KJ 201705 水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法.pdf

附件 5 水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201705） 1 范围 本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。 本方法适用鱼肉、 虾肉、 蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物 （AOZ） 、 呋喃它酮代谢物 （AMOZ） 、呋喃西林代谢物（SEM） 、呋喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。 2 原理 样品中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（T 线）上硝基呋喃类代谢物-BSA 偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C 线）颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物进行定性判定。 3 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 盐酸。 3.1.2 三水合磷酸氢二钾。 3.1.3 氢氧化钠。 3.1.4 甲醇。 3.1.5 乙醇。 3.1.6 乙腈。 3.1.7 邻硝基苯甲醛。 3.1.8 三羟甲基氨基甲烷。 3.1.9 乙酸乙酯。 3.1.10 正己烷。 3.1.11 邻硝基苯甲醛溶液（10mmol/L）:准确称取 0.150g 邻硝基苯甲醛，用甲醇（3.1.4）溶解并定容至 100mL。 3.1.12 磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：准确称取 22.822g 三水合磷酸氢二钾（3.1.2），用水溶解并定容至 1000mL。 3.1.13 氢氧化钠溶液 （1mol/L） ： 准确称 39.996g 氢氧化钠 （3.1.3） ， 用水溶解并稀释至 1000mL。 3.1.14 盐酸溶液（1mol/L）：取 10mL 盐酸（3.1.1）加入到 110mL 水中。 3.1.15 三羟甲基氨基甲烷溶液（10mmol/L）：准确称取 1.211g 三羟甲基氨基甲烷（3.1.8），溶于 80mL 水中，加入盐酸（约 42mL）调 pH 至 8.0 后用水定容至 1L。 3.2 参考物质 3.2.1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量见表 1，纯度99%。 表 1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量 中文名称 英文名称 CAS 登录号 分子式 相对分子量 3-氨基-2-恶唑烷酮 3-anmino-2-oxazolidinone,AOZ 80-65-9 C3H6N2O2 102.09 5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮 5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ 43056-63-9 C8H15N3O3 201.22 1-氨基-2-乙内酰脲盐酸盐 1-Aminohydantoinhydrochloride,AHD 2827-56-7 C3H5N3O2 HCl 151.55 氨基脲盐酸盐 semicarbazidhydrochloride,SEM 563-41-7 NH2CONHNH2 HCl 111.53 注：或等同可溯源物质。 3.3 标准溶液的配制 3.3.1 标准储备液： 分别准确称取适量参考物质 （精确至 0.0001g） ， 用乙腈溶解， 配制成 100mg/L的标准储备液。-20冷冻避光保存，有效期 12 个月。 3.3.2 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液（3.3.1）各 1mL 于 100mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为 1mg/L 的混合中间标准溶液。4冷藏避光保存，有效期 3 个月。 3.3.3 混合标准工作溶液：准确移取 0.1mL 混合中间标准溶液（3.3.2）于 10mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度， 配制成浓度为 0.01mg/L 的混合标准工作溶液。 4冷藏避光保存， 有效期 1 个月。 3.4 材料 3.4.1 AOZ 试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.2 AMOZ 试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.3 SEM 试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.4 AHD 试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.5 固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格 1mL，填装量为 60mg。 4 仪器和设备 4.1 电子天平：感量分别为 0.1g 和 0.0001g。 4.2 均质器。 4.3 水浴箱。 4.4 离心机。 4.5 氮吹仪或空气吹干仪。 4.6 移液枪：10L，100L，1000L，5000L。 4.7 涡旋振荡仪。 4.8 胶体金读数仪（可选）。 4.9 固相萃取装置（可选）。 4.10 环境条件：温度 15-35，湿度80%。 5 分析步骤 5.1 试样制备 按照方法要求， 称取一定量具有代表性样品可食部分 （注： 甲壳类， 试样制备时须去除头部） ，用于后续实验。 5.2 试样提取和净化 称取适量的匀浆样品（以试剂盒操作说明书要求来定，精确至 0.01g）于 50mL 离心管。 5.2.1 方法一（液液萃取法） 称取 2g 0.05g 均质组织样品于 50mL 离心管中，依次加入 4mL 去离子水、5mL1mol/L 盐酸（3.1.14）和 0.2mL10mmol/L 邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11） ，充分振荡 3min；将上述离心管在 60水浴下孵育 60min；依次加入 5mL0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液（3.1.12） ，0.4mL1mol/L 氢氧化钠溶液（3.1.13） ，乙酸乙酯 6mL，充分混合 3min，在室温（2025）下 4000r/min，离心 5min；移取离心后的上层液体 3mL 于 5mL 离心管中，60下氮气/空气吹干；向吹干的离心管中加入 2mL正己烷，振荡 1min，然后加入 0.5mL 10mmol/L 三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15） ，充分混匀 30s，室温下 4000r/min，离心 3min（或静置至明显分层） ；下层溶液即为待测液。 