饲料微生物学检测技术.doc

微生物制剂检测规程

广州金水动物保健品有限公司

2010.11.6
微生物检测实验室的要求
1．检测区
微生物实验室的区域要求做如下的特定操作：接收、贮存、制备和样品处理；培养基和设备的制备和灭菌；分析操作：称重、稀释、接种、传代、培养、菌株的保存等；设备的去污与清洁、分析废弃物的处理。
2.检测试验室的位置
微生物分析的环境不应影响分析的可靠性。
谨慎选取检测试验室的位置，避免交叉污染的危险。
注意避免极端环境如高温、灰尘、潮湿、水蒸汽、噪音、振动或直接被阳光曝晒等。
检测区应足够大，以保持工作区域干净整齐。在整个检测实验室房舍区内，建议每个检测人员的人均工作平面面积约为20m2。
在检测期间，只有操作人员才能进入检测区。
以下工作应设立单独的房间、区域和/或特定区：
样品的接收和贮存；
样品的制备，尤其是原始材料（如含大量微生物的粉状制品）；
培养基和玻璃仪器的制备、准备与灭菌；
玻璃器皿和其它器材的清洗以及器材污染的清除和已经污染的培养基的处置；
食品无菌状态的检查。
对以下区域也应考虑隔离：
培养基制备区和培养基、器材的灭菌间；
污染净化区和洗涤区。
培养箱、冰箱和冷冻柜可专门放于合适的房间。
3.无菌间和洁净装置
接种、移种等无菌操作在无菌室或洁净装置内进行。实际上，无菌室或洁净装置并不是绝对无菌，只是要求空气达到一定的洁净程度。空气洁净程度用洁净度等级来衡量，空气中的尘埃粒子数则用尘埃粒子计数器测量。无菌操作应在达到100级的空气中进行。
无菌室的洁净程度有时也可用菌落数来评价，通常是将无菌平板开盖暴露20-30 min，经培养后，如平板上菌落数少于3个即合格。
无菌室空间不宜太大，一般为4-6m2，高约2-2.5 m。为了减少外界空气的干扰，要设1-2个缓冲间，无菌室一般用拉门和固定双层玻璃窗。墙面、地坪和天花板的表面应光滑、无裂缝。墙角砌成圆弧形，地坪有1/500坡度。室内的固定设备应昼尽量简单，工作台最好嵌在墙上，管道、电线等设施则以铺设暗线为佳。
无菌室通常用36英寸30W紫外灯灭菌（新灯波长2300-2540A），使用前照射30 min。一般，一支紫外灯能用2500 h，喷洒或揩擦用的化学灭菌剂包括：0.25-0.5%新洁尔灭，0.5%过氧乙酸，75%酒精，0.5-1%漂白粉等。必要时，可用甲醛（每米3空间用10-15 mL甲醛和5 g高锰酸钾）薰蒸12-24 h。
完善的无菌室应具备空气调节系统，引入净化空气以维持室温22-25℃和70%左右的相对湿度.室内保持24.5-73.5 Pa的正压，换气次数为5-12次/h。
洁净装置最初用于预防放射性尘埃，后来则在电子、计算机、医药和微生物工程等领域得到广泛的应用，它的工作原理是使空气经过高效过滤器的过滤而得以净化，并因呈单向、平行、均匀地流动的层流状态而达到洁净工作区的目的，常用流速为0.2-0.8 m/s。
洁净装置按其结构可分为洁净工作室和洁净工作台两类，按照空气在工作区内的流动方向，则可分为垂直式和水平式两类。
洁净工作台主要由箱体，空气过滤器、风机、工作区、配电箱和照明灯具等构成，空气过滤器有两级或三级之分。初效和中效过滤器常用一定孔径的聚氨酯泡沫塑料和涤纶-晴纶无纺布材料为过滤介质，常规使用3个月左右就最好清洗一次过滤介质，以减轻高效过滤器的负担，高效过滤器的常用过滤介质为超细玻璃纤维纸或其他微孔滤膜。
一般，洁净工作台放置在环境清洁的实验室中使用即可；如无菌要求很高时，可考虑将洁净工作台放入无菌室内。操作时，应尽量避免明显扰乱工作区气流的动作。
4.室内设施
（1）为减少被灰尘和微生物污染的可能性，检测室应配备以下设施：
实验室用的墙、天花板和地板应是平滑、易清洗、耐清洁剂和消毒剂的腐蚀；
楼顶上的输液管道不能穿过房屋，除非被密封起来；
如果没有特殊原因，窗户外面应装有日光辐射防护系统；
门窗应能密合关闭，以免检测时受气流影响；而且，其设计应使它们避免形成吸尘死角，且便于清洁。
（2）环境温度和空气质量（微生物含量、湿度、尘埃分布等级等）应适合进行检测的要求。为此，建议在空气入口安装通风过滤系统。
当在低污染气氛下进行检测时，房间应专门装有一个层流式超净工作台或（和）一个安全的工作台。
（3）实验室台面和桌柜应用平滑、无渗透的材料制成，以便于清洁和消毒。如果可能，橱柜应达至天花板，以防灰尘堆积。
实验室内桌柜的设计应便于地板的清洗（如用可移动桌柜）。
应有封闭的贮存设施，对样品、培养基和试剂等的操作文件进行保存。
注意：不常用的文件或书应放在检测区外。
（4）房屋应有很好的照明设施，避免反射光干扰。应尽可能地避免工作区和敏感的仪器设备（特别是培养箱）直接曝露在阳光下。
5、维护和检查
地板、墙壁、天花板、实验室里的台面和桌柜定期维修，不能有裂缝。因为脏物可能会堆积于裂缝中而成为污染源。
为使环境条件达到检测要求，检测实验室区应定期进行清洁和消毒。
定期检修、维护通风和过滤装置，必要时更换过滤器。
定期监测表面和空气的微生物学质量。
表面污染可直接用含适当中性试剂的接触平板检查估测。空气质量可用含非选择性琼脂培养基的皮氏培养皿（如平板计数琼脂）暴露15 min后检验。
