周期性拉伸通过组蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能.pdf

论 著文章编号（23）5-0494-07周期性拉伸通过组蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能陈鑫，吕慧珍，艾玎（天津医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，天津300070）摘要 目的：利用细胞单轴周期性拉伸模型，探究静脉移植手术后的周期性拉伸应力对血管平滑肌细胞（VSMC）组蛋白乳酸化修饰的影响。方法：使用细胞单轴周期性拉伸装置，对大鼠原代VSMC给予拉伸幅度15%、频率1 Hz的拉伸刺激来模拟动脉的周期性拉伸，对照组以细胞静止于拉伸小室来模拟静脉的拉伸状态。细胞收样后，使用Western印迹检测VSMC周期性拉伸24h前后的增殖细胞核抗原（PCNA）和平滑肌肌动蛋白（-SMA）的蛋白水平，qPCR检测平滑肌细胞增殖和分化基因的mRNA水平。随后用比色法检测周期性拉伸前后细胞内的乳酸含量，并提取在两种不同力学条件下处理24 h的VSMC的组蛋白来检测泛和位点特异性的乳酸化修饰水平。结果：Western印迹结果说明，和静息状态相比，VSMC周期性拉伸24 h后的PCNA蛋白水平没有明显变化（P=0.777），-SMA的蛋白水平下降（t=4.715，P0.01）。qPCR结果显示，和静息状态相比，PCNA的mRNA水平在VSMC周期性拉伸12 h后上升，24 h恢复到初始水平；细胞周期蛋白Ccnd1和Cdk6的mRNA水平呈时间依赖性上升，细胞周期依赖性激酶抑制剂Cdkn1a和分化相关基因Acta2、Tagln的mRNA水平呈时间依赖性下降。比色法结果显示，和静息状态相比，VSMC周期性拉伸24 h后的乳酸积累增加（t=5.554，P0.01）。Western印迹结果显示，和静息状态相比，VSMC周期性拉伸24 h后的泛乳酸化修饰水平上升（t=3.603，P0.01），特异性位点乳酸化修饰如H3K9la、H3K14la和H3K18la的水平均增加。与静息状态（0 h）相比，H3K9la、H3K14la和H3K18la的水平显著增加（t=6.001、6.966、12.750，均P0.000 1）。结论：周期性拉伸后VSMC的代谢状态发生改变，糖酵解的最终代谢产物乳酸积累增加，组蛋白乳酸化修饰水平也增加，这可能是引起VSMC增殖的原因。关键词周期性拉伸；乳酸；组蛋白乳酸化修饰；血管平滑肌细胞中图分类号R363.1+文献标志码Cyclic stretch regulates smooth muscle cell proliferation through histone lactylation modificationCHEN Xin，LYU Hui-zhen，AI Ding（Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）AbstractObjective：To investigate the effect of cyclic stretch（CS）stress on histone lactylation modification in vascular smooth musclecells（VSMC）after vein graft surgery using a cellular uniaxial cyclic stretching model.Methods:Using a uniaxial cyclic stretching device，the primary VSMCs of rats were subjected to stretch stimulus with a stretch amplitude of 15%and a frequency of 1 Hz to simulate the cyclicstretch of arteries，while cells static in the stretch chamber were to simulate the cyclic stretch of veins and served as control.After cellcollection，Western blotting was used to detect PCNA and-SMA protein levels before and after 24 h of cyclic stretching in VSMC.ThemRNA