免疫学作业-食品的免疫学检测方法.doc

食品的免疫学检测方法免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法,其基本原理是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分，特别是三大免疫技术荧光免疫技术、酶免疫技术和放射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用。利用免疫学检测技术可检测细菌、病毒、真菌、各种毒素、寄生虫等，还可用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测，其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强，特别是单克隆抗体的发展，使得免疫检测方法特异性更强，结果更准确。一、 免疫荧光技术免疫荧光技术是一种将免疫反应的特异性与荧光标记分子的可见性结合起来的方法。在一定条件下，用化学方法将荧光物质 （荧光素）与抗体结合，但不影响抗体与抗原结合的活性，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下观察抗原的存在与部位，可定位，亦可用荧光计定量。但荧光标记信号较弱，因而检测灵敏度不是很高。免疫荧光分析(Immuno Fluorescence Assay,IFA)始创于20世纪40年代初，1942年Cons等首次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗体，但此种荧光素标记物的性能较差，未能推广应用。20世纪50年代，Riggs等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。Mashall等对荧光抗体的标记方法又进行了改进，从而使得免疫荧光技术逐渐推广应用。免疫荧光技术在实际应用上主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。免疫荧光直接法可清楚地观察抗原并用于定位标记观察。间接法是在检测样品上滴加已知的细菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标记的第二抗体。1底物标记荧光测定法底物标记荧光测定法(SLFIA)使用一种酶的底物标记待测物，底物本身无荧光，在受到相应酶的催化时能转变为荧光物，当标记底物与抗体结合产生的空间位阻阻碍了酶与标记底物间的接触，样品中的待测物通过竞争作用使游离的酶标结合物或荧光强度增加。2荧光偏振免疫测定法使用偏振光作为激发光时，视分子的运动状态，发射的荧光可能是振动方向随机化的普通荧光，或是只在某一平面振动的偏振荧光(ploarized fluorescence)。在反应液中，游离的标记物分子体积小，在布朗运动中转动速度快，受偏振光照射后产生的荧光偏振方向被分散，不能产生偏振光，只发射普通荧光；与抗体结合的标记物分子体积增大，布朗运动速度减慢，甚至不能转动而形成定向排列，所以受偏振光激发后能产生偏振荧光，样品中的待测物的量越大，偏振荧光的强度越高。1.荧光淬灭免疫测定法荧光淬灭免疫测定法(Fluoresecent QuenchingImmunoassay)的原理是当荧光标记物与抗体结合后发生荧光淬灭。荧光猝灭的机制尚不清楚，荧光淬灭可能与标记物与抗体结合后导致电子振动状态的改变有关。3荧光增强免疫测定法荧光增强免疫测定法(Fluoresecent EnhancementImmunoassay)的原理与荧光淬灭增强免疫测定法相似，不同的是标记物与抗体结合后荧光强度增强。二、酶免疫检测技术酶免疫检测技术是20世纪60年代在荧光和组织化学的基础上发展起来的一种新技术，最初用酶代表荧光素标记抗体作为生物组织中抗原的鉴定和定位。随后发展为用于鉴定免疫扩散及免疫电泳板上的沉淀线。到1971年，Engrall等用碱性磷酸酶标记抗原或抗体，建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)，这一技术因其高度的准确性、特异性、应用范围广、检测速度快以及费用低等优点，是目前食品检测中令人瞩目的有发展前途的一种新技术。酶免疫技术发展迅猛，种类繁多，酶免疫技术分为酶免疫组化技术和酶免疫测定技术，酶免疫测定技术又分为均相免疫测定技术和异相免疫测定技术，异相免疫测定技术又分为固相免疫测定技术和液相免疫测定技术。固相免疫测定法的代表技术是酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。它食品安全检验中最为广泛应用的方法之一。ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种高灵敏度的检测技术。ELISA技术结合了免疫荧光法和放射免疫测定法两种技术的优点,具有可定量、反应灵敏准确、标记物稳定、适用范围宽、结果判断客观、简便完全、检测速度快以及费用低等特点,且同时可进行上千份样品的分析。