注：表面污染和空气污染程度也可用其它方法检查。
无菌间操作规程
1.无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。
2.严防一切灭菌器材和培养基污染，已污染的应停止使用。
3.无菌室应备有工作浓度的消毒液，如 70％的酒精，0.1％的新洁尔灭溶液等。
4.无菌室应定期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求。
5.需要带入无菌室使用的仪器，器械，平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。
6.工作人员进入无菌室前，必须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用70%的乙醇再次擦拭双手)，方可进入无菌室进行操作。
7.无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30min以上，操作完毕，应及时清理无菌室，再用紫外灯辐照灭菌20min。
8.供试品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染。检查前，用70%的酒精棉球消毒外表面。
9.每次操作过程中，应做阴性对照，以检查无菌操作的可靠性。
10.接种针每次使用前后，必须通过火焰灼烧灭菌，待冷却后，方可接种培养物。
11.带有菌液的吸管，试管，培养皿等器皿应浸泡在盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒，24h后取出冲洗。
12.如有菌液洒在桌上或地上，应立即用5%石碳酸溶液或3％的来苏尔倾覆在被污染处至少30min，再做处理。工作衣帽等受到菌液污染时，应立即脱去，高压蒸汽灭菌后洗涤。
13.凡带有活菌的物品，必须经消毒后，才能在水龙头下冲洗，严禁污染下水道。
14.无菌室应每月检查菌落数。取内径90mm的无菌培养皿若干，无菌操作分别注入融化并冷却至约45℃的营养琼脂培养基约15ml，放至凝固后，倒置于30-35℃培养箱培养48h，证明无菌后，取平板3-5个，分别放置工作位置的左中右等处，开盖暴露30min后，倒置于30-35℃培养箱培养48h，取出检查。平板杂菌数平均不得超过1个菌落。如超过限度，应对无菌室进行彻底消毒，直至重复检查符合要求为止。
微生物实验室常用仪器的维护与保养
1 显微镜
显微镜是贵重精密的光学仪器，正确的使用、维护与保养，不但观察物体清晰，而且延长显微镜的使用寿命。
1.1 显微镜应放置在通风干燥，灰尘少，不受阳光直接曝晒的地方。不使用时，用防尘罩罩起来。也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱内或柜内放置干燥剂。
1.2 显微镜要避免与酸、碱及易挥发腐蚀性的化学物品放在一起，以免显微镜受损。
1.3 从显微镜箱或柜内取出或放入显微镜时，应一手提镜臂，另一手托镜座，让显微镜起立，防止目镜从镜筒中脱落。
1.4 显微镜应防止震动和暴力。粗、细调节螺旋、聚光镜升降和标本推进器等机械系统要灵活而不松动，如不灵活可在滑动部位滴加少许润滑油。
1.5 显微镜的目镜、物镜、聚光镜和反光镜等光学部件必须保持清洁，防止长霉。镜检时通过转动目镜、物镜及调整焦距等措施判断灰尘或污脏所在的部位，如附有灰尘，则先用洗耳球吹去灰尘，或用擦镜纸轻轻擦去。若有污脏，用擦镜纸或脱脂棉球沾无水乙醚7份和无水乙醇3份的混合液轻轻擦拭，然后用擦镜纸擦干。显微镜的金属油漆部件和塑料部件，可用软布沾中性洗涤剂进行擦拭，不要使用有机溶剂。
1.6 用油镜观察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾少许上述混合液或二甲苯擦拭，最后用干净的擦镜纸擦干。混合液或二甲苯用量不要太多，以免溶解胶合透镜的树脂，使透镜脱落。
2 摇床
摇床又称摇瓶机，是培养好气菌的小型试验设备，并用于种子培养。常用的摇床有往复式和旋转式两种。往复式摇床来回冲击的嗓音较大，装料稍多时培养液易溅湿瓶塞而引起染菌，但从通气效果来看，则往复式优于旋转式。因此，应根据不同的菌种及工艺要求来选用摇床。
常用250、500、1000mL锥形瓶和10000mL血清瓶作摇瓶，培养基装量约为摇瓶体积的1/5-1/10。
2.1往复式摇床
往复式摇床是利用曲柄原理，由偏心轮带动连杆使摇床作往复运动。机身为铁制或木制的长方形框架，有一层至三层托盘，托盘上开有圆孔备放摇瓶。传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮即可改变往复频率。偏心轮上开有偏心孔，用来调节偏心距。为了防止摇床跳动，连杆与框架的角度约保持15°-40°角。一般频率为80-120 r/min，冲程为80-120 mm。
2.2旋转式摇床
