第八章蛋白质和氨基酸的测定恢复PPT课件.ppt

概概 述述1 蛋白蛋白质的定量的定量测定定2 氨基酸的定量氨基酸的定量测定定3第八章第八章蛋白蛋白质和氨基酸的和氨基酸的测定定1.第一第一节概述概述一、蛋白一、蛋白质的生理功能及在食品中的作用的生理功能及在食品中的作用u蛋白蛋白质是生物界三大基是生物界三大基础物物质之一，是构成之一，是构成生物体生物体细胞胞组织的重要成分；的重要成分；u蛋白蛋白质是食品的主要成分和重要是食品的主要成分和重要营养指养指标。u蛋白蛋白质对食品的色、香、味及食品的色、香、味及组织结构等具构等具有重要意有重要意义；一些蛋白；一些蛋白质具有生物活性功能，具有生物活性功能，是开是开发功能性食品原料之一。功能性食品原料之一。2.二、食品中蛋白二、食品中蛋白质含量及含量及测定意定意义 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。3.第一第一节概述概述三、蛋白三、蛋白质的性的性质u蛋白蛋白质质是复是复杂杂的含氮有机的含氮有机化合化合物，分子量很大，大物，分子量很大，大部分高达数万部分高达数万 数百万数百万。u蛋白蛋白质氨基酸通氨基酸通过酰胺胺键结合的高分子化合物；合的高分子化合物；u所含的主要化学元素所含的主要化学元素为C、H、O、N。微量元素微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。区区别其他有其他有机物的机物的标志志4.u构成蛋白构成蛋白质的的-氨基酸共有氨基酸共有20种。种。u必需氨基酸（必需氨基酸（EAA）为了了维持机体的正持机体的正常生常生长和健康，但人体不能合成或合成量不和健康，但人体不能合成或合成量不能能满足需要，必需从食物中足需要，必需从食物中摄取的氨基酸。取的氨基酸。u包括：包括：赖氨酸、氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸氨酸、苯丙氨酸。uFAO/WHO推荐的氨基酸理想模式推荐的氨基酸理想模式 Lys:Val:Met:Try:Leu:Ile:Thr:Phe =5.5:5.0:3.5:1.0:7.0:4.0:4.0:6.0 蛋白蛋白蛋白蛋白质质胨肽氨基酸氨基酸5.v不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质含氮量不同。蛋白质的量与氮含量的关系用蛋白质系数表示。v蛋白质系数每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般蛋白质含氮量为16%，即MN/MPr=16%MPr=MN/16%=6.25 MN 蛋白蛋白质换算算系数系数 F6.u根据被根据被测食品种食品种类选择不同的不同的换算系数算系数 7.v与蛋白与蛋白质和蛋白和蛋白质检测有关的两个有关的两个重大食品安全事件重大食品安全事件8.阜阳奶粉事件阜阳奶粉事件 20042004年年5 5月月，安安徽徽省省阜阜阳阳市市对当当地地20032003年年3 3月月1 1日日以以后后出出生生、以以奶奶粉粉喂喂养养为主主的的婴儿儿进行行的的营养养状状况况普普查和和免免费体体检显示示，因因食食用用劣劣质奶奶粉粉造造成成营养养不不良良的的婴儿儿229229人人，其其中中轻、中中度度营养养不不良良的的189189人人,因因食食用用劣劣质奶奶粉粉造造成成营养养不良而死亡的不良而死亡的婴儿共儿共计1212人。人。9.10.国国务院院调查组通通过卫生生学学调查证实，不不法法分分子子用用淀淀粉粉、蔗蔗糖糖等等价价格格低低廉廉的的食食品品原原料料全全部部或或部部分分替替代代乳乳粉粉，再再用用奶奶香香精精等等添添加加剂进行行调香香调味味，制制造造出出劣劣质奶奶粉粉，婴儿儿生生长发育育所所必必需需的的蛋蛋白白质、脂脂肪肪以以及及维生生素素和和矿物物质含含量量远低低于于国国家家相相关关标准准。11.三鹿奶粉事件12.三聚三聚氰胺是一种有机含氮胺是一种有机含氮杂环化合物化合物（C C3 3H H6 6N N6 6），是一种重要的化工原料。三聚），是一种重要的化工原料。