山药多糖提取制备工艺的研究.doc

金 华 职 业 技 术 学 院
JINHUA COLLEGE OF PROFESSION AND TECHNOLOGY

毕业教学环节成果
（2011 届）

题 目 山药多糖提取制备工艺的研究
学 院 制药与材料工程学院
专 业 生物制药技术
班 级
学 号 201031100380131
姓 名
指导教师

2011年5月28日

金华职业技术学院毕业教学成果
目 录
摘 要 - 1 -
引 言 - 2 -
1 仪器与试药 - 3 -
1.1 仪器 - 3 -
1.2 试剂 - 3 -
2.2 样品溶液的制备 - 3 -
2.3 标准曲线的制备 - 3 -
2.4 山药多糖提取工艺过程 - 4 -
2.5 山药水溶性多糖提取工艺的确定 - 5 -
3 结果与讨论 - 6 -
3.1 山药多糖提取工艺条件的确定 - 6 -
3.1.1 料液比对山药多糖提取得率的影响 - 6 -
3.1.2 提取温度对山药多糖提取得率的影响 - 6 -
3.1.3 提取时间对山药多糖提取得率的影响 - 7 -
3.1.4 提取次数对山药多糖提取得率的影响 - 8 -
3.2 山药多糖提取工艺的优化 - 9 -
3.2.1 正交设计的因素和水平 - 9 -
3.2.2 试验设计及考察指标 - 9 -
3.3 醇沉工艺的优化 - 11 -
3.4 最优工艺实验验证 - 12 -
4 分析与结论 - 12 -
谢 辞 - 14 -
参考文献 - 15 -
山药多糖提取制备工艺的研究
金华职业技术学院生物制药技术
摘 要：目的：对山药多糖水提醇沉工艺进行研究，得出山药多糖的最佳提取工艺。方法：以山药总多糖为指标，采用分光光度法，单因素考察及正交设计试验法，对料液比、提取温度、提取时间、提取次数进行考察；并对醇沉浓度、醇沉时间和醇沉次数进行考察。结果：水提正交试验结果表明，料液比1:15，温度100℃，时间4h，提取2次为最佳工艺条件。醇沉正交试验表明，醇沉后溶液浓度为80%，时间为12h，醇沉1次。结论：该实验为山药多糖提取工艺的确定提供依据。
关键词：山药多糖、水提醇沉、正交设计试验法

引 言
山药既是一种珍贵的药用植物，又是一种常见的食物。山药为薯蓣科植物薯蓣(Dioscorea oppositaThunb.) 的干燥根茎[1]。山药性平,乃补益药中平稳之品。它平和的药性补而不腻,补而不滞,常在临床上收到意想不到的功效。山药是我国传统名方六味地黄汤的主药之一，李时珍在《本草纲目》中将其功用概括为“益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涎，润皮毛”五个主要方面[2]。现代医学研究表明,山药具有多种生物活性, 其中多糖被认为是主要功效成分。本研究旨在明确其化学成分以及含量，对山药多糖进行提取，以山药总多糖为指标，确定其制备工艺和质量控制方法，可进一步揭示山药的实用价值、利用潜力和经济价值，采用正交试验优化提取工艺，为山药的深入研究打下基础。
山药多糖是极性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇，常用水作为提取溶剂。多糖水溶液浓缩后，加入95%乙醇，醇沉的醇浓度根据多糖的结构和性质而不同，一般在70%—85%的范围内，静置24h后，分取沉淀，然后进行去小分子杂质、去蛋白质、去色素等处理，水层再进行醇沉，沉淀分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，60℃减压干燥。
植物多糖的提取一般根据多糖的特性，即多糖是极性大分子化合物，易溶于水或酸、碱、盐溶液，而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂，其特点是从不同的材料中进行提取，即相似相溶原理。一般工艺是：原料→水提→离心→醇沉→干燥→粗多糖。这是目前提取多糖最为常用的方法，本文采用水提醇沉的方法进行提取。