旋转摇床是利用旋转的偏心轴使托盘作旋转运动。托盘可用铝板、塑料板、木板等制造，一般做成圆形，由三根呈等边三角形分布的偏心轴支撑（或由滚动轴承作支撑），在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下距离，使托盘保持水平，以保证旋转时平衡。
普通型旋转式摇床的转速范围为200-300r/min，偏心距一般为30-60 mm，无级变速摇床的最大调整范围可达0-400r/min。
3 灭菌锅
灭菌锅是一种压力容器，有立式和卧式两种类型，常用于小量培养基，无菌衣物以及大型玻瓶等的灭菌。除手提式灭菌锅外，其它的灭菌锅一般均设夹套，以减少锅内冷凝水和在灭菌结束时干燥锅内物品。
灭菌锅的排气管较小，因此在灭菌操作开始时必须注意排气是否畅通。如果排气不畅，锅内空气难以排除干净。此时，压力虽高而实际温度远比同压力下饱和蒸汽的温度为低，以致达不到灭菌要求。
微生物培养基质控要求
1.配制培养基原料
严格按照培养基成分要求购买培养基原料。
2.干粉培养基
干粉培养基的购买厂商，要尽可能选择优质品牌，培养基包装上应写明厂商名、产品号、包装量、配制要求、成分、使用和储存要求。对于购买的干粉培养基，要向相关厂家索要质控报告。
3.培养基配制过程控制
每次配制均按实要求的方法与分量，记录培养基名称、成分、配制量与操作者、pH值、日期。
4.质控实验
用标准菌株接种看其长势是否符合规定，质控实验需同时做阳性和阴性实验。购买的干粉培养基需对每批培养基做质控实验。自配培养基一年做1-2次质控实验。
微生物培养基的制备程序
配制一般培养基的主要程序可分为调配、融化、矫正pH值、分装、灭菌及检定等步骤。
1 调配：按培养基处方准确称取各成分，混悬于蒸馏水中。先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入蛋白胨、琼脂等各种固体成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。
2 融化：将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气融化半小时，如在电炉上融化应隔水加热，随时搅拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。融化完毕，应注意补足失去的水分。制备大量培养基时，除玻璃容器外，还可用搪瓷桶、不锈钢锅等容器加热融化，但不可用铜器或铁锅，以免金属离子进入培养基中，影响细菌的生长。
3 矫正pH值：应用酸度计准确可靠，但常用的是比色法或pH试纸。一般细菌培养基须矫正pH至7.4~7.6，此外亦有需要酸性或碱性的培养基，培养基在高压灭菌后，其pH值约降低0.1~0.2，故矫正时应比实际需要的pH值高0.1~0.2。
4 分装：根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管内。分装的量不能超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。琼脂斜面分装量为试管容量的1/2，灭菌后须趁热放制成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3。半固体斜面分装量为试管长度的1/3，灭菌后趁热直立，待冷后凝固。高层琼脂分装量约为试管长度的1/3。灭菌后直立凝固待用。如高层琼脂斜面灭菌后略放斜，使之既有高层又有斜面。琼脂平板须将灭菌（或已灭菌好加热融化）后的培养基冷至50℃左右，以无菌方式倾入灭菌平皿内，内径9cm的平皿倾注培养基约13~15mL，轻摇平皿底，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后即成。倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃、细菌、霉菌落入。新制成的平板培养基，表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣搁置于37℃培养箱内约30min，待平板表面干燥后使用。
5 灭菌：不同成分、不同性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。
5.1 高压蒸气灭菌法：高压灭菌的温度与时间随培养基的种类与数量的不同有所差别，一般培养基少量分装时高压灭菌121℃（0.103MPa/cm2）15min即可，培养基分装量较大时，可高压灭菌121℃（0.103MPa/cm2）30min，含糖的培养基高压灭菌113℃（0.055MPa/cm2）15min，以免糖类被破坏。
5.2 流通蒸气灭菌法：凡不耐高热的物质，如糖类、明胶、血清等培养基的灭菌，可用流通蒸气灭菌，使温度达80~100℃之间，维持30min，每天一次，连续3天。
5.3 血清凝固器灭菌：含血清、鸡蛋的培养基，可应用血清凝固器进行间歇灭菌。
5.4 水浴低温灭菌法：此法较为少用，是将血清等配制的培养基在水浴中加热56~57℃，维持一小时，以保持呈液体状态，连续5~7天水浴灭菌。