levels of VSMC proliferation and differentiation-related genes were detected by qPCR.Subsequently，the intracellular lactate levelsbefore and after cyclic stretch were detected by colorimetric assay.Histones of VSMC treated under two different mechanical conditions for24 h were extracted for detection of pan-and site-specific lysine lactonization levels.Results:Western blotting results showed that theprotein level of PCNA did not change significantly after 24 hours of cyclic stretch of VSMC compared with the static state（P=0.777），but-SMA decreased（t=4.715，P0.01）.The qPCR results showed that the mRNA levels of PCNA increased after 12 h ofVSMC cyclic stretch and returned to basal level at 24 h.The mRNA levels of cell cycle proteins Ccnd1 and Cdk6 increased in a time-dependent manner，and the mRNA levels of cell cycle-dependent kinase inhibitor Cdkn1a，differentiation-related genes Acta2 and Taglndecreased in a time-dependent manner.Colorimetric assay showed the accumulation of lactic acid in VSMC after 24 hours of periodicstretching elevated compared to static state（t=5.554，P0.01）.Western blotting resultsshowedanincreaseinthelevelofpan-lysinelactationof VSMC after 24 hours of cyclic stretching compared to the static state（t=3.603，P0.01），including significant elevation of site-specificlactation modifications such as H3K9la，H3K14la and H3K18la（t=6.001，6.966，12.75，all P0.000 1）.Compared with the resting state（0 h），the levels of H3K9la，H3K14la，and H3K18la were significantly increased.Conclusion:After cyclic stretch，the metabolic state ofVSMC is altered，the accumulation of lactate as the final metabolite of glycolysis increases and the level of histone lactylation modificationsalso increases，which may be the cause of VSMC proliferation.基金项目 国家自然科学基金青年科学基金项目（8 2 0 0 0 4 2 3）作者简介 陈鑫（1 9 9 8-），女，硕士在读，研究方向：生物学；通信作者：艾玎，E-m a il：e d in 2 0 0 0 c n 1 6 3.c o m。