氨基酸的分离鉴定(纸层析法).doc

氨基酸的分离（纸层析法）
一、实验原理
1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。
操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等
分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等
2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
分配系数=溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度
物质被分离后在滤纸上的移动速率用Rf值表示：
Rf=原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离
只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性依据。
氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
二、实验器材
标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。
三、实验试剂
1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2
2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5
四、实验操作
1、点样
量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。
戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。
用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。
2、层析与显色
将滤纸卷成圆筒形，用钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。
将滤纸垂直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析缸盖（点样点的一端朝下，展层剂液面需低于点样线1cm左右）。
待溶液前沿线距滤纸末端1~2cm（展层长度10cm，约2h）后，取出滤纸（需带上手套），用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹干（通风橱中进行），即可看见层析斑点。
3、结果处理
用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到层析前沿的距离，计算各种标准氨基酸的Rf值，并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。
五、结果与讨论
1、层析图谱

2、数据处理

Gly
Phe
Pro
His
样品Y09
中心到原点距离/cm
0.4
3.75
1.65
1.60
0.45
01.20
3.71
前沿/cm
10.3
9.75
9.55
9.50
9.85
Rf/cm
0.0388
0.385
0.173
0.168
0.0457
0.122
0.377
参考Rf值
0.30
0.73
0.48
0.11
——
——
——
3、将样品的层析图谱与标准氨基酸层析图谱对比得出，样品中含有的氨基酸是：苯丙氨酸、脯氨酸和组氨酸。样品层析图谱中最下方的斑点难以判断是组氨酸还是甘氨酸，结合Rf值和斑点的形状与颜色，初步判断是组氨酸。
4、本次层析的结果不好，各标准氨基酸的Rf值与参考值相差较大（偏小），且样品的层析方向不垂直，斑点的朝向也不一致。如果仅仅是层析时纸筒没有放平，也不可能出现斑点朝向不一致的现象。
将有层析结果的滤纸放置两天后，变成了以下情形：

图中显示，层析溶剂出现了明显的分层（水相和有机相），可能是因为层析缸内壁有较多水，破坏了溶剂的比例。由于正丁醇与水的互溶有一定限度，过多的水与有机相无法互溶。到层析后期，有机相大部分到滤纸上时，水相开始接触滤纸并向上移动。由于水相的存在切断了有机相与下方溶液的通路，有机相无法再向上移动，而水相不断在扩大其“势力范围”。因为有机相无法继续上移，有机相中溶解的氨基酸也无法随溶液移动，因此Rf值也测不准确。
由图可以看出，层析斑点的形状与水相和有机相的分界线轮廓匹配，从而解释了为何斑点的朝向不一致。因为到层析后期，层析速度慢的氨基酸只能停留在水相与有机相的交界处。
5、实验总结与改进：
1）在做纸层析时，应严格保证展层剂各组分的比例，因为Rf值与展层剂的组成密切相关，且比例不对时还可能引起展层剂分层，严重影响实验结果。
2）将纸筒放入层析缸时一定要小心放平，否则层析方向会偏，后续测量层析点到原点的距离时容易产生误差。
3）实验时一定要避免用手直接接触滤纸，也不要将滤纸随意放置，否则容易沾上蛋白质或氨基酸，给实验带来干扰。

参考文献：
1.杨 丽，尤 丽，叶金秀，袁 燕，《纸层析分离鉴定氨基酸实验的改进》，云南民族大学学报，2011 年 5 月，第 20 卷 第 3 期。