另外，还有滤过除菌法，可用于糖溶液、尿素液、血清等因加热即破坏的物质，可用滤菌器过滤除菌。
6 检定：每批培养基制成后须经检定后方可使用，检定时将培养基置37℃温箱内培养24小时后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上的生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。
7 保存：制好的培养基，不宜保存过久，以少量、勤做为宜。每批应注明制作日期。平日少量分装的试管培养基均宜存放于4℃冰箱内，其他基础培养基等可保存于冷暗处。
冻干菌种恢复培养的方法
1．安瓶管开封
（1）消毒：用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管。
（2）加热：用火焰将安瓿管顶端上集中一处加热。
（3）开裂：往加热处滴少许无菌水至安瓿管顶端，使玻璃开裂。
（4）打开：用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。钢挫法用纱布块或脱胎棉团包裹安瓶，在挫痕处折断安瓶。注意：纱布块或棉团不能太湿，以防止安瓶断后酒精进入菌种。
2．菌株恢复培养
（1）溶解悬浮：用无菌吸管，吸取0.3～0.5ml适宜的液体培养基或０.９％的生理盐水，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。
（2）接种培养：取0.1～0.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面／平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。
3．注意事项
（1）菌种活化前，请将安瓿管保存在6℃-10℃的环境下。
（2）厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态。
（3）某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长，此时请将步骤二(2)重复一次。
微生物菌种保藏技术
为达到长期保持菌种的优良特性，核心问题是必须降低菌种变异率，而菌种的变异主要发生于微生物旺盛生长繁殖过程。因此，必须创造一种环境，使微生物处于新陈代谢最低水平、生长繁殖不活跃状态。目前菌种保藏方法很多，但主要是根据以下原则而设计的：⑴必须选用典型优良纯培养物进行保藏；⑵创造有利于微生物休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧、缺乏营养以及添加保护剂等；⑶尽量减少传代次数，有利于达到长期保存菌种。
常用的简易保藏法包括常规转接斜面保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物的生长繁殖，从而延长保藏时间。液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱保存。液体石蜡主要起隔绝空气作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20℃或-70℃条件下，可大大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制成孢子悬液，无菌操作将孢子悬液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙子上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。
酵母菌的微生物学检验方法
1 范围
本方法规定了微生物饲料中酿酒酵母和产朊假丝酵母的检测方法及鉴定程序。
本方法适用于微生物饲料中酿酒酵母和产朊假丝酵母的检测。
2 设备和材料
2.1恒温培养箱：23℃。
2.2冰箱：0~4℃。
2.3吸管：容量为1、10、25 mL。
2.4三角瓶：容量为500 mL。
2.5平皿：直径为9 cm。
2.6试管：18×180 mm。
2.7显微镜。
2.8高压灭菌锅。
2.9烘箱。
3 培养基和试剂
3.1 麦芽粉的制法
取新鲜大麦（或小麦）若干，去杂，用水洗净，浸渍6~12 h，使其发芽，但芽不能过长。然后将发芽之麦粒晒干或烘干，磨成粉末即得麦芽粉。
3.2 麦芽汁的制法
称取一定量的干麦芽粉，加适当体积的水，在58~65℃下糖化3~4 h，每隔一定时间用碘液测定蓝色反应，如显蓝色，说明还没糖化彻底，直到加碘液无蓝色反应为止。使得到的麦芽汁糖度为12（勃力克氏）。煮沸后用纱布过滤。
3.3 麦芽汁培养基
3.3.1 成分
120Be麦芽汁1000mL 葡萄糖20g 琼脂20g 青霉素5万单位
3.3.2 制法
将上述成分（青霉素除外）溶解至水中，调节pH值至6.8~7.2，121℃灭菌25min。冷至45~50℃时，加入青霉素，混匀后倒平板。
4 酵母菌数的测定
4.1 检验程序如下：