但ELISA的分类至今尚无统一的标准。随着该技术在检测分析领域的广泛应用,有些学者根据有关的文献及试剂的来源、标本的情况和检测的具体条件,提出以下几种常用的测定方法:(a)测定抗体的间接法;(b)测定抗原的双抗体夹心法;(c)测定抗原的竞争法;(d)测IgM抗体的捕获法;(e)ABS(avidin biotin system)-ELISA法;(f)PCR-ELISA法;(g)斑点免疫酶结合试验(DIA)等。ELISA分析与其它方法相比,有以下优势:高特异性;高灵敏性,检测范围在ng和pg水平;准确度高、重现性好;一次性可处理大量样品,适宜于用定性试验进行筛选;易于推广到基层。ELISA分析也存在着一些缺陷,比如:不能同时分析多种成分;对试剂的选择性高；对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。但如果与其它检测手段联合使用，如GC、HPLC,既可增加检测的灵敏度又可降低交叉反应，还可进行更准确的定量。三、放射免疫技术放射免疫技术(RadioImmunoassay，RIA)是一种以放射性同位素作为标记物，将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的检测技术。是由Yalow和Berson于1960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法灵敏度高，测定准确性良好，特别适应于蛋白质、激素和多肽的精确定量测定。但需特殊仪器及防护措施，并受同位素半衰期的限制。RIA测定就是应用放射性物质代替ELISA中的标记酶作为抗原或抗体耦联物，在食品安全检测中最常见的同位素是3H和14C。1981年，放射免疫分析法(RIA)首先用于检测人的血液和莴苣叶片上的对硫磷残留量,检测限为1020 ng/mL，检测水中的残留量可达4 ng/mL。1978年，Charm在RIA技术的基础上发展了放射免疫检测技术(RRA)，放射免疫检测在快速检测方面最成功的是Charm6600/7600抗生素快速检测系统。该系统就是利用专一受体来识别结合于同一类抗生素族中的母环以便最快速同时检测同一抗生素族在样品中的残留情况。目前，Charm7600检测系统就内酰胺类、氯霉素类、四环素类、磺胺类、氨唑西林及碱性磷酸酶这六项检测以被FDA认可。1986年，Evrard P.等对牛尿提取、浓缩后，利用放射免疫法(RIA)对其中残留的诺龙进行了检测，其灵敏度是6 pg/mL，IC50值为59 pg/mL。通过对免疫原的设计，使得这种方法对其代谢产物19-NA、19-NE等也有较高的交叉反应，具有较高的检出率。放射免疫技术由于可以避免假阳性，适宜于阳性率较低的大量样品检测，对水产品、肉类产品、果疏产品中的农药残留量的检测中广泛应用。还可检测经食品传播的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫及小分子物质和大分子物质。四、免疫胶体金检测技术免疫胶体金检测技术又叫Rosa.Tests法，是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。胶体金(Colloidal gold)是由氯金酸(HAuCl4)水溶液在还原剂作用下,聚合成特定大小的金颗粒,颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态,也称金溶胶(goldsol)。其特点是根据需要可制备大小不同的金颗粒(直径在1150nm之间)颜色呈桔红色到紫红色，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。1962年Feldherr第一次介绍了胶体金可作为一种电子显微镜水平的示踪标记物。Faulk（1971）把胶体金引入免疫化学，这一年被公认是免疫胶体金技术诞生的一年。近年来，研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展基于金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。该技术当前主要用于在牛奶中检测抗生素，可在10min内快速检测牛奶中的抗生素，利用该技术可检测的抗生素种类有六种，内酰胺、四环素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星和黄曲霉毒素，可检测的内酰胺药物有氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素头孢噻呋、头孢霉素和青霉素G等。免疫胶体金检测技术结果直观、操作简单，在食品安全检测中有广阔的应用前景。胶体金免疫层析技术相对于其他的检测方法有其固有的优点：低聚合：金标液中单态的占85%以上，没有三个以上的聚合高清晰度：由于金粒的不连续性、抗体/结合蛋白质紧密吸附于表面，抗原定位非常清晰；保存期限长。