天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷5期23年9月 29熏 5Sep.23494Key wordscyclic stretch；lactate；histonelactylation modification；smooth muscle cells冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）是世界范围的内主要致死病因。冠状动脉旁路手术是最常用于治疗闭塞性冠状动脉粥样硬化病变的策略之一1。该手术通过移植患者自身其他部位的血管来代替因动脉粥样硬化斑块而堵塞的病变血管，重新恢复该血管的血流从而达到治疗目的。手术常用自体隐静脉，但与动脉移植相比，静脉移植的通畅率通常不高2。早期（移植1个月内）造成通畅率不高的原因通常是急性血栓的生成，晚期（2年）通畅率不高的原因通常是内膜增厚和动脉粥样硬化3-4。有研究发现，由动脉循环高压引起的高水平的周期性拉伸可导致静脉移植物管壁平滑肌细胞功能和状态改变，进而促进血管重塑的重要因素，其具体机制目前还未充分得到研究。组 蛋白修饰是基因表达的表观调控层面之一，它可以通过改变染色体的疏松程度来影响转录因子与基因的亲和性从而调控基因表达。近年来发现了各种新型的组 蛋白修饰标记，如丙酸化、丁酰化、琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化和巴豆酰化。2019年芝加哥大学赵英明教授课题组 在 Nature 杂志报道了全新的蛋白翻译后修饰（posttranslational modifications，PTMs）类型乳酸化修饰。该研究证实H3K18la位点的修饰直接刺激基因转录从而参与调控巨噬细胞的M1/2极化，糖酵解衍生的乳酸被确定为组 蛋白乳酸化的底物5。本研究旨在研究血管平滑肌细胞（VSMC）在周期性拉伸后是否存在乳酸积累的增加和组 蛋白乳酸化修饰的增加，为阐明代谢重编程和表观遗传修饰在这一力学刺激过程中的作用与机制作出探索。1材料与方法1.1实验材料RNA提取试剂盒（北京全式金公司），Taqq-PCR Mix（美国Thermo公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），鼠抗GAPDH抗体（美国Proteintech公司），兔抗平滑肌肌动蛋白（-SMA）抗体（PTM-5216）（杭州景杰生物科技有限公司），乳酸含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），兔抗L-Lactyl Lysine、Lactyl-Histone H3（Lys9）、Lactyl-Histone H3（Lys14）、Lactyl-Histone H3（Lys18）抗体（杭州景杰生物科技有限公司），兔抗H3抗体（北京索莱宝科技有限公司），细胞拉伸培养室（广州市华粤行仪器科技有限公司），荧光实时定量PCR仪（美国Thermo公司），NST-1400-04-R5细胞拉伸仪（日本Nepa Gene公司），恒温细胞培养箱（美国Thermo公司）。1.2实验方法1.2.1大鼠主动脉平滑肌细胞的分离和培养取Sprague-Dawley（SD）大鼠（150 g），麻醉后固定到手术板上，开胸，沿着脊柱取腹主动脉到主动脉弓的一段血管，用显微剪去除血管周围的结缔组 织，显微镜下小心撕去血管外膜留下中膜部分，剪碎，用滴管转移到培养瓶中，两周后细胞生长融合。传代到P5用于实验，每代培养到80的密度时传代。1.2.2蛋白质免疫印迹和杂交实验用细胞裂解液提取细胞的蛋白质，使用细胞超声破碎仪破碎细胞（3 s/次，超声3个循环），12 000 r/min下4离心10 min，收集上清液，用BCA法测好浓度后计算所需上样量，加入SDS上样缓冲液，100变性10 min。制备不连续的SDS-PAGE凝胶，上样，跑胶，用快速湿转仪设定的程序转膜，室温脱脂牛奶封闭1 h，之后依次孵育一抗和二抗，最后用ECL显色曝光，Image J进行后续的定量分析。1.2.3细胞总RNA的提取和qPCR使用全式金RNA提取试剂盒，按照 说明书提取细胞的RNA后，再按照 逆转录试剂盒两步法合成cDNA，按照2Taqq-PCR Mix（10 L），cDNA和RNAasefree水（总体积为9 L），qPCR引物（1 L）。具体的程序为：预变性：95，300 s；设置40个循环：变性：95，30 s，退火：60，30 s，延伸：72，30 s；溶解：95，30 s，60，30 s，72，30 s。根据qPCR得出的荧光曲线的Ct值，以GAPDH基因为内参，用2-Ct计算结果。所用到的引物序列见表1。