1 仪器与试药
1.1 仪器
旋转蒸发器（RE-52AA 上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（SHB III 上海亚荣生化仪器厂）；紫外可见分光光度计(UV-722N 尤尼柯上海仪器有限公司) ；恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器）；定量移液器（上海求精玻璃仪器厂）；万分之一电子天平（日本岛津）；电热恒温干燥箱（202-OAB 天津力泰斯仪器有限公司）；离心沉淀器（800型 上海手术机械厂）。
1.2 试剂
葡萄糖(产地:石家庄和平，批号110401 )、无水乙醇、95%药用乙醇、浓硫酸、苯酚均为分析纯，山药（产地：河南省新乡市，安徽德昌药业饮片有限公司）
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取干燥置恒重的葡萄糖适量，置于250mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.354mg/mL的葡萄糖标准溶液，备用。
2.2 样品溶液的制备
精密吸取山药饮片10.00g，加入95%乙醇100℃回流提取2次（每次1h，100mL），过滤，滤渣分别以1:15的料液质量体积比（mg:mL），100℃提取4h，过滤。重复提取3次，合并滤液，放至室温离心，除去淀粉沉淀。离心液浓缩至原体积的1/3，加无水乙醇至醇浓度为80%，静置过夜，离心。沉淀烘干后定容于100mL容量瓶，备用。
2.3 标准曲线的制备
总糖含量测定方法以苯酚-硫酸法测定，通过精密吸取葡萄糖标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL置于50mL容量瓶中，加入6%苯酚溶液溶液1.0mL，摇匀，加浓硫酸5.0mL，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀。另取蒸馏水同上操作制得空白溶液，通过波普扫描确定在490nm处测有最大吸收（见图1），测定490nm处吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线见图2。经回归统计，得标准曲线方程A=32.218X+0.0077，r2=0.9949，浓度在0.00708～0.02124mg/mL范围内与吸光值线性关系良好。

图1 紫外扫描图谱
表1 标准曲线
标准溶液体积mL
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
溶液浓度mg/mL
0.0354
0.0708
0.1162
0.1422
0.1775
0.2124
吸光度A
0.109
0.256
0.378
0.473
0.559
0.702

图2 标准曲线
2.4 山药多糖提取工艺过程
将山药饮片切碎，加无水乙醇浸泡72h（重复1次），过滤，将滤渣挥干乙醇，再用无水乙醇重复浸泡一次，取滤渣，加水20倍量加热、冷却、离心、沉淀（重复提取3次，每次4h）。合并3次离心液进行减压浓缩，提取浓缩液静置过夜，离心除去淀粉沉淀，取上清液浓缩，浓缩液加无水乙醇至乙醇含量达80%，静置过夜后离心，透析，透析液加95%乙醇至乙醇含量达80%，最后沉淀，沉淀物干燥得山药粗多糖（白色）。工艺流程图见图3:

图3 山药多糖提取工艺流程图
2.5 山药水溶性多糖提取工艺的确定
选取与山药多糖提取工艺密切相关的4个因素（料液比、提取温度、提取时间和提取次数）做单因素考察，确定山药水溶性多糖的提取工艺。在单因素考察结果的基础上进行L9(34) 正交试验，优化提取工艺。选取醇沉时间、醇沉次数和醇沉浓度3个因素做单因素考察，确定醇沉工艺，进行L9(33 ) 正交试验，对醇沉工艺进行优化。

3 结果与讨论
3.1 山药多糖提取工艺条件的确定
3.1.1 料液比对山药多糖提取得率的影响
取等量山药饮片8份，提取温度设定100℃，经过4小时提取3次后，对不同的料液比进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的料液比[4-5]。结果见图4。
表2 料液比对山药多糖提取得率的影响
料液比（g/mL）
1:5
1:10
1:15
1:20
1:25
1:30
1:35
1:40
提取率（%）
1.2234
1.5368
1.7645
1.5836
1.3820
1.1122
0.7872
0.6327

图4 料液比对山药多糖提取得率的影响
试验结果表明，随着加水量增加，可溶性多糖含量先升高后逐渐降低，在15倍时达到最大值，故加水量选为1：15。
3.1.2 提取温度对山药多糖提取得率的影响
取等量山药饮片8份，每份料液比为1：15，经过4小时提取3次后，对不同的温度进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的提取温度。结果见图5。

表3 提取温度对山药多糖提取得率的影响
温度（℃）
30
40
50
60
70
80
90
100
提取率（%）
0.0256
0.0176
0.0368
0.0652
0.1855
0.1936
0.3219
0.8798