三聚氰胺的含胺的含氮量很高（氮量很高（66%66%），按），按GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003，食品中，食品中蛋白蛋白质的的测定（定（凯氏定氮法），乳制品的蛋白氮氏定氮法），乳制品的蛋白氮换算系数算系数为6.386.38，即，即1 1的蛋白氮含量，折算蛋白的蛋白氮含量，折算蛋白质含含量量为6.386.38，这样加入加入3 3三聚三聚氰胺就蛋白含量胺就蛋白含量“达达标”了。了。13.蛋白蛋白质测定方法定方法测定蛋白质的方法 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定基团（氨基酸残基、酸性和碱性基团 以及芳香基团等）测定蛋白质含量。14.凯氏定氏定氮法氮法 双双缩脲法法 方法方法紫外吸紫外吸收法收法福林福林-酚法酚法 第二第二节 蛋白蛋白质的定量的定量测定定15.（一）（一）凯氏定氮法氏定氮法l凯氏定氮法：氏定氮法：总氮量氮量蛋白蛋白质换算系数算系数l测定定结果：粗蛋白（包含核酸、生物碱、含果：粗蛋白（包含核酸、生物碱、含氮色素等非蛋白氮色素等非蛋白质氮化合物）氮化合物）l适用范适用范围：各：各类食品中蛋白食品中蛋白质含量含量测定定l长期改期改进：常量法、半微量法和微量法等：常量法、半微量法和微量法等 16.1、常量、常量凯氏定氮法氏定氮法（1）原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的N转化为NH3，与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使NH3游离蒸出，用硼酸吸收后再以盐酸或硫酸标准溶液滴定。根据酸的消耗量，再乘以蛋白质换算系数，可计算出蛋白质的含量。17.v反应分四个阶段：消化、蒸馏、吸收、滴定（1）消化）消化：2NH2(CH2)2COOH 13H2SO4 (NH4)2SO4 6CO2 12SO2 16H2O 浓硫酸的作用：硫酸的作用：脱水作用使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。氧化作用将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：2H2SO4+CCO2+2SO2+2H2O 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。18.v加入硫酸加入硫酸钾的作用是：的作用是：提高溶液沸点提高溶液沸点而加而加快快有机物的有机物的分解分解（3383380 0C C 4004000 0C C）K K2 2SOSO4 4+H+H2 2SOSO4 4=2KHSO=2KHSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4=K=K2 2SOSO4 4+H+H2 2O+SOO+SO3 3v加入硫酸加入硫酸铜的作用的作用 催化作用：催化作用：加速有机物的氧化分解加速有机物的氧化分解 C C 2CuSO4 Cu2CuSO4 Cu2 2SOSO4 4 SOSO2 2 COCO2 2 Cu Cu2 2SOSO4 4 2H2H2 2SOSO4 4 2CuSO 2CuSO4 4 2H2H2 2O O SOSO2 2消化完全指示：消化完全指示：蓝绿色；色；19.消化炉消化炉20.(2）蒸蒸馏 在消化完全的在消化完全的样品溶液中加入品溶液中加入浓氢氧化氧化钠使呈碱性，加使呈碱性，加热蒸蒸馏，即可，即可释放出氨气放出氨气 (NH(NH4 4)2 2 SOSO4 4+2NaOH 2NH+2NaOH 2NH3 3+Na+Na2 2SOSO4 4+2H+2H2 2O O 蒸蒸馏时碱性反碱性反应完全指示完全指示：变深深蓝色或色或产生黑色沉淀生黑色沉淀(3)吸收吸收 用硼酸溶液，并加入混合指示用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（，硼酸呈微弱酸性（K Ka1a1=5.8=5.8 X 10X 10-10-10），与氨形成），与氨形成强碱弱酸碱弱酸盐，酒，酒红色色蓝绿色色 2NH2NH2NH2NH3 3 3 3+4H4H4H4H3 3 3 3BOBOBOBO3 3 3 3=(NH=(NH=(NH=(NH4 4 4 4)2 2 2 2B B B B4 4 4 4O O O O7 7 7 7+5H+5H+5H+5H2 2 2 2O O O O21.