注：Pcna：增殖细胞核抗原；Acta2：平滑肌肌动蛋白2；Tagln：转运蛋白基因；Gapdh：内参基因；Cdk6：周期蛋白依赖性激酶6；Ccnd1：细胞周期蛋白D1；Cdkn1a：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A表1qPCR所需的引物序列Tab 1Primer sequences for qPCR基因名称（种属rat）PcnaActa2TaglnGapdhCdk6Ccnd1Cdkn1a引物序列（53）TTTCACAAAAGCCACTCCACTGCTTTAAGTGTCCCATGTCAGCAATTGACCCTGAAGTATCCGTCCAGAGTCCAGCACAAAGGACTGTAATGGCTTTGGTGTGAACTCCCTCTTATGCTACCCAGAAGACTGTGGATGGCACATTGGGGGTAGGAACACTGGACCTCTGGAGTGTTGGTTGGGCAGATTTGGAGGCGTACCCTGACACCAATTCTTCGCACTTCTGCTCCGCAAAGTATGCCGTCGTCTCAAAGTTCCACCGTTCTCG产物（bp）103295111171183179111陈鑫，等.周期性拉伸通过组 蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能第5期495图1细胞拉伸仪示意图Fig1Diagram of cell stretching instrument1.2.4组 蛋白提取收集细胞，并用冰PBS洗涤两次。可以在PBS和后续的缓冲液中补加5 mmol/L丁酸钠，以保持组蛋白的乙酰化水平。将细胞重悬于TEB提取缓冲液TEB：含0.5%Triton100（v/v）、2 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）和0.02%NaN3（w/v）的PBS，细胞密度为107个/mL。轻柔搅拌，冰上裂解细胞10 min。4以650 g的离心力离心沉淀细胞核10 min。去除并丢弃上清液。用一半体积的TEB洗涤细胞核，并按照 前述方法进行离心。在0.2 mol/LHCl中重悬沉淀，随后4过夜，第二天在4以650 g的离心力离心样本10 min后收集上清液（含组蛋白），加入等量的50%三氯乙酸，冰上混匀30 min，10 000 r/min离心10 min，收集沉淀，冰丙酮洗涤沉淀，10 000 r/min离心10 min，风干，将沉淀溶解在高压水中。测量蛋白浓度后存储于-80。1.2.5细胞内乳酸含量测定在107个细胞中加入1 mL提取液一，冰浴超声波破碎细胞（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min）；4，12 000 g离心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4 12 000 r/min离心10 min后留取上清待测。根据说明书配制标准品，将测定管、对 照 管和空白管于570 nm处测定吸光值，利用标准曲线得到细胞内的乳酸含量。1.2.6细胞单轴周期性拉伸装置的使用在使用细胞拉伸仪之前，使用75%酒精对 仪器整体进行消毒，特别是拉伸小室安装的区域。细胞拉伸系统在运行时需要提前准备冷却水并连接至水泵，拉伸单元放置于孵箱里，控制单元放置在孵箱外（图1）。（1）设置好频率和幅度后打开控制单元总电源开关，打开后开关灯闪烁绿光。（2）按下START按钮，拉伸小室支架随之开始移动，此时按钮灯会闪烁绿光。（3）按下STOP按钮，拉伸室支架停止移动。（4）拉伸完毕后关闭总电源和水泵开关。既往研究中常用的拉伸幅度和频率条件有：25%、1 Hz6-8，20%、1 Hz9-10，15%、1 Hz11，10%、0.5 Hz12，10%、1 Hz13及10%、1.25 Hz14-15。1.3统计学处理符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用非配对t检验，多组 间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P0.05为差异有统计学意义。结果部分中标注的实验结果的次数（n），是多次实验重复获得的样本数量。采用GraphPad Prism6统计软件进行统计和画图。2结果2.1周期性拉伸后VSMC的收缩和增殖相关基因表达的改变周期性拉伸的频率和幅度对 细胞的功能改变也不相同，笔者确定了拉伸幅度15%、频率为1 Hz的周期性拉伸作为模拟动脉循环中VSMC受到的力学条件，静止于拉伸小室作为模拟静脉循环中VSMC受到的力学条件。