5.2.2 方法二（固相萃取法） 称取 6g 0.05g 均质组织样品于 50mL 离心管中，依次加入 4mL 去离子水、5mL1mol/L 盐酸（3.1.14）和 0.2mL10mmol/L 邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11） ，充分振荡 3min；将上述离心管在 60水浴下孵育 60min；依次加入 5mL0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液（3.1.12） ，0.4mL1mol/L 氢氧化钠溶液（3.1.13） ，乙酸乙酯 6mL，充分混合 3min，在室温（2025）下 4000r/min，离心 5min；移取离心后的上层液体 3mL 于 15mL 离心管中，加入 10mL10%乙酸乙酯-乙醇溶液，上下颠倒混合45 次， 4000r/min 离心 1min （底部会有部分沉淀） 。 连接好固相萃取装置， 并在固相萃取柱 （3.4.5）上方连接 30mL 注射器针筒，将上述上清液全部倒入 30mL 针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约 1 滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞 2 次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再 向固相萃取柱中加 1mL10mmol/L 三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15） 。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒， 使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后， 离心管中的液体即为待测液。 5.3 测定步骤 5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取适量样品待测液于金标微孔中，抽吸 510 次混合均匀，室温（2025）温育 5min，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育 36min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。 5.3.2 检测卡测定步骤 吸取适量样品待测液于检测卡的样品槽中，室温（2025）温育 510min，直接进行结果判定。 5.4 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验 称取空白试样，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。 5.4.2 加标质控试验 准确称取空白样品适量（精确至 0.01g）置于 50mL 具塞离心管中，加入适量硝基呋喃类代谢物标准工作液，使其浓度为 0.5g/kg，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。 6 结果判定要求 结果的判断也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图 1 和图 2 所示。 6.1 比色法 6.1.1 无效 控制线（C 线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.1.2 阳性结果 检测线（T 线）不显色或检测线（T 线）颜色比控制线（C 线）颜色浅，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。 6.1.3 阴性结果 检测线（T 线）颜色比控制线（C 线）颜色深或者检测线（T 线）颜色与控制线（C 线）颜色相当，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。 图 1 目视判定示意图（比色法） 6.2 消线法 6.2.1 无效 控制线（C 线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.2.2 阳性结果 检测线（T 线）不显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。 6.2.3 阴性结果 检测线（T 线）与控制线（C 线）均显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。 图 2 目视判定示意图（消线法） 6.3 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 7 结论 当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。 8 性能指标 8.1 检测限：AOZ、AMOZ、SEM、AHD 均为 0.5g/kg。 8.2 灵敏度：灵敏度应95% 8.3 特异性：特异性应95%。 8.4 假阴性率：假阴性率应5%。 8.5 假阳性率：假阳性率应5%。 注：性能指标计算方法见附录 A。 9 其他 本方法的测定步骤和结果判读也可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本标准参比方法为 GB/T 21311动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法 。 附录 A 快速检测方法性能指标计算表 表 A.1 性能指标计算方法 样品情况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或 N.1+N.2 显著性差异(2) 2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1 灵敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特异性（p-，%） p-=N22/N2. 假阴性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特异性 相对准确度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果； b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。 N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2 表示所有的第二列；N12 表示第一行，第二列。 C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。 本方法负责起草单位:深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 验证单位：上海市食品药品检验所、山东省食品药品检验研究院。 主要起草人：岳振峰，张恒，黄欣迪，李永吉，薛霞。