纤维素分解菌与酵母菌混菌发酵体系对土壤中纤维素物质降解研究.doc

纤维素分解菌与酵母菌混菌发酵体系对土壤中纤维素物质的降解研究
王钟1 ，杨仁斌1，李欢（1，2），傅强1
(1湖南农业大学农业环境保护研究所，湖南长沙410128；2长沙环境保护职业技术学院，湖南长沙410004)

摘 要 ：本文研究了纤维素分解菌与酵母菌组成的二元混菌体对纤维素酶活性的影响。在纤维素分解菌的发酵期间引入酵母菌来解除纤维素分解菌分解纤维素时的产物对纤维素酶的反馈抑制。通过在不同时间接入酵母菌，找出最适接入时间。通过在最适时间接入不同量梯度的酵母菌，找出最适接种量，同时分析纤维素分解菌与酵母菌在反应器中的动态变化。结果表明：两种菌混菌发酵纤维素的活性较单菌发酵大幅度提高，酵母菌的最适接入时间是72h，最适接入量为6.4×106cfu/mL；混菌发酵有利于缩短纤维素生产发酵周期。
关键词：纤维素分解菌； 酵母菌； 反馈抑制；混菌发酵
Studies on the kinetics of cellulose with mixing strains
WANG Zhong1，Yang Ren-bin， LI Huan(1，2)，FU Qiang1
(1Institute of Agro-Environmental Protection，Hunan Agficuhural University，Changsha 410128，China;2Changsha environmental protection college， Changsha 410004，China)
Abstract: The effects of cellulose activities were studied by mixed fermentation. A strain of cellulose decomposing microorganism was isolated from some bacterias . Inoculating candida in the fermentation system in different time and with different density to destroy the feedback of restrain from fermentation of cellulose decomposing bacteria and candida utilis. Respectively， the activity of cellulose system was significantly increased after candida was inoculated in the feimcntation system. The mixed feimentation of two dual microbes may be advantageous to shorten the fermentation cycle in cellulose production.
Key words: cellulose-decomposing strain ；candida utilis ；feedback of restrain；mixed fermentation