当VSMC处于上述两种力学条件24 h后收集细胞的蛋白和RNA，通过免疫印迹实验和qPCR对VSMC中的增殖和表型转换的标志蛋白进行检测。Western印迹结果显示，周期性拉伸24 h后PCNA的蛋白表达水平无明显变化（P=0.777），-SMA的蛋白表达水平下降（t=4.715，P0.01）（图2）。qPCR结果显示，和静息状态相比，PCNA的mRNA水平在VSMC周期性拉伸12 h后上升，24 h后恢复到正常水平；细胞周期蛋白Ccnd1和Cdk6的mRNA水平呈时间依赖性上升，细胞周期依赖性激酶抑制剂Cdkn1a和分化相关基因Acta2、Tagln的mRNA水平呈时间依赖性下降（图3）。2.2周期性拉伸对细胞内乳酸含量的影响检测（For Logn Term Studies:Fits in a CO2incubator）NST-140第29卷天津医科大学学报496注：Acta2：平滑肌肌动蛋白2；Tagln：转运蛋白基因；Pcna：增殖细胞核抗原；Cdk6：周期蛋白依赖性激酶6；Ccnd1：细胞周期蛋白D1；Cdkn1a：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A；VSMC：血管平滑肌细胞；*P0.05，*P0.01，*P0.001，*P0.000 1图3周期性拉伸后VSMC的增殖和分化相关基因的mRNA变化Fig 3Changes in mRNA levels of genes associated with proliferation and differentiation in VSMC after cyclic stretch注：A：Western印迹检测VSMC中pan-kla的蛋白表达水平；B：Western印迹统计分析结果（n=5）；VSMC：血管平滑肌细胞；pan-kla，泛乳酸化修饰；static：静息（对 照）；cs：周期性拉伸；H3：内参蛋白；*P0.01图5周期性拉伸后VSMC的组蛋白泛乳酸化修饰的变化Fig 5Changes of pan-histone lactylation in VSMC after cyclicstretchVSMC周期性拉伸24 h后细胞内的乳酸水平，与静息状态相比，细胞内乳酸积累增加（t=5.554，P0.01）（图4）。2.3周期性拉伸对组蛋白泛乳酸化修饰的影响和静息状态相比，周期性拉伸24 h后的组 蛋白的泛乳酸化修饰水平升高（t=3.603，P0.01）（图5）。2.4周期性拉伸对位点特异性组蛋白乳酸化修饰的影响随着周期性拉伸时间的延长，特异性位点乳酸化修饰如H3K9la、H3K14la和H3K18la的水平升高并且表现出时间梯度依赖性。与静息状态（0 h）相比，H3K9la、H3K14la和H3K18la的水平显著增加（t=6.001、6.966、12.750，均P0.000 1）（图6）。注：A：Western印迹检测血管平滑肌细胞中PCNA和-SMA的蛋白水平；B、C：Western印迹统计分析结果（n=3）；static：静息（对 照）；cs：周期性拉伸；VSMC：血管平滑肌细胞；PCNA：增殖细胞核抗原；-SMA：-平滑肌肌动蛋白；GAPDH：内参蛋白；ns：没有统计学意义；*P0.01图2周期性拉伸后VSMC的PCNA和-SMA的蛋白表达变化Fig 2Changes in protein expression of PCNA and-SMA in VSMC after cyclic stretchstaticCSPCNA-SMAGAPDHAB1.51.00.50.0PGNAstaticCS蛋白相对 表达量1.51.00.50.0蛋白相对 表达量staticCS-SMA*C0.80.60.40.20.0mRNA相对 表达量Acta2TaglnPcnaCdk6Ccnd1Cdkn1a6420mRNA相对 表达量1.51.00.50.0staticCS细胞内乳酸水平（mol/104个细胞）staticCSstaticCS蛋白相对 表达量Pan-klaH3HistoneAB注：测量平滑肌细胞内乳酸含量的统计分析结果（n=4）；static：静息（对 照）；cs：周期性拉伸；VSMC：血管平滑肌细胞；*P0.01图4周期性拉伸后VSMC的乳酸含量变化Fig4Changes of lactate levels in VSMC after cyclic stretch*0 h6 h12 h24 h0 h6 h12 h24 h*ns*2.52.01.51.00.50.0陈鑫，等.