RTPCR常见问题分析.ppt

RT-PCR常见问题分析一一、RT-PCR反应原理与方法反应原理与方法 RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。1 RT-PCR 1 RT-PCR反应步骤：反应步骤：第一，RNA提纯；第二，RT逆转录；第三，PCR聚合酶反应2 RT-PCR2 RT-PCR方法方法2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内完成，有助于减少污染，灵敏度更高2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。2.3 一步法与两步法区别：一步法RTPCR反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了PCR反应的错配率。而在两步法中，两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，同时可由一次反转录样品获得多个遗传信息，并且由于在第一步中将RNA反转录为cDNA，从而更易于保存。另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。3 3 提高提高提高提高RT-PCRRT-PCR反应的灵敏度与特异性：反应的灵敏度与特异性：反应的灵敏度与特异性：反应的灵敏度与特异性：3.1 3.1 首先首先应应确定模板确定模板RNARNA完整性好，无完整性好，无DNADNA污污染。染。3.2 RNA3.2 RNA模板中不模板中不应应含有含有扩扩增反增反应应抑制抑制剂剂。3.3 3.3 为为了防止模板降解，可以在反了防止模板降解，可以在反应应体系中加入体系中加入RNaseRNase抑制抑制剂剂RNasinRNasin。3.4 3.4 使用适量的模板使用适量的模板RNARNA，模板量太多会降低特异性，模板量太多会降低特异性，太少会太少会导导致致扩扩增不出条增不出条带带或条或条带带太弱。太弱。3.5 3.5 如果由于模板有二如果由于模板有二级结级结构，构，导导致致扩扩增效果不好，增效果不好，可提高逆可提高逆转录转录反反应应温度。温度。3.6 3.6 设计设计引物引物时时，避免在引物，避免在引物3 3 端含有互端含有互补补序列，避序列，避免可以形成内部免可以形成内部发发卡卡结结构的序列。构的序列。RT-PCR常见问题常见问题 问题一：问题一：RT-PCRRT-PCR仅有少量或没有产物仅有少量或没有产物1.RNA被降解n n分离无分离无污污染或高染或高质质量的量的RNARNA；提取；提取RNARNA材料要尽材料要尽量新量新鲜鲜，防止防止RNARNA降解。降解。n nRNARNA提取后，提取后，应储应储存在存在100100甲甲酰酰胺中，如果使胺中，如果使用用RNaseRNase抑制抑制剂剂，加，加热时热时4545；pHpH8.08.0，否，否则则抑制抑制剂剂会会释释放所有放所有结结合的合的RNaseRNase。而且，在。而且，在 0.8mM 0.8mM DTTDTT时时加入加入RNaseRNase抑制抑制剂剂，一定要存在一定要存在DTTDTT。物对策对策2.RNA中包含逆转录抑制剂n n过过乙醇沉淀乙醇沉淀RNARNA除去抑制除去抑制剂剂。用。用70%(v/v)70%(v/v)乙醇乙醇对对RNARNA沉淀沉淀进进行清洗。可以行清洗。可以加入糖元加入糖元(0.25g(0.25g到到0.4g/l)0.4g/l)以帮助小量以帮助小量样样品品RNARNA的恢复的恢复;逆逆转录转录抑制抑制剂剂包括：包括：SDSSDS，EDTAEDTA，甘油，甘油，焦磷酸焦磷酸钠钠，亚亚精胺，甲精胺，甲酰酰胺和胍胺和胍盐盐;将将对对照照RNARNA同同样样品混合，同品混合，同对对照照RNARNA反反应应比比较产较产量以量以检验检验抑制抑制剂剂;对策对策3.用于合成cDNA第一链合成的引物的退火不充分n n1.1.确定退火温度适合确定退火温度适合实验实验中所用的引物。中所用的引物。对对于随机于随机六聚体，建六聚体，建议议在反在反应应温度温度保温之前先在保温之前先在2525保温保温1010分分钟钟。n n2.2.