图5 提取温度对山药多糖提取得率的影响
该试验表明温度因素对山药水溶性多糖的提取有显著影响。随着提取温度的升高，可溶性多糖含量逐渐升高，100℃时达到最大值，故选提取温度为100℃。
3.1.3 提取时间对山药多糖提取得率的影响
取等量山药饮片5份,每份料液比为1：15，分别回流3次，对不同的时间进行提取比较，根据提取效果来确定最佳的提取时间。结果见图6
表4 提取时间对山药多糖提取得率的影响
时间（小时）
1
2
3
4
5
提取率（%）
0.5131
0.6246
0.7139
0.8453
0.7437

图6 提取时间对山药多糖提取得率的影响
该试验结果表明，山药可溶性多糖含量随着提取时间先升高后降低，在4h达到最大值，故选取提取时间为4h。
3.1.4 提取次数对山药多糖提取得率的影响
取等量山药饮片4份,每份料液比为1：15，温度设定100℃，经过4小时提取，对不同的次数进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的提取次数。结果见图7
表5 提取次数对山药多糖提取得率的影响
提取次数（次）
1
2
3
4
提取率（%）
1.216
1.2576
1.2582
1.2578

图7 提取次数对山药多糖提取得率的影响
结果可见，随着提取次数增加，山药多糖含量逐渐增加。但2次与3次、4次含量差别不是很大，故从高效提取角度考虑，选取2次为最佳提取次数。
3.2 山药多糖提取工艺的优化
3.2.1 正交设计的因素和水平
为了提高山药多糖的得率, 采用L9(34)正交表,选用料液比、提取温度、提取时间、提取次数作为考察因素，每个因素拟订3个水平[5-6]。见表6。
表6 因素水平表
水平
因素
A/料液比(倍)
B/提取温度(℃)
C/提取时间(h)
D/提取次数(次)
1
10
80
2
1
2
15
90
3
2
3
20
100
4
3

3.2.2 试验设计及考察指标
取山药饮片9份，每份10g，95%乙醇100℃回流提取2次（每次1h，100mL），药渣按正交设计方案提取，提取液静置，待至室温离心除去淀粉沉淀，离心液浓缩至原体积的1/3，浓缩液加加无水乙醇至醇浓度为80%。计算多糖得率。结果见表7。

表7 直观分析表
实验号
因素
Y(%)
A/料液比
B/提取温度
C/提取时间
D/提取次数
实验1
1
1
1
1
0.5560
实验2
1
2
2
2
0.7542
实验3
1
3
3
3
0.6818
实验4
2
1
2
3
0.6668
实验5
2
2
3
1
0.6901
实验6
2
3
1
2
0.7445
实验7
3
1
3
2
0.7242
实验8
3
2
1
3
0.5940
实验9
3
3
2
1
0.6523
均值1
0.664
0.649
0.631
0.633

均值2
0.700
0.679
0.691
0.741

均值3
0.657
0.693
0.699
0.648

极差
0.043
0.044
0.068
0.108

表8 方差分析表 F0.1-1（2,2）=9，α=0.1
因素
偏差平方和
自由度
F比
F临界值
显著性
料液比
0.003
2
0.343
3.110

提取温度
0.003
2
0.343
3.110

提取时间
0.008
2
0.914
3.110

提取次数
0.021
2
2.400
3.110

误差
0.04
8

注：α=0.1 *表示有显著性差异。
根据方差分析可知，提取温度、时间、次数对山药水溶性多糖的提取影响较大。水提部分四个影响因素的主次顺序为提取次数＞提取时间＞提取温度＞料液比，最佳提取工艺为A2B3C3D2，即采用15倍量水于沸水浴中提取2次，每次提取4小时。
3.3 醇沉工艺的优化
正交设计的因素与水平：根据影响醇沉工艺的因素，选择醇沉时间、醇沉次数、醇沉浓度3个主要因素作为考察因素，每个因素选择3个水平，进行实验，见表9。
表9 醇沉工艺因素水平表L9（33）
水平
因素
A/醇沉时间（h）
B/醇沉次数（次）
C/醇沉浓度（%）
1
6
1
75
2
9
2
80
3
12
3
85
表10 醇沉工艺考察实验设计
实验号
因素
Y
（%）
A/醇沉时间
B/醇沉次数
C/醇沉浓度%
1
1
1
1
0.7242
2
1
2
2
0.8902
3
1
3
3
0.6682
4
2
1
2
0.8018
5
2
2
3
0.7653
6
2
3
1
0.6474
7
3
1
3
0.9488
8
3
2
1
0.7240
9
3
3
2
0.7921
均值1
0.761
0.825
0.699