(4)滴定滴定 待吸收完全后，再用待吸收完全后，再用盐酸酸标准溶液滴定准溶液滴定,蓝绿色色灰灰红色色 (NH (NH (NH (NH4 4 4 4)2 2 2 2B B B B4 4 4 4O O O O7 7 7 7+2HCl+5H+2HCl+5H+2HCl+5H+2HCl+5H2 2 2 2O=2NHO=2NHO=2NHO=2NH4 4 4 4Cl+4HCl+4HCl+4HCl+4H3 3 3 3BOBOBOBO3 3 3 322.2 2、微量、微量凯氏定氮法氏定氮法（1 1）原理及适用范）原理及适用范围同前同前（2 2）与常量法不同点：）与常量法不同点：加入硼酸量有加入硼酸量有50 ml 10 ml,50 ml 10 ml,滴定用滴定用盐酸酸浓度由度由0.1 mol/L 0.01 mol/L,0.1 mol/L 0.01 mol/L,可用微量滴定管。可用微量滴定管。23.凯氏自氏自动定氮法定氮法 原原理理与与上上面面一一样，仪器器，采采用用凯氏氏自自动定定氮氮仪：其其装装置置内内具具有有自自动加加碱碱蒸蒸馏装装置置，自自动吸吸收收和和滴滴定定装装置置以以及及自自动数数字字显示示装装置置，消消化化装装置置：由由优质玻玻璃璃制制成成的的凯氏氏消消化化瓶瓶以以及及红外外线装装置置的消化炉的消化炉。24.（二）双（二）双缩脲法法v 双双缩脲的性的性质：当：当脲被小心地加被小心地加热至至 150150160160时，可由两个分子，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫溶液作用生成紫红色的色的配合物，此反配合物，此反应称称为双双缩脲反反应。NH2CONH2+NH2CONH2NH2CONHCONH2 +NH325.（二）双（二）双缩脲法法1、原理 蛋白质分子中的肽键（CONH）与双缩脲结构相似，与碱性硫酸铜能形成紫红色络合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在560nm处比色定量。2、应用范围及特点v操作简单，灵敏度较低，生化领域中常用。v食品领域：可用于粮豆类（大米、油料、豆类等作物种子）和肉类等样品中蛋白质含量的测定。26.3、操作方法、操作方法（1）标准曲准曲线的的绘制：取一定量的制：取一定量的标准蛋白准蛋白质样品品（如牛血清蛋白，先用（如牛血清蛋白，先用凯氏定氮法氏定氮法测出蛋白出蛋白质含量），含量），标准曲准曲线：吸光度：吸光度-蛋白蛋白质含量。含量。（2）样品品测定：同法定：同法测定待定待测样品的吸光度，从品的吸光度，从标准曲准曲线查出其出其对应的蛋白的蛋白质浓度度m。4、计算算27.（三）紫外（三）紫外线吸收法（吸收法（A280nm光吸收法）光吸收法）1、原理原理 蛋白蛋白质分子中存在着含有分子中存在着含有共共轭双双键的酪氨酸和的酪氨酸和色氨酸，因此，蛋白色氨酸，因此，蛋白质具有吸收紫外具有吸收紫外线的性的性质，吸，吸收峰在收峰在280nm处。在此波。在此波长范范围，蛋白，蛋白质溶液的光溶液的光吸收吸收值（吸光度）与其（吸光度）与其浓度成正比。度成正比。2、测定步定步骤绘制制标准曲准曲线样品品测定定查出出Pr浓度度28.THANK YOUSUCCESS2024/3/9 周六周六29.3、适用范、适用范围及特点及特点适用于蛋白适用于蛋白质浓度在度在0-1g/L范范围样品的品的测定。定。操作操作简便、快速，低便、快速，低浓度度盐类不会不会产生干生干扰。待待测样品所含的氨基酸与品所含的氨基酸与标准蛋白准蛋白质中酪中酪氨酸和色氨酸含量差异大、或含有氨酸和色氨酸含量差异大、或含有嘌呤或呤或嘧啶等物等物质时，测定定结果有一定的果有一定的误差。差。30.染料染料结合法合法：原理：原理：在特定的条件下，蛋白在特定的条件下，蛋白质可与某可与某些染料定量的反些染料定量的反应生成沉淀，用分光光生成沉淀，用分光光度度计测定沉淀反定沉淀反应完全后剩余的染料量完全后剩余的染料量可可计算出反算出反应消耗的染料量，消耗的染料量，进而求得而求得样品中蛋白品中蛋白质的含量。的含量。适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮料等食品。