对对于基因特异性引物于基因特异性引物（GSPGSP），可以），可以试试以下其以下其他他GSPGSP，或，或换换用用oligo(dT)oligo(dT)或随即六聚体确定或随即六聚体确定GSPGSP是是反反义义序列。序列。对策对策4.起始RNA量 不够5.多糖同RNA共沉淀n n增加增加RNARNA量量;对于对于50ng6060时使用时使用oligo(dT)oligo(dT)引引物，选择一个在反应温度物，选择一个在反应温度可以退火的可以退火的GSP;GSP;对于对于1kb1kb的的RT-RT-PCRPCR产物，保持产物，保持反应温度反应温度6565。不要。不要在高于在高于3737时使用时使用M-M-MLV;MLV;如果不需要全长如果不需要全长cDNAcDNA，在第一链反应，在第一链反应中使用随机引物中使用随机引物;对策对策7.引物或模板对残余的RNA模板敏感8.靶序列在分析的组织中不表达9.PCR没有起作用n n在在PCRPCR前用前用RNaseHRNaseH处处理。理。n n尝试其他靶序列或组尝试其他靶序列或组织织n n对两步法对两步法RT-PCRRT-PCR，不，不要在要在PCRPCR步骤中使用超步骤中使用超过过1/51/5的逆转录反应产的逆转录反应产物物;对策对策对策对策对策对策10.PCR引物设 计较差n n避免在引物避免在引物3 3端含有互端含有互补序列。避免可以形补序列。避免可以形成内部发卡结构的序成内部发卡结构的序列。设计列。设计TmTm类似的引类似的引物。最佳引物浓度介物。最佳引物浓度介于于0.1M0.1M到到0.5M0.5M之间。之间。为了精确确定引物浓为了精确确定引物浓度，在度，在260nm260nm测量光测量光密度，然后使用光吸密度，然后使用光吸收值和消光系数计算收值和消光系数计算浓度。浓度。对策对策11.富含GC的 模板n n于于GCGC含量含量50%50%的模的模板，使用板，使用PCRx PCRx Enhancer SolutionEnhancer Solution。对策对策12.镁离子浓度 太低n n从从1mM1mM到到3mM3mM，间隔，间隔0.5mM0.5mM进行一系列反进行一系列反应，确定对于每个模应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对离子浓度。注意：对实时定量实时定量PCRPCR，使用，使用3mM3mM到到5mM5mM的镁离子的镁离子浓度。浓度。对策对策13.退火温度 太高n n使用公式估算使用公式估算TmTm，把，把退火温度设定为低于退火温度设定为低于Tm 5Tm 5。因为这些公。因为这些公式只是估算式只是估算TmTm值，所值，所有真正的退火温度实有真正的退火温度实际会高些或低些。际会高些或低些。对策对策问题二：产生非特异性条带产生非特异性条带1.引物和模版 的非特异性 退火 1.1.避免引物避免引物3 3 端含有端含有2 2个个到到3 3个个dGdG或或dCdC 2.2.在第一链合成中使用在第一链合成中使用基因特异性引物，而基因特异性引物，而不是随即引物或不是随即引物或oligo(dT)oligo(dT)。3.3.在开始几个循环使用在开始几个循环使用较高的退火温度，然较高的退火温度，然后使用较低的退火温后使用较低的退火温度。度。4.4.使用热启动使用热启动Taq DNATaq DNA酶进行酶进行PCRPCR，提高反，提高反应的特异性应的特异性。对策对策2.基因特异性引物设计较差3.RNA中有基因组DNA的污染 n n遵循用于扩增引物设遵循用于扩增引物设计的同样原则计的同样原则n n1.1.使用扩增级使用扩增级DNase 1DNase 1处理处理RNARNA。n n2.2.设置没有逆转录的对设置没有逆转录的对照反应检测照反应检测DNADNA污染污染对策对策对策对策4.形成引物二聚体5.镁离子浓度太高6.沾染外源DNAn n设计在设计在3 3 端没有互补序端没有互补序列的引物。列的引物。n n对于每一个模板和引对于每一个模板和引物组化优化镁离子浓物组化优化镁离子浓度。度。n n使用抗气雾剂和使用抗气雾剂和UDGUDG酶。酶。对策对策对策对策对策对策问题三：产生弥散条带1.cDNA第一链产物的含第一链产物的含量过高量过高2.DNase降解降解DNA产生的产生的寡核苷酸的非特异性寡核苷酸的非特异性扩增扩增3.PCR反应中引物过多反应中引物过多4.循环数过多循环数过多5.