生检疫人员的自我防护规范第部分：实验室人员 国境口岸医学媒介昆虫条形码鉴定操作规程 临床诊断中聚合酶链反应（）技术的应用方法原理利用通用引物对线粒体中的犆犗犐基因的特定片段进行扩增，产物克隆或者直接测序后，得到长度不少于 的有效序列，与本标准的标准序列进行比对，从而达到物种快速准确鉴定的目的。鉴定程序 准备实验室需具备的设备和试剂参见附录。实验室生物安全符合 和 的规定；防污染措施遵照 的要求。配置电泳液（） ：将 碱 ，冰醋酸 ， （ ） ，定容至，用双蒸水稀释 倍。 标本处理 取样标本样品经过冷冻或乙醚麻醉，死后取成批同种样品的单份标本、珍稀单份标本取对称一侧组织（如单侧蚊足）置于灭菌的洁净 离心管留用，如长期不用需放置体积分数为 以上乙醇 保存。标本的其它同种个体或者部分针插作为凭证标本。犛犖犜 凭证标本制作将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照 的要求执行。 犇犖犃制备将单份样品（成虫、幼虫、蛹）置于已灭菌的洁净 离心管后用研磨棒研磨，利用商品化昆虫提取试剂盒进行蚊虫基因组提取（样品为单只蚊的，需去掉头部后（如有吸血的需要去腹部）后再研磨） ；样品为少量对称一侧组织（单侧蚊足）置于已灭菌的洁净 离心管后用研磨棒研磨，利用微量组织提取方法（参见附录）进行蚊虫基因组的制备，制备好的进行浓度及纯度测定后，保存至 冰箱备用。 犘犆犚扩增 引物 ： ： 扩增体系推荐用 体系，可用商品化的 。验证体系有无污染，可同时设置空白对照和阴性对照；验证反应正常，可设置阳性对照。 正反引物（ ）各模板（ ） 为了提高反应的效果，根据模板的浓度，可以适当增加模板的体积，同时相应减少 体积，体系体积不变。 扩增条件第一步： ；第二步： ， ， ， 个循环；第三步： 。 犘犆犚产物检测 琼脂糖凝胶的配置称取 的琼脂粉倒进盛有 的烧瓶内，置入微波炉加热使其充分溶解直至透亮即可。 电泳取扩增产物（内含有染料） ，点样于质量浓度为 的琼脂糖凝胶（含有溴化乙锭） ，电泳缓冲液为，在恒压 电泳 ，用凝胶成像系统成像并拍摄。 序列测定序列扩增产物电泳条带在 左右（参见附录） ，具有目的片段电泳条带的扩增产物可委犛犖犜 托专业的测序公司进行双向测定（测序引物同扩增引物） ，送样具体按照所选公司的要求进行。有条件的实验室可以选择克隆测序，克隆的流程按 规定执行。 序列分析测序结果利用生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部分序列。与附录中白纹伊蚊标准序列、附录的埃及伊蚊标准序列进行比对，比对流程参见附录。结果判定比对结果相似种为白纹伊蚊并且相似度大于或等于 者为白纹伊蚊（参见附录） ；比对结果相似种为埃及伊蚊并且相似度大于或等于 者为埃及伊蚊（参见附录） 。犛犖犜 附录犃（资料性附录）主要设备与试剂犃 仪器和用具普通台式离心机（相对离心力大于 犵） 、各量程（、 、 、 、 、 ）可调移液器、温度可调式水浴锅、生物安全柜或者超净工作台、扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。犃 耗材 离心管、 管、各量程的移液器 、无粉一次性手套。犃 试剂和材料需要的试剂：体积分数为 乙醇、动物组织基因组提取试剂盒、 （含染料） 、产物纯化试剂盒、琼脂糖、标准分子量标、电泳液。使用微量组织提取需要： 、 、 蛋白酶。克隆测序需要的试剂： 、 感受态细胞、 、 、 、 。犛犖犜 附录犅（资料性附录）微量组织犇犃犖提取方法犅 配置裂解液配置 裂解液（ ， ， ， 蛋白酶）犅 热裂解吸取 裂解液，加样匀浆，加 ，煮沸 。犅 离心 离心 ，取上清备用。犛犖犜 附录犆（资料性附录）扩增产物电泳胶图注：标准分子量标；：阴性对照；：蛹样品；：幼虫样品；：成虫样品。图犆 扩增产物电泳胶图犛犖犜 附录犇（规范性附录）白纹伊蚊条形码标准序列（犆犗犐）登录网站 输入登记号： ，可获得如下序列：；划横线部分为引物，序列比对时不包括在内。犛犖犜 附录犈（规范性附录）埃及伊蚊条形码标准序列（犆犗犐）登录网站 输入登记号： ，可获得如下序列：；划横线部分为引物，序列比对时不包括在内。犛犖犜 附录犉（资料性附录）序列比对（犅犔犃犛犜）流程 进入网站进入网站主页： ： ，见图 。图 犅犔犃犛犜网站主页 点击狀 狌 犮 犾 犲 狅 狋 犻 犱 犲犫 犾 犪 狊 狋进入核酸序列比对界面将附录中白纹伊蚊标准序列或附录中的埃及伊蚊标准序列、目标序列分别复制黏贴进空白栏后，其他选项选择默认，点击下方提交，见图 。图 输入目标序列和标准序列比对页面犛犖犜 比对结果演示如图 和图 所示，目标序列与标准序列比对相似度（ ）大于或等于 可判定为同一种。图 埃及伊蚊目标序列与标准序列比对结果演示图 白纹伊蚊目标序列与标准序列比对结果演示 犛犖犜