均值2
0.738
0.793
0.828

均值3
0.822
0.703
0.794

极差
0.084
0.122
0.129

根据极差分析可知，以多糖得率为指标,醇沉时间、醇沉次数以及醇沉浓度对多糖得率影响不大。醇沉部分三个影响因素的主次顺序为醇沉浓度＞醇沉次数＞醇沉时间，最佳提取工艺为A3B1C2。故为节省资源和操作简便，确定醇沉工艺为：醇沉后，溶液浓度为80%，醇沉1次，时间为12h。
3.4 最优工艺实验验证
在得出最优工艺条件下，进行平行实验，以保证实验的准确性。条件：同一批号取两个以上相同的样品，以完全一致的条件（包括温度、湿度、仪器、试剂，以及试验人）进行试验，看其结果的一致性。
最优工艺的平行实验：取同一批次的山药饮片3份。1号实验，把山药切碎，加无水乙醇浸泡72h（重复1次），过滤，将滤渣挥干乙醇，再用无水乙醇重复浸泡一次，取滤渣，加水15倍量加热（100℃）、冷却、离心、沉淀（重复提取2次，每次4h）。合并3次离心液进行减压浓缩，提取浓缩液静置过夜，离心除去淀粉沉淀，取上清液浓缩，浓缩液加无水乙醇至乙醇含量达80%，静置过夜后离心，透析，透析液加95%乙醇至乙醇含量达80%，最后沉淀，沉淀物干燥得山药粗多糖（白色）。剩余2、3号实验同上步骤，取得结果见表11。
综述所上：经平行实验测定，在最优工艺条件下，多糖得率为0.9565%。
表11 最优工艺的平行实验
次数
水平
A/料液比
B/提取温度（℃）
C/提取时间（小时）
D/提取次数
Y
（%）
平均值（%）
1
1:15
100
4
2
0.9543
0.9565
2
1:15
100
4
2
0.9616
3
1:15
100
4
2
0.9535
4 分析与结论
由图4可知，随着料液比的增加，山药中多糖的含量先升高后下降，在1：15时达到最大值。由图5可知，山药多糖的含量随着提取温度的升高而逐渐升高，且在100℃时达到最大值。由图6可知，随着提取时间的增加，山药多糖的含量先升高后降低，在4小时达到含量最大值。由图7可知，山药多糖的含量随着提取次数逐渐高，但2次与3次、4次得率差异不大，本着节约能源，提高效益的原则，故提取次数选择2次。
根据单因素考察及L9(34)正交设计结果表明,以水溶性多糖得率为指标，提取温度、提取时间和提取次数对多糖得率有一定的影响。影响因素的顺序为提取次数>提取时间>提取温度>料液比，综合多糖得率，确定最佳提取工艺为：100℃加15倍量水提取2次，每次4h。提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80%，醇沉时间12h，醇沉次数为1次。

谢 辞
我的论文能够如期完成是在导师悉心的指导下完成的，导师渊博的专业知识，严谨的教学态度，精益求精的工作作风，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标，掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。对此，我谨表示最诚挚的感谢！并衷心地祝愿他身体健康，工作顺利！
另外，我还要感谢杭州萧山平民大药房给了我实习的机会，让我更好的锻炼自己，充实自己的知识。感谢单位带队老师对我的指导与关照，感谢其他同事的照顾与帮助，是他们让我更有自信的去实践，更相信自己。
本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。此外，我要感谢大学所有老师对我三年来的教育和培养。在三年的大学生活中，我不仅学习了大量的理论知识，开阔了视野，学到了很多在实际生活中有用的东西。
最后感谢各位评审老师对我论文的指导！

参考文献
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