DB41∕T 1589-2018 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测EMA-PCR法.pdf

ICS 65.120 B 46 DB41 河南省地方标准 DB41/T 15892018 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测 EMA-PCR 法 2018 - 04 - 17 发布 2018 - 07 - 17 实施河南省质量技术监督局 发 布 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15892018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局提出并归口。 本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、郑州中道生物技术有限公司。 本标准主要起草人：宋志超、狄元冉、方春芳、李灵平、陈小鸽、于辉、刘素梅。 本标准参加起草人：高延玲、方忠意、李金磊、董鹏、宋善道、曾萍、李博、朱雷、张杰、司慧民、张盼盼、范念亭。 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15892018 1 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测 EMA-PCR 法 1 范围 本标准规定了饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的EMA-PCR检测方法。 本标准适用于饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 原理 叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。 4 试剂和材料 4.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合 GB/T 6682 一级水的要求。 4.2 李氏增菌肉汤 LB（LB1，LB2）：见附录 A 的 A.1。 4.3 2Premix Taq缓冲液：内含Taq DNA 聚合酶 1.25 U/25 L，4 mmol Mg2+，dNTP 各 0.4 mmol。 4.4 特异性引物(对) 序列为： a）上游引物：5-GAT GAC GAA ATG GCT TAC AGT GAA T-3； b）下游引物：5-CCA CAC TTG AGA TAT ATG CAG GAG G-3。 4.5 琼脂糖：电泳级。 4.6 Marker 2000。 4.7 单核细胞增生李斯特氏菌 ATCC 19114。 4.8 50TAE 缓冲液：见附录 A 的 A.2。 4.9 6上样缓冲液：见附录 A 的 A.3。 4.10 叠氮溴化乙锭（EMA，0.2 mg/mL）：见附录 A 的 A.4。 4.11 溴化乙锭（10 mg/mL）。 4.12 灭菌离心管：1.5 mL，15 mL。 5 仪器设备 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15892018 2 5.1 PCR 仪。 5.2 天平：感量 0.01 g。 5.3 电热恒温培养箱。 5.4 离心机：转速12 000 r/min。 5.5 浊度仪。 5.6 卤素灯：照度25 000 勒克斯（Lux）。 5.7 核酸电泳仪。 5.8 凝胶成像系统。 5.9 微量移液器：0.5 L10 L，10 L100 L，100 L1000 L，1 mL10 mL。 5.10 涡旋仪。 6 样品采集与制备 按GB/T 14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，整个过程避免人为污染。 7 检验步骤 7.1 增菌 取25 g试样于225 mL李氏增菌肉汤LB1（4.2）中，充分混匀，30 1 培养24 h2 h。取0.1 mL预增菌液转移至10 mL李氏增菌肉汤LB2（4.2）中，30 1 培养24 h2 h。如果试样量不足25 g，试样质量与增菌液的体积比应为19。 7.2 模板的制备 取 1 mL 增菌液至离心管中，12 000 r/min 离心 2 min，弃上清。加入 1 mL 灭菌水悬浮沉淀物， 12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦氏单位（MCF）。取 0.2 mL 菌悬液至离心管中，加入 1.0 L EMA 溶液（4.10）混匀，避光孵育 5 min。将离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光 1 min，然后水浴煮沸 15 min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却 15 min。涡旋混匀裂解物，12 000 r/min 离心 2 min，收集上清液，作为 PCR 扩增的模板 （模板制备可选用等效的商品化试剂盒） 。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加单核细胞增生李斯特氏菌阳性标准菌株的样品作为阳性对照，用不含单核细胞增生李斯特氏菌的样品作为阴性对照。 7.3 PCR 扩增 采用 50 L 反应体系：2Premix Taq 缓冲液（4.3）25 L，模板 5 L，浓度为 20 mol/L 的上、下游引物各 1 L，灭菌水 18 L。 反应程序为：95 预变性 5 min；35 个循环：95 变性 30 s，60 退火 30 s，72 延伸 40 s；72 终延伸 5 min 后 4 保存。 7.4 电泳检测 PCR 扩增产物 称取1.5 g琼脂糖（4.5）加入100 mL 1TAE电泳缓冲液（4.8）中，加热使其充分熔化，冷至65 左右，加入5 L溴化乙锭（4.11），充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，倒入凝胶制成约5 mm厚的胶块。 在电泳槽中加入适量1TAE缓冲液， 使液面没过凝胶2 mm左右。 取PCR扩增产物5 L8 L河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15892018 3 与1 L 6上样缓冲液（4.9）加入到上样孔内，设Marker 2000（4.6）对照。5 V/cm8 V/cm恒压下电泳20 min30 min。 电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果。 8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 如果单核细胞增生李斯特氏菌阳性对照的PCR产物在271 bp处出现条带（参见附录B），同时阴性对照PCR产物于271 bp处未出现条带，则检测结果成立；否则结果无效，应重新进行检测。 8.2 阳性判定 样品的PCR产物电泳后在271 bp处出现条带，则为疑似阳性样品，此时需按GB 4789.30进行确证，最终结果以后者检测结果为准。 8.3 阴性判定 样品的PCR产物电泳后在271 bp处未出现条带，判定25 g样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15892018 4 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 李氏增菌肉汤（LB1，LB2） A.1.1 成分 胰胨 5.0 g 多价胨 5.0 g 酵母膏 5.0 g 氯化钠 20.0 g 磷酸二氢钾 1.4 g 磷酸氢二钠 12.0 g 七叶苷 1.0 g 水 1 000 mL A.1.2 制法 将上述成分加热溶解，调节至pH7.20.2，121 高压灭菌15 min。 A.1.2.1 李氏增菌肉汤LB1每225 mL中加入： 1%萘啶酮酸（用0.05 mol/L氢氧化钠溶液配制）0.5 mL 1%吖啶黄（用无菌水配制） 0.3 mL A.1.2.2 李氏增菌肉汤LB2每200 mL中加入： 1% 萘啶酮酸 0.4 mL 1% 吖啶黄 0.5 mL A.2 50TAE电泳缓冲液 A.2.1 成分 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242.0 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2 H2O） 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 灭菌水 942.9 mL A.2.2 制法 Tris和乙二胺四乙酸二钠溶于800 mL灭菌水， 充分搅拌均匀； 加入冰乙酸， 充分溶解； 用1 mol/L NaOH调节至pH8.3，定容至1 L后，室温保存。使用时稀释50倍即为1TAE电泳缓冲液。 A.3 6上样缓冲液 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15892018 5 A.3.1 成分 溴酚蓝 0.5 g 二甲苯氰FF 0.5 g 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0） 0.06 mL 甘油 360 mL 灭菌水 640 mL A.3.2 制法 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）溶于500 mL灭菌水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，定容至1 000 mL，分装后4 保存。 A.4 叠氮溴化乙锭（EMA） A.4.1 成分 叠氮溴化乙锭 5 mg 灭菌水 25 mL A.4.2 制法 5 mg叠氮溴化乙锭溶于5 mL灭菌水中，定容至25 mL，充分混匀，分装后-20 避光保存。 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15892018 6 B B 附 录 B （资料性附录） 单核细胞增生李斯特氏菌活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR扩增电泳图参见B.1。 说明： MMarker 2000； 1阴性对照； 2阳性对照。 图B.1 单核细胞增生李斯特氏菌活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 _ 河南省地方标准公共服务平台