料等食品。31.水水杨酸比色法酸比色法原理：原理：样品中的蛋白品中的蛋白质经硫酸消化而硫酸消化而转化成化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水条件下可与水杨酸和次酸和次氯酸酸钠作用生成作用生成兰色化合物，在色化合物，在660nm660nm处比色比色测定，求出定，求出样品的含氮量，品的含氮量，进而而计算出蛋白算出蛋白质的含的含量。量。32.（四）其他常用方法（四）其他常用方法v福林福林-酚比色法酚比色法；v考考马斯亮斯亮蓝染料比色法；染料比色法；v红外光外光谱法；法；v比比浊法；法；v33.我的是毛我的是毛线是棉是棉线？是毛是毛线？蛋白蛋白质灼灼烧时，会有，会有烧焦羽毛的气味。焦羽毛的气味。感知生活感知生活你你对蛋白蛋白质知多少？知多少？1、你知道怎么、你知道怎么鉴别吗?34.感知生活感知生活你你对蛋白蛋白质知多少？知多少？2、你知道如何、你知道如何鉴定定豆腐豆腐富含蛋白富含蛋白质吗?浓硝酸硝酸呈黄色呈黄色35.第三第三节氨基酸的定量氨基酸的定量测定定（一）甲（一）甲醛滴定法滴定法1、双指示、双指示剂甲甲醛滴定法滴定法(1)原理原理氨基酸具有酸性的-COOH和碱性的-NH2。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失，使-COOH显示出酸性，用碱标准溶液来滴定-COOH，并用间接的方法测定氨基酸的总量。36.方法特点及方法特点及应用用 此法简单易行、快速方便。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高；酪氨酸含有羟基，滴定时会消耗碱液使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果高。特别适合浅色样品的测定37.（2）操作方法操作方法移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份。中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其他游离酸的含量）：1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；记录消耗的碱液ml数，V1。滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）：另1份加入3滴百里酚酞指示剂+中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录消耗的碱液ml数，V2。38.（3）结果果计算算X=(V2-V1)c0.014/m100X样品中氨基品中氨基态氮的含量，氮的含量，%（g/100ml）c 氢氧化氧化钠标准溶液的准溶液的浓度，度，mol/L；V1用中性用中性红作指示作指示剂滴定滴定时消耗消耗氢氧化氧化钠标准准 溶液的体溶液的体积，mL；V2用百里酚用百里酚酞作指示作指示剂滴定滴定时消耗消耗氢氧化氧化钠标 准溶液的体准溶液的体积，mL；m测定用定用样品溶液的品溶液的质量（或体量（或体积），），g(ml)0.014氮的毫摩氮的毫摩尔质量，量，g/m mol 39.说明及注意事明及注意事项1、此法适用于测定食品中游离的氨基酸2、固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃 取，50水浴中萃取0.5h即可。液体样品可直接进行测定。3、若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。4、与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH 时的pH为8.59.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。40.2、电位滴定法位滴定法(1)原理原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定以固定氨基的碱性，使氨基的碱性，使羧基基显示出酸性，用示出酸性，用氢氧化氧化钠标准溶液滴定，依据酸度准溶液滴定，依据酸度计指示的指示的pH值判判断和控制滴定断和控制滴定终点。