试料

作成几个适当倍数的稀释液

选择2~3个适当稀释度，各以1 mL之量加入灭菌平皿内

每皿内加入适量麦芽汁培养基

72 h
28℃

菌落计数

报告

4.2 操作步骤
4.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的试料25 mL（或25 g）放入含有225 mL无菌盐水的灭菌三角瓶内作成1:10的均匀稀释液。
4.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL无菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
4.2.3 另取1 mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1 mL灭菌吸管。如此反复进行系列稀释，直至所需浓度。
4.2.4取适宜稀释度的溶液滴加至灭菌平皿上，每个稀释度二个平皿。
4.2.5 取100mL液化的麦芽汁培养基（加温至45~50℃）。每个培养皿中倾注10~12 mL，先向一个方向摇动，然后再向另一个方向摇动，使之充分混合均匀。注意避免培养基溅至平皿外或盖子内侧。静置，待固化。翻转培养皿28℃培养72 h。
4.2.5计数
对有效平皿进行菌落计数（取菌落30~300的平板）。
4.2.6鉴定
必要时要进行鉴定。
酵母菌的生物学特性：啤酒酵母菌在麦芽汁琼脂培养基培养，菌落形态与细菌相似，但比细菌大而厚，不透明，表面光滑，湿润粘稠，呈乳白色，形成假菌丝。菌体为单细胞，形状有圆形、椭圆形等，大小不一，2.2~10.5×3.5-21 μm。
产朊假丝酵母的生物学特性：个体形态：细胞卵圆形到长形，3.0~8.0×4.0~11.5μm，成假丝状排列。群体形态：在麦芽汁琼脂平板上28℃培养48h的菌落，乳白色凸起，圆形，大，直径约0.3~0.4mm，表面湿润光滑，边缘整齐。
5 结果计算与表述