退火温度过低退火温度过低1.常规常规PCR步骤中减少模板步骤中减少模板cDNA的量的量2.提取高质量提取高质量RNA，防止被，防止被DNA污染污染3.减少引物的用量减少引物的用量4.优化优化PCR反应条件，减少反应条件，减少PCR的循环次数的循环次数5.提高退火温度，防止非特提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸异性的起始及延伸原因对策问题四：灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物?n n1 1、初始模板初始模板RNARNA不充分：增加模板不充分：增加模板RNARNA的浓度。的浓度。n n2 2、RNA RNA被损害和降解：必要的话更换被损害和降解：必要的话更换RNARNA。n n3 3、RNAse RNAse污染：维持无菌条件污染：维持无菌条件;加入加入RNaseRNase抑制抑制剂。剂。n n4 4、无效的无效的cDNAcDNA：通过增加：通过增加70%70%乙醇清洗的次数乙醇清洗的次数来去除制备来去除制备RNARNA过程中的抑制剂。过程中的抑制剂。n n5 5、无效的无效的PCRPCR扩增：注意：反转录的抑制剂包括扩增：注意：反转录的抑制剂包括SDSSDS、EDTAEDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。调整调整cDNAcDNA合成温度或引物设计。合成温度或引物设计。问题五：信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物?1 1、反应中加的样品太多：降低模板的浓度。反应中加的样品太多：降低模板的浓度。2 2、模板或模板或PCRPCR残余污染：隔离污染来源，更换试残余污染：隔离污染来源，更换试剂，使用专用的精致移液器。在无剂，使用专用的精致移液器。在无DNADNA区域准备区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。反应，使用抗气溶胶的吸头。问题六：电泳后出现意外的条带电泳后出现意外的条带 RNA?1.被基因组被基因组DNA污染污染2.用于第一链合成的寡聚用于第一链合成的寡聚dT或随机或随机引物引物 3.PCR的低特异性的低特异性 1.用用DNase I预处理预处理RNA.2.使用基因特异性引物使用基因特异性引物.3.优化优化PCR条件条件.原因对策问题七:产生大分子量的弥散条带产生大分子量的弥散条带 n n大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的异性的起始及延伸产生的。对于长片段的对于长片段的PCRPCR，建，建议将反应体系中议将反应体系中cDNAcDNA的浓度稀释至的浓度稀释至1:101:10（或（或1:100-1:2001:100-1:200）问题八：在无反转录酶的情况下，在无反转录酶的情况下，对照对照RNA获得扩增结果获得扩增结果n n通常是由于对照通常是由于对照RNARNA中含有痕量中含有痕量DNADNA而导致的。而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的由于进行体外转录时不可能将所有的DNADNA模板消模板消除。建议可将第一链除。建议可将第一链cDNAcDNA稀释稀释1:101:10、1:1001:100、1:10001:1000倍以消除倍以消除DNADNA污染所造成的影响。污染所造成的影响。n n有可能是引物二聚体的条带有可能是引物二聚体的条带问题九：扩增产物滞留在加样孔扩增产物滞留在加样孔中中n n有可能是由于模板量过高而导致有可能是由于模板量过高而导致PCRPCR结果产生了结果产生了高分子量的高分子量的DNADNA胶状物。建议将第一链结果至少胶状物。建议将第一链结果至少稀释稀释100100倍再进行二次扩增倍再进行二次扩增。n n另外，在二次另外，在二次PCRPCR时使用的退火温度如果比引物时使用的退火温度如果比引物的的TmTm值低值低5 5，可以将退火温度适当增高或进行，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性热启动以提高特异性