点。-COOH被完全中和被完全中和时，pH值约为8.5-9.5。41.（2）操作方法）操作方法 取取样m定容定容100ml取取20ml，加水，加水60ml 用碱滴定至用碱滴定至pH8.2加入甲加入甲醛10.0ml 用碱用碱滴定至滴定至pH9.2记录碱消耗体碱消耗体积V1 空白空白试验：取水：取水80ml 碱消耗体碱消耗体积V0（3）结果果计算算42.磁力磁力搅拌器拌器43.v酸度酸度计的使用操作的使用操作规程程v调节开关开关v用用缓冲溶液校正冲溶液校正pH计44.v清洗清洗电极极v吸干吸干电极上面的水极上面的水v把把电极插入被极插入被测溶液中溶液中45.v测测定定 v清洗并擦干清洗并擦干电电极极46.（4）说明明v 甲醛的作用：固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性。v 若样品中含有铵盐，测定结果偏高。v 浑浊和色深样液不经处理可直接测定。v结果要求精密度10%，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。47.（二）（二）茚三三酮比色法比色法v原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，在570nm处测吸光度进行定量。v操作方法 绘制标准曲线样品测定查出氨基酸质量样品溶液需澄清，通常采用活性炭脱色处理。48.（三）其他常用方法（三）其他常用方法v 邻苯二甲苯二甲醛法法v 三硝基苯磺酸法三硝基苯磺酸法v（四）氨基酸的分离和（四）氨基酸的分离和测定定v 1、薄、薄层色色谱法法v 2、氨基酸自、氨基酸自动分析分析仪法法v 3、气相色、气相色谱法法v 4、HPLC49.氨基酸自氨基酸自动分析分析仪分析分析v食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。50.v蛋白蛋白质氮和非蛋白氮和非蛋白质氮的氮的测定定样品溶液品溶液+沉淀沉淀剂（Cu2+、Hg2+、Pb2+等）等）过滤或离心或离心沉淀：蛋白沉淀：蛋白质氮氮滤液：非蛋白液：非蛋白质氮氮 分分别用用凯氏定氮法定量氏定氮法定量51.第四第四节挥发性性盐基氮的基氮的测定定v挥发性性盐基氮基氮指指动物性食品由于物性食品由于酶和和细菌的作用，在腐菌的作用，在腐败过程中，因蛋白程中，因蛋白质分分解而解而产生的氨及生的氨及铵类等碱性含氮物等碱性含氮物质。v挥发性性盐基氮基氮评价肉及肉制品、水价肉及肉制品、水产品等品等新新鲜度度的主要的主要卫生指生指标。52.1、原理、原理挥发性性盐基氮在基氮在测定定时遇到弱碱遇到弱碱氧化氧化镁即被游离而蒸即被游离而蒸馏出来，出来，馏出的氨被硼酸吸收出的氨被硼酸吸收后生成硼酸后生成硼酸铵，然后用，然后用盐酸酸标准溶液滴定。准溶液滴定。根据根据盐酸酸标准溶液的消耗量准溶液的消耗量计算出算出样品中品中挥发性性盐基氮的含量。基氮的含量。53.2、操作方法、操作方法v挥发性性盐基氮的收集提取：将基氮的收集提取：将动物性的物性的样品除去脂肪、骨品除去脂肪、骨头、腱后切碎混匀，称取一、腱后切碎混匀，称取一定量（定量（m）置于三角瓶中，加入）置于三角瓶中，加入100ml水，振水，振摇，浸泡，浸泡30min，过滤，滤液液备用。用。v蒸蒸馏和吸收：取和吸收：取5.0ml滤液蒸液蒸馏，用硼酸吸，用硼酸吸收液吸收收液吸收挥发出来的氨。出来的氨。v滴定：用滴定：用盐酸溶液滴定，同酸溶液滴定，同时做空白做空白试验54.3、计算：算：X样品中品中挥发性性盐基氮的含量，基氮的含量，mg/100gc 盐酸酸标准溶液的准溶液的浓度，度，mol/L；V1样品溶液消耗品溶液消耗盐酸酸标准溶液的体准溶液的体积，mL；V0空白消耗空白消耗盐酸酸标准溶液的体准溶液的体积，mL；m样品的品的质量，量，g 55.思考思考题v1、蛋白、蛋白质换算系数如何算系数如何计算？算？v2、凯氏定氮法的原理、主要操作步氏定氮法的原理、主要操作步骤和注意和注意事事项。v3、甲、甲醛滴定法滴定法测氨基酸的原理是什么？氨基酸的原理是什么？v4、什么是、什么是挥发性性盐基氮？基氮？测定有什么意定有什么意义？56.THANK YOUSUCCESS2024/3/9 周六周六57.