纤维素是地球上最丰富的多糖物质、也是地球上最丰富的生物资源，约占植物总干重的1/3~1/2。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量达5.7* 108t、约相当于我国北方草原年打草量的50倍。在农村，秸秆主要用作燃料、畜禽饲料与积肥，不仅利用率低、还对环境造成一定污染。纤维素的生物分解对开辟新能源和防治环境污染具有重要意义，因此一直是生物技术领域研究的重点。但纤维素结构复杂，纯培养微生物难以有效的分解它，因为纯培养微生物处理农作物秸秆存在问题。虽然木质纤维素分解菌及其酶类在发酵工业应用己研究了几十年，但迄今还没有一种微生物或一套酶系可按传统方法用于大规模降解纤维素，并在经济上取得效益，这主要是因为存在着下述一些问题：（1）纤维素酶的合成受其自身降解物的阻遏。现己证明，各种水溶性碳源和葡萄糖，纤维二糖、蔗糖、淀粉、甘油等对真菌和细菌纤维素酶的合成起降解物阻遏作用。例如构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶，β-l．4葡萄糖苷酶受到5%甘油或葡萄糖的降解物阻遏。（2）纤维素酶的催化功能受其酶促反应终产物的反馈抑制。有实验证明里氏木霉（Trichoderma reesei）的内切与外切葡聚糖酶的活性受到纤维二糖的抑制，而葡萄糖则可以抑制各种纤维素酶的活性。由于纤维素酶作用受到反馈抑制，所以酶解液生成葡萄糖的浓度不高。近年在纤维素生物分解中多种菌的协同作用逐渐引起人们的重视。
因纤维素结构复杂，一般分解纤维素的酶是由多个组分构成的复合酶。纤维素分解菌分解纤维素所产生的产物对纤维素酶具有反馈抑制作用。在纤维素分解菌的发酵期间接入酵母菌能解除该反馈抑制作用。CMC糖化力法是目前较常用的纤维素酶活测定手段，本文将报告通过CMC糖化力法对纤维素酶活性的测定来找出接入酵母菌的最佳接入时间以及最佳接入量。并通过对最佳接入时间最佳接入量的反应器中的底物稀释成不同浓度梯度，分别涂入土豆平皿和刚果红平皿中，通过菌落的变化来分析纤维素分解菌与酵母菌在反应器中的动态变化。这对提高纤维素分解菌的降解效率有十分重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验菌株
菌种由湖南农业大学资源环境学院环境毒理学研究室提供（纤维素分解菌纯菌种、酵母菌纯菌种）。
1.1.2培养基
1.1.2 .1土豆培养基（PDA）：（培养酵母菌用培养基）（配固体土豆培养基加入琼脂）
土豆（去皮）100g， 葡萄糖 10g，琼脂 2%， 水 500mL，PH 自然
1.1.2.2纤维素扩大培养基（麸皮/草粉 5：2）
麸皮 5g ，草粉 2g， (NH4)2SO4 0.15g ，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.04g ，Cacl2 0.04g，料：水 1：2
1.1.2.3牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 0.3g， 蛋白胨 1g，琼脂 2%，蒸馏水 100mL，PH 7.0-7.2
1.1.2.4刚果红纤维素培养基
KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，甲基纤维素粉 0.76g，刚果红0.08g，琼脂2%，水400mL
1.1.2.5基础发酵培养基：稻草-麸皮培养基
稻草粉 60%， 麸皮 40%， 豆粕（稻草粉和麸皮总量的30%），MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 2%， 料：水（1：1.2）
1.1.2.6 PDA斜面培养基：配方同1.1.2.1
1.1.2.7牛肉蛋白胨斜面培养基：配方同1.1.2.3
1.1.3试剂与溶液
0.1mol/l PH 4.6醋酸-醋酸钠缓冲液，DNS试剂（3.5—二硝基水杨酸试剂），1mg/mL葡萄糖标准溶液，羧甲基纤维素纳（CMC）溶液，普通蒸馏水。
1.1.4 仪器与设备
恒温水浴锅，721分光光度计，无菌操作台，分析天平，恒温烤箱，水浴恒温振荡器，人工气候箱，高压灭菌锅，离心机，1mL，2mL，5mL，10mL移液管，250mL锥形瓶，25mL比色管，玻璃试管。
1.2 方法
1.2.1 纤维素分解菌酶活测定
1.2.1.1葡萄糖标准曲线的绘制
分别取1mg/mL葡萄糖标准液1，2，3，4，5，6mL于50mL容量瓶中，移取不同浓度标液0.5mL于试管，加1.5mL缓冲液，3mL DNS试剂，沸水浴5-7min取出后立即加入蒸馏水10mL，摇匀，在550nm处比色测定（用0.5mL蒸馏水代替葡萄糖标准液调零），记录其吸光值。以葡萄浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程式。
1.2.1.2CMC酶活测定
1.5mLCMC溶液预热，加入0.5mL酶液，40℃恒温精确反应20min，立即加入DNS试剂3mL，沸水浴5-7min ，终止反应后加蒸馏水10mL，摇匀，用0.5mL缓冲液代替酶液作空白，用721分光光度计比色。按制作标准曲线同样的操作，测定吸光度，在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量。
X=W*n/T
式中：X—酶活力单位 u/g，W—吸光度在标准曲线上查出或算出的葡萄糖毫克数，n—酶液稀释的总倍数，T—反应时间（h）。
1.2.2纤维素分解菌酵母菌共菌发酵酵母菌最适接入时间检测
用接种笔将纤维素分解菌菌株、酵母菌菌株分别接入到纤维素分解菌扩大培养基、液体土豆培养基中（分别做两组平行实验），放入恒温振荡培养箱，于28-30℃振荡培养120h（酵母菌培养48h），放入冰箱中4℃保存。移取1mL纤维素分解菌菌液于T-1号、T-2号、T-3号、T-4号，T-5五个基础发酵培养基中（两组平行实验），搅拌均匀，放入恒温培养箱中30℃恒温培养，每隔24h依次接入1mL酵母菌菌液于T-2号、T-3号、T-4号固体发酵培养基中。共发酵120h后用羧甲基纤维素纳（CMC）测纤维素分解菌酶活，酶活最高的固体发酵培养基中对应的酵母菌接入时间为最适接入时间。
1.2.3 纤维素分解菌酵母菌共菌发酵酵母菌最适接入量检测
将放入冰箱中4℃保存的纤维素分解菌菌液、酵母菌菌液分别做系列稀释，稀释7个浓度至10－7。移取不同浓度梯度（10－2－10－7）的菌液0.5mL分别涂入刚果红平皿（纤维素分解菌菌液）、PDA平皿（酵母菌菌液）中。放入恒温箱中30℃恒温培养，依据活菌计数法，选取菌落长势均匀且菌数在30－300的刚果红平皿、PDA平皿的菌数与浓度为依据，推算其原液和各浓度梯度中纤维素分解菌与酵母菌的菌数。每毫升原菌液活菌数＝（同一稀释度三个以上重复平皿）菌落平均数×稀释倍数×2。
移取上述稀释10－1、10－2、10－3三个梯度的酵母菌菌液1mL，于1.2.1检测出来的最适接入时间分别于编号为L-1、L-2、L-3、L-4、L-5已经接入纤维素分解菌的固体发酵培养基中接入至L-2、L-3、L-4三个固体发酵培养基中。在恒温培养箱中于30℃恒温培养120h。用羧甲基纤维素纳（CMC）测纤维素分解菌酶活，酶活最高的固体发酵培养基中对应的酵母菌接入量为最适接入量。
1.2.4 发酵120h后酵母菌最佳接入时间最佳接入量反应器中纤维素分解菌与酵母菌的菌数统计
称取0.5g反应器中的反应物于装有9mL无菌水的玻璃试管中，摇匀，做系列稀释，稀释7个浓度梯度至10－7。分别移取不同浓度梯度（10－2－10－7）的菌液0.5mL涂入刚果红平皿（两组平行样）、PDA平皿中（两组平行样）。放入恒温箱中30℃恒温培养，依据活菌计数法，选取菌落长势均匀且菌数在30－300的刚果红平皿、PDA平皿的菌数与浓度为依据，推算其原液中纤维素分解菌与酵母菌的菌数。
2 结果与分析
2.1纤维素分解菌酵母菌共菌发酵酵母菌最适接入时间检测
发酵120h后用羧甲基纤维素纳（CMC）法测定T-1、T-2、T-3、T-4、T-5固体发酵培养基中纤维素分解菌酶活。葡萄糖标准溶液光密度测定及固体发酵培养基酶活测定结果见图1、图2。