胶体金免疫层析技术也有其缺点：操作过程要求严格，器皿要求相当洁净；保藏时要求干燥环境；交叉反应。五、单克隆抗体技术1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成了杂交细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术为医学和生物学基础研究开创了新纪元，是免疫学领域的重大突破。单克隆抗体在食品检测中最大的优点是特异性强，不易出现假阳性。在食品检测中有广泛的应用前景。目前人们已制备出各种经食品传播和引起食物中毒的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生虫、农药、兽药、激素等的单克隆抗体并建立的检测方法。Shirazid等采用戊二醛，青霉素化反应等不同的免疫原合成方法，免疫小鼠，筛选出单克隆抗体检测牛奶和畜产品中-内酰胺类抗生素残留，最低检测限度为2.55 ng/mL。吴建祥用与细胞色素C交联的氨苄青霉素(Amp-Cy)免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆，获得3株能稳定传代并分泌抗青霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞，间接竞争酶附试验(CI-ELISA)显示，3株单克隆抗体对青霉素类和先锋霉素类抗生素有特异性反应，而对链霉素、卡那霉素、氯霉素、土霉素、四环素、新霉素其他抗生素没有交叉反应，可用于青霉素类抗生素残留的检测。磺胺二甲嘧啶和克伦特罗(瘦肉精)这两种药物被欧美各国和我国列为兽药残留控制重点，国内研究出了用于动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测的单克隆抗体试剂盒和克伦特罗残留检测的多克隆试剂盒。这两种试剂盒具有特异性强、仪器化程度低、样品前处理简单、检测时间短，在实际生产中应用前景广阔，填补了国内空白。单克隆抗体检测技术可在10 min内快速检测有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及激素类的残留量为农产品的优质安全提供技术支持。英国建立了自动肉制品中的沙门氏菌的单克隆抗体检测方法，人们还制出了单核增生性李特氏杆菌的单抗，用单抗ELISA检测该菌。乳中氯霉素的单克隆抗体检测技术也被建立。食品储藏过程中会受到霉菌污染，现已从青霉、毛霉等霉菌中提取耐热性抗原制成单克隆抗体用ELISA方法可检出加热和未加热食品中的霉菌。六、免疫印迹技术(Western blotting)Western blotting是检测特异性目的蛋白质的定性方法,它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质,特别用于不溶性蛋白质的分析。其原理是先通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)区分样品中不同的组分,并转移至固相支持物(如硝酸纤维膜),再加入相应的抗体起免疫反应,最后加入标记二抗进行杂交、显色,检测样品中是否含目的蛋白成分。免疫印迹(Western blotting)法分三个步骤:第一,聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将蛋白质抗原按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区带。第二,电转移。目的是将凝胶中己分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。第三,酶免疫定位,该步的意义是将前两步中已分离,但肉眼不能见到的抗原带显示出来。将印有蛋白抗原条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标记的第二抗体反应后,再与能形成不溶性显色物的酶反应底物作用,最终使区带染色。免疫印迹法结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等特点,具有高灵敏度与高特异性的优点。特别是对于那些不溶于去污剂裂解液的抗原,或者是难以标记、容易降解的抗原,均可采用该方法进行分析。但此法也存在一些不足之处,如难以定量、操作较繁琐、花费时间长和不能同时检测大量样品等,这些缺点限制了其在转基因产品检测上的应用。目前广泛应用于酵母和真菌的检测中。七、免疫PCR法多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)又称体外核酸扩增技术，免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量检测技术。其基本原理和常规标记免疫技术相似,只不过免疫PCR中所用的抗原或抗体标记物为DNA,在固相免疫结合反应完成后,再通过PCR技术对标记DNA进行扩增,最后通过检测PCR产物对抗原或抗体进行定性或定量分析。