产朊假丝酵母的测定
产朊假丝酵母（Candida utilis）可调节动物肠道微生态平衡，提高饲料消化率，增强动物机体免疫力。此外，由于产朊假丝酵母细胞富含维生素B和蛋白质，还能提供动物所需的部分营养物质。
产朊假丝酵母细胞呈圆形、椭圆形和圆柱形，大小为3.5~4.5μm×7~13μm。麦芽汁培养基上的菌落为乳白色，平滑，有光泽或无光泽，边缘整齐或呈菌丝状。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上，仅能生成一些原始的假菌丝或不发达的假菌丝或不发达的假菌丝，或无菌丝。适宜生长温度为25~28℃。一般0℃下停止生长，但并未死亡。能利用尿素、硝酸盐为氮源，五碳糖和六碳糖为碳源，发酵葡萄糖、蔗糖、1/3棉籽糖，不发酵半乳糖、麦芽糖和乳糖。能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，不能利用半乳糖和乳糖。
1.培养基
麦芽汁培养基
2 操作步骤
2.1以无菌操作将经过充分摇匀的试料25 mL（或25 g）放入含有225 mL无菌盐水的灭菌三角瓶内作成1:10的均匀稀释液。
2.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL无菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
2.3另取1 mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1 mL灭菌吸管。如此反复进行系列稀释，直至所需浓度。
2.4取适宜稀释度的溶液滴加至灭菌平皿上，每个稀释度二个平皿。
2.5取100mL液化的麦芽汁培养基（加温至45~50℃）。每个培养皿中倾注10~12 mL，先向一个方向摇动，然后再向另一个方向摇动，使之充分混合均匀。注意避免培养基溅至平皿外或盖子内侧。静置，待固化。翻转培养皿28℃培养72 h。
2.6计数
对有效平皿进行菌落计数（取菌落30~300的平板）。
2.7 鉴定
产朊假丝酵母的生物学特性：细胞呈圆形、椭圆形和圆柱形，大小为3.5~4.5μm×7~13μm。麦芽汁培养基上的菌落为乳白色，平滑，有光泽或无光泽，边缘整齐或呈菌丝状。能利用尿素、硝酸盐为氮源，五碳糖和六碳糖为碳源，发酵葡萄糖、蔗糖、1/3棉籽糖，不发酵半乳糖、麦芽糖和乳糖。能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，不能利用半乳糖和乳糖。
霉菌检测中必需注意的几个问题
饲料在加工、贮运过程中极易受霉菌污染，饲料一旦霉变，不仅其营 养价值会降低，适口性会破坏，而且霉菌毒素会直接危害动物和人类的健康，甚至导致死亡，因此霉菌及霉菌毒素污染所造成的损失已引起人们的高度重视。“霉菌(mould)”不是一个分类学上的名称，而是某些丝状真菌的俗称，指在基质上长成具有绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状的菌丝体的真菌，一般泛指毛霉、根霉、曲霉、青霉、镰刀菌等属真菌。近年来世界各国纷纷制订霉菌及霉菌毒素的限量标准，同时加强对霉菌检测技术的研究，并不断完善该项技术。我国在GB13078中公布了对我国部分饲料原料中霉菌总数的允许量、限用量及禁用量，检测方法依照GB13092，但在实际检验工作中，发现了不少问题。饲料生态区系具有多样性和复杂性的特点，我国饲料中霉菌污染又比较普遍，因此对霉菌
检测方法的研究具有重要的现实意义。
1．接种方式
常用的微生物接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国标方法中采用倾注法，然而有实验和报道证实：霉菌计数采用涂布法更合适。对霉菌计数来说，涂布法有以下几方面优越于倾注法:①在操作上更容易：倾注法要求将培养基熔化之后凉至45℃再注入培养皿中，但实际上在稀释菌液的同时，很难控制温度。如果培养基温度太高则可能使霉菌孢子受热损伤甚至死亡，同时如果样品已经稀释而培养基温度仍很高，则有可能使稀释液保持时间太长。如果温度太低时倾倒，培养基会凝固。如果在大批量进行检验时，则更难于掌握温度。②涂布法培养所需的时间较短，培养出的霉菌菌落数较多，霉菌孢子、菌落形态特征发育完全,便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育就受影响。③由于涂布法是先倒好培养基，后接种，因而可以知道培养基是否染上杂菌。因此，霉菌计数采用涂布法既准确又省时。
2．培养时间
对饲料霉菌的检测时间，国标中采用“培养3d后开始观察，应培养观察一周”。我们发现，正常培养条件下，许多样品在培养3天后已经无法准确计数，尤其是含有生长特别快、菌丝很多的菌如毛霉、根霉、木霉等样品和湿度较大的样品时，则必需提早观察记录，在48小时以内计数，否则菌丝就会覆盖整个平皿，无法准确计数。实验发现培养3～4天的菌落数与5～7天的基本相同，因此，饲料中霉菌计数，培养2天就应开始观察，如果只是计数，培养2～4天已基本达到目的，但如果还要进一步分类鉴定，则需要培养更长的时间(7～14天)。
3．培养基
国标中霉菌检测使用的是高盐察氏培养基（CAO），这种培养基仅适合于高渗性霉菌生长，所以严格说来，在此培养基中生长的菌数并不是真正的霉菌总数。但由于饲料中产生毒素的真菌，主要是曲霉属、青霉属和镰刀菌属，其中许多菌种是适应高渗的，因此，选用高盐察氏培养基还是具有一定代表性的。有时为了确切地反映样品中真菌的全貌，还可同时选用低渗性培养基，如马铃薯葡萄糖培养基；为了分离某种类型或特定的产毒真菌，也可用选择性培养基。
4．培养温度
国标中采用的温度为25～28±1℃。大多数霉菌的最适生长温度为25～30℃，但一些产曲霉毒素的菌株则需要更高的温度，如黄曲霉最适生长温度为35℃，构巢曲霉为33℃，烟曲霉为37℃，因此，培养温度应根据实际情况做适当调整。
5．计数范围
霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散，在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差，因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。在实验中发现，国标中计数范围中采用30～100显然不太合适，大部分饲料样品检测中含50～100个菌落已较难计数，因此，应尽量选择10～50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。而对含有菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)，以确保计数的准确性。
霉菌检测中应注重对污染菌相的分析
霉菌种类很多，但能产生霉菌毒素的只限于少数的产毒霉菌，而产毒菌种也只有少量菌株能产生具有危险性数量的霉菌毒素，因此仅对霉菌总数进行检测并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染饲料的安全程度。关于我国饲料中的菌相分析，这些年来已初步取得结果，我国饲料（粮）中常污染的霉菌有黄曲霉、杂色曲霉、变异曲霉、米根霉、青霉等，其中尤以黄曲霉和杂色曲霉为常见。国外有些研究者设计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g，蛋白胨10g，柠檬酸铁铵0.5g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH5.6)可以用于分离黄曲霉毒素产生菌。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2～3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此，针对不同样品，有目的地设计出相应的选择性培养基，以筛选污染菌中的危险菌群，将是一个值得探索的方向。
小结
①培养时间：为避免饲料样品中含有生长特别快、菌丝很多的菌，霉菌计数必需在48小时以内开始观察，否则菌丝就会覆盖整个平皿，无法准确计数；如果只作霉菌计数，培养2～4天已基本达到目的；如果要进一步分类鉴定，则需要培养更长的时间(7～14天)。
②接种方式：霉菌接种采用涂布法比倾注法更合适。
③计数范围：应尽量选择10～50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。而对菌丝很丰富、菌落特别扩散的菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。
④培养温度：25～28±1℃已经可以满足要求，特殊来源的饲料应根据实际情况做适当调整。
⑤仅对霉菌总数进行检测并不能全面反映其危害程度，更重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染饲料的安全程度。
枯草芽孢杆菌的测定
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可用于调节肠道菌群，维持微生态平衡。能抑制动物消化道中的大肠杆菌、沙门氏菌和促进乳酸杆菌生长的作用。枯草芽孢杆菌代谢产生的多肽类物质（枯草菌素）对某些有害菌也有抑制或杀灭作用。能分泌大量细胞外酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶及卵磷脂酶等，同时也分泌活性抗菌物质及挥发性代谢产物，提高母猪、肉仔鸡等动物的生产性能，提高饲料转化率和氮的利用率，减少氨和吲哚类化合物的生成。
枯草芽孢杆菌杆状，很少成链，通常为0.7~0.8μm×2.0~3.0μm。染色均匀，鞭毛侧生，能运动。革兰氏阳性，芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏生，0.8μm×1.5~1.8μm，游离孢子表面着色弱。琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色，菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化。当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱。生长温度最高为45~55℃，最适为37℃。接触酶阳性，能发生V-P反应，7%氯化钠和pH7.5可生长。能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，能水解淀粉。可利用柠檬酸盐作为碳源，能还原硝酸盐成亚硝酸盐，可分解酪素，不能利用丙酸盐分解酪氨酸，在55℃生长的菌株不被0.02%的叠氮化合物抑制。
二、检测方法
1 培养基
1.1 BPY琼脂：牛肉膏5g 蛋白胨10g 酵母膏 5g 葡萄糖5g NaCl5g 琼脂15-20g 蒸馏水 1000ml pH7.0-7.2
2 采样与试样制备
进行微生物检验试料的采样和试样制备参照GB 4789.1-1994第1.2条和GB/T 14699.1，采样方法。实验室样品真实、具有代表性、在运输和贮存过程中没有发生损失或改变是非常重要的。
2.1 采样必需在无菌操作下进行。
2.2 采样工具，如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，必须是灭菌的。
2.3 根据样品的种类，如袋、瓶和罐装者，取完整的未开封的。如果样品很大，则需用无菌采样器取样；样品是固体粉末，应边取边混和；是流体的，通过振摇即可混匀；样品送到微生物检验室应越快越好，一般应不超过3 h。如果路途遥远，可将试样于0~5℃中保存（如冰壶）。
2.4 采样数量和方式按GB/T 14699.1，饲料采样方法。
3 枯草芽孢杆菌菌数的测定
3.1 检验程序如下：