图1：葡萄糖标准曲线图
Figure 1:Standard curve of glucose

图2：酵母菌不同接入时间固体培养基中纤维素分解菌酶液的吸光值
Figure 2: The optical density values of cellulose-decomposing microorganism after inserting candida utilis in different consistence indirectly.
由图2可知，引入酵母菌后，纤维素分解菌菌液酶活性有大幅度提高。其中，在72h引入酵母菌对解除纤维素分解菌分解纤维素时的产物对纤维素酶的反馈抑制最明显。在该段期间，纤维素分解菌已经适应固体发酵培养基中的环境，种群处于对数增长阶段，降低底物的能力强，相应降解产物对纤维素酶合成的反馈抑制作用相对较强，所以在此段时间引入酵母菌对该反馈抑制起到了一定程度的缓解作用。对纤维素分解菌的降解率有一定程度的提高。
2.2纤维素分解菌酵母菌共菌发酵酵母菌最适接入量检测
依据活菌计数法，每毫升原菌液活菌数＝（同一稀释度三个重复平皿）菌落平均数×稀释倍数×2，得出每毫升原纤维素分解菌菌液中纤维素分解菌的菌数为：49×107×2=9.8×108cfu/mL。每毫升不同浓度梯度酵母菌菌液中酵母菌菌数见表1：
表1：1mL不同浓度梯度酵母菌菌液中酵母菌菌数
Table 1: The mumble of candida utilis of different consistence
浓度梯度
原菌液
10-1
10-2
10-3
10-4
菌数cuf/mL
6.4×108
6.4×107
6.4×106
6.4×105
6.4×104
于发酵72h后向纤维素固体发酵培养基中引入不同浓度梯度（10－1、10－2、10－3）的酵母菌菌液1mL，共发酵120h后用CMC法测纤维素分解菌酶活，其测定结果见图3。

图3 酵母菌不同接入浓度固体发酵培养基中纤维素分解菌酶液吸光值
Figure 3: The optical density values of cellulose of cellulose-decomposing microorganism after inserting candida utilis in different consistence indirectly
从图3可以看出，接入不同浓度酵母菌后，纤维素分解菌的酶活活性有所提高，当接入酵母菌浓度为6.4×106cuf/mL时，纤维素分解菌酶活活性出现最高值。说明当纤维素分解菌菌液的浓度为9.8×108cfu/mL时，于发酵72h后，最适接入酵母菌的浓度是6.4×106cuf/mL，大约为原纤维素分解菌浓度的0.65%。于发酵72h，接入酵母菌浓度为6.4×106cuf/mL，固体发酵培养基发酵共120h后测定纤维素分解菌和酵母菌的菌数分别为：1.04×109 cuf/mL、1.22×108 cuf/mL。可见纤维素分解菌与酵母菌相对原液中的菌数有所增加，共菌发酵效果比较明显。
3 结论
纤维素分解菌固体发酵培养基中于发酵24h、48h、72h、96h接入一定浓度一定量的酵母菌生成共菌发酵系统，结果表明：发酵后72h为最适接入时间。可能是因为在该段时间内，纤维素分解菌基本适应固体发酵培养基中的环境，种群处于对数增长阶段，降解底物的能力强，相应降解产物对纤维素酶合成的反馈抑制作用相对较强，所以在此时间段接入酵母菌对改反馈抑制起到了一定程度的缓解作用。纤维素分解菌的降解率也有一定程度的提高。
纤维素分解菌固体发酵培养基发酵72h后接入不同浓度的酵母菌后，纤维素酶的活性有所不同。可见酵母菌接入量的变化对纤维素酶的合成及其催化功能有一定程度的影响，共菌发酵易引起菌种之间的生存竞争机制，在生存因子有限的情况下，一定比率的纤维素分解菌与酵母菌共菌发酵对提高纤维素分解菌的降解率有更好的协助作用。

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