在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原,因此免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。目前已有用免疫PCR技术检测抗HBC抗体、抗HAV抗体和抗HCV抗体等报道,均表明免疫PCR法灵敏度明显高于ELISA。在转基因产品检测中,传统的免疫检测方法其灵敏度均有限,若将免疫PCR技术应用于转基因产品检测中,将大大提高其灵敏度。当然,免疫PCR技术目前尚处于研究阶段,其配套试剂尚缺乏,所以应用的还不多,在报道的几种方法中均是用一些已知的标准品进行试验。因此,探索免疫PCR最佳反应条件,简化步骤,实现标准化对于其推广应用至关重要。八、发光免疫测定法(CLIA)发光免疫测定法常用鲁米诺(Luminol)、异鲁米诺(Isolumi-nol)及其衍生物进行标记。这些环肼类化合物在碱性条件下可被氧化产生3-胺基苯二甲酸盐和430 nm的发射光。在鲁米诺的芳氨基上进行烃链取代后产光性能增强，但若置换芳氨基则发光被破坏。另外丫叮酯也用于发光标记。化学发光免疫分析是将灵敏的化学发光或生物发光体系与特异的抗原抗体免疫测定结合于一体的检测技术，化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物。CLIA操作简单、灵敏度高、测定速度快。但CLIA产光物质发光时间极短(数秒钟)，测定误差较大。与ELISA检测方法相比，化学发光更灵敏，更为准确但化学发光需要借助发光仪。九、免疫层析技术免疫层析(immunochromatography,IC)是20世纪80年代初发展起来的快速免疫分析技术,它将免疫学原理和层析原理相结合,借助毛细管的作用,样品在条状纤维制成的膜上泳动,其中的待测物与膜上一定区域的配体结合,通过酶促显色反应或直接使用着色标记物,在短时间(20min内)便可得到直观的结果。免疫层析按其原理可分为两类,一类以酶促反应显色为基础,以显色高度来定量;另一类则使用着色标记物如乳胶颗粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等。层析时,标记物与待测物被相应的配体捕获而凝集显色,以纤维膜上显色条的有无或多少来定性或定量。 利用免疫层析原理开发出的各种食品微生物检测试纸条具有很好的应用价值。十、其他免疫检测技术随着转基因产品种类的不断增加以及转基因监测制度的日渐完善,过去所建立的免疫学检测方法可能难以适应未来的发展需要,一些灵敏度更高、容易实现自动化的检测方法可能是今后转基因产品免疫学检测的研究方向。1脂质体免疫测定法(LIA)脂质体免疫测定法是一种较新的免疫测定技术，脂质体是由磷脂或由其他类脂分子在水相中自发形成的一种密闭的双分子单层或多层囊泡，脂质体表面还可以连接抗原或抗体分子。这种生物模拟膜在形成过程中能包裹水及其中的溶质(染料或酶)，膜的稳定性可随免疫反应有规律变化。根据释放出的标记物的量进行测定，所以LIA具有很高的信号放大作用。目前LIA主要存在脂质体的稳定性和非特异性溶解问题。2克隆酶给予体免疫测定法(CEDIA)克隆酶给予体免疫测定法是一种新型均相免疫测定法。CEDIA中使用由重组DNA技术获得的半乳糖苷酶两个独立的蛋白质片段，这两个片段独立存在时无酶活性，但两个片段结合则显示催化活性。以此作为分析方法的基础。其中较小片段称为酶给予体片段(ED)，另一片段称为酶受体片段(EA)。ED标记物与抗体集合后不再与EA形成酶，所以当样品中待测物增加时则游离ED标记物增多，使反应液中酶产生增加，经底物显色测定。CEDIA是目前灵敏度较高的均相免疫测定法。3免疫传感器技术免疫传感器是生物传感器的一种，近年来已取得迅速发展。免疫传感器的探头主要由两部分组成。感受器：通常覆有连接有特异性抗体的可更换的传感膜；换能器：能将抗原抗体产生的信号转换为可供仪器检测的电信号。免疫传感器使用对象广泛，专一性较强，高度的自动化，微型化与集成化减少对使用者及环境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外操作。4多组分免疫测定法(MIA)根据不同检测物标记方法互不相同，分析条件和检测信号互不干扰。同一反应液中同时检测不同的检测物。但这种方法必须使几种标记物的测定条件相互协调，其灵敏度和组分数受到限制。生物传感器是以固定化的生物成分(酶、抗原、抗体、细胞等)为敏感材料,与适当的物理化学换能器相结合产生的一种快速检测各种物理、化学和生物量的器件。生物传感器主要由生物识别元件和信号转换器两大部分组成。当生物识别元件与待测物发生特异作用后,所得产物通过信号转换器转变成可以输出的电信号、光信号、频率信号等,从而达到分析检测的目的。目前应用最广泛的是利用的是抗原和抗体之间的免疫反应设计的免疫传感器,由于免疫反应的特异性、抗体-抗原结合物的异常稳定等,使得免疫传感器具有较高的灵敏度、特异性及响应快速等特点。总之,免疫学技术具有特异性强、准确性高、检测速度快等优点,在食品检测中将具有广泛的应用前景。