试料

作成几个适当倍数的稀释液

选择2~3个适当稀释度，各以1 mL之量加入灭菌平皿内

每皿内加入适量BPY琼脂培养基

48 h
37℃

菌落计数

报告

图 枯草芽孢杆菌检测程序图
3.2 操作步骤
3.2.1 采样应不少于500g，从中称取10g（精确至0.01g），加入带玻璃珠的盛有90mL无菌水的三角瓶中，置80℃水浴中30min，然后在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min。
3.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL无菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
3.2.3 另取1 mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
3.2.4将融化后凉至45~50℃的培养基倒入培养皿（12-15mL）中混均后制成平板。同时，做空白实验，选择2~3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作二个平皿。凝固后翻转培养皿37℃培养18-24h。
3.2.5 菌落鉴别及计数
根据被检菌种的菌落特征与杂菌区别开。进行革兰氏染色或芽孢染色，在显微镜下观察。必要时要进行生化鉴定，识别后取菌落30~300的平板计数。
3.2.6生物学鉴定
从平皿中取出挑出5个菌落进行鉴定。
枯草芽孢杆菌：为革兰氏阳性、两端钝圆的粗短杆菌，2~8×0.7~1.0μm，单个或短链，有动力，无荚膜，卵圆形芽孢近于菌体一端，大于菌体宽度。在普通琼脂平板上极易生长，菌落不整齐、灰色、表面粗糙、干燥有皱纹，边缘不呈卷发状。在液体培养基表面形成较厚的具皱纹的菌膜。可分解甘露醇、阿拉伯糖及木糖，产酸不产气。不产生卵磷脂酶。
4 结果计算
菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定，根据证实为枯草芽孢杆菌菌落数计算出该皿内的此菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此菌数。如含有枯草芽孢杆菌的试料中10-6稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的枯草芽孢杆菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为枯草芽孢杆菌的是4个，由1克试料中含枯草芽孢杆菌菌数为：。

式中：A—测定的枯草芽孢杆菌菌落数，cfu/g或cfu/mL。
B—枯草芽孢杆菌的可疑菌落总数。
C—5个鉴定的菌落中确认为枯草芽孢杆菌的菌落数。
f—稀释倍数。
地衣芽孢杆菌的测定方法
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）孢囊不膨大，无伴孢晶体，接触酶阳性，V-P反应阳性，中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。革兰氏液染色呈紫色阳性菌。地衣芽孢杆菌对葡萄球菌、酵母菌等致病菌有拮抗作用，而对双岐杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化链球菌有促进生长作用，从而可调整菌群失调。
1 培养基与稀释液
1.1 BPY培养基
1.2 营养肉汤或生理盐水。
2 分析步骤
按无菌操作要求，称样品10克，加入装有100mL稀释液（营养肉汤或生理盐水）和适量玻璃珠的三角瓶内，振摇20min，做10倍递增稀释至10-7，量取10-5、10-6、10-7三个稀释度菌悬液1mL置平皿上，加入48~50℃的BPY琼脂培养基15mL，摇匀后放冷，倒置37℃培养18~24小时，（每个稀释度做3个平皿），取出平皿计菌落数，平皿可见的菌落数应在10~100为宜，若小于10个或大于100个，都应调整稀释度重新测定。
3 鉴定
3.1 见上述平板培养基上，菌落呈灰白色、边缘不整齐的扁平菌落。
3.2 显微镜下见杆菌（0.9~1.2×2.2~3.8微米），中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。
3.3 取上述平板培养基上菌株，用革兰氏液染色，此菌呈紫色阳性菌。
乳酸菌的微生物学检验方法
乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。乳酸细菌主要包括23个属，通常在饲料中用作有益微生物的菌种有干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植