周期性拉伸通过组 蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能第5期4973讨论在血液循环系统中，左心室泵出的血液会对 血管壁有3种力学刺激：血液流动时和管壁的摩擦力，即剪切应力；血液压力引起管壁扩张所引起的周期性应力；由循环系统平均充盈压所产生的静水压力。血管内皮细胞直接接触血流因而主要受剪切应力调节，血管平滑肌细胞则主要受周期性应力调节16。周期性应力包括沿着管壁圆周传播的周向应力和纵向应力17。其中，VSMC主要受周向应力的调控18，形成细胞周期性拉伸。许多研究结果说明，VSMC周向应力的增加会导致动脉粥样硬化病变的发生。静脉移植物内膜增厚是静脉及其血管细胞在植入后生物力学和环境因素共同影响的结果，这会导致VSMCs的激活，并通过包括细胞外基质和钙黏蛋白在内的多个因素共同调节其行为。增厚的内膜极易发生动脉粥样硬化，导致症状再次发生，需要进一步治疗。因此，深入探究静脉移植后周期性拉伸对VSMC的作用机制，对 静脉移植物疾病的临床用药和治疗至关重要。静脉受心脏搏动的影响很小，管腔内压力大约为915 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），血管壁细胞的周期性拉伸幅度约为5%10%。在移植到动脉循环后，其周向应变最高值大约增加了1倍。基于动、静脉管壁平滑肌细胞所处的周期性拉伸环境和前期对 静脉移植的研究实验，笔者最终采用拉伸幅度15%、频率为1 Hz的周期性拉伸来模拟动脉管壁的力学环境，静止于拉伸小室中则被用来模拟静脉管壁的力学环境。成熟VSMCs表达-SMA，这一蛋白标志表明细胞收缩能力强。和静息状态的对 照 组相比，15%、1 Hz的周期性拉伸可以降低收缩标志-SMA的蛋白和mRNA水平，说明周期性拉伸可能使VSMC去分化，这一结果和之前的研究一致19-20，说明本研究的模型构建成功。乳酸是细胞糖酵解途径生成的重要代谢产物，其生物学功能因肿瘤细胞中Warburg效应的存在得到了广泛关注。组蛋白乳酸化修饰水平受细胞乳酸含量的调控。与组 蛋白乙酰化类似，组 蛋白乳酸化可以直接刺激染色质的基因转录。之前有相关研究的代谢组 学数据显示，15%、1 Hz的周期性拉伸条件下VSMC会改变其产能方式，即由氧化磷酸化转向糖酵解方向21。本工作证实了周期性拉伸的条件下VSMC的乳酸积累增多，并且增多的乳酸会作为组 蛋白乳酸化的底物，导致组 蛋白乳酸化水平的改变。与静息状态相比，周期性拉伸后的VSMC的泛乳酸化和特异性位点（K9、K14、K18）的乳酸化修饰水平均显著增加。目前已发现，即使在充分氧化的条件下，VSMC也会产生大量乳酸，并且局部缺血、心脏骤停以及休克、烧伤、创伤和其他病理情况都会引起局部和全身的乳酸浓度升高。2017年研究结果首次证明了VSMCs在富含乳酸的微环境中可以呈现出更多的合成表型，明确了VSMC的代谢状态和平滑肌细胞表型转换的关系22。VSMC的增殖和肿瘤细胞一样需要大量能量，一些研究表明异常增殖的VSMCs中也存在Warburg效应23。内皮损伤后，VSMCs中葡萄糖转运蛋白1水平升高，表明葡萄糖摄取与VSMCs增殖之间存在相关性24。有研究提出，血小板衍生生长因子（PDGF）通过糖酵解途径显著诱导VSMCs增殖。在肺动脉高压中，Warburg效应的抑制剂能够降低肺动脉VSMCs的增殖水平、缓解肺血管重构，并改善心肌肥厚及心力衰竭25-27。这说明糖酵解在VSMCs的增殖中具有十分重要的作用。已有报道证实，H3K18la和H4K5la参与了缺氧性肺动脉高压的平滑肌细胞增殖过程，破坏乳酸的产生或组 蛋白的乳酸化则使平滑肌细胞的增殖注：K:赖氨酸；H3：内参蛋白；VSMC：血管平滑肌细胞；*P0.05，*P0.01，*P0.001，*P0.000 1图6周期性拉伸6、12、24 h后VSMC的特异性位点组蛋白乳酸化修饰的变化Fig 6Changes of site-specific histone lactylation modifications of VSMC after cyclic stretching for 6，12 and 24 h蛋白相对 表达量1086420H3K9H3K14H3K18H3061224（h）0 h6 h 12 h24 hK90 h6 h 12 h24 h6420蛋白相对 表达量K14蛋白相对 表达量86420K180 h6 h 12 h24 h第29卷天津医科大学学报498和血管重塑减弱28。机械力刺激下的组蛋白乳酸化，能够在早期激活VSMC增殖相关细胞因子，提示组蛋白的乳酸化可能是VSMC增殖的早期启动信号。周期性拉伸能够诱导VSMC中血管内皮生长因子-、转化生长因子-等细胞因子的表达并促进VSMC增殖29-30。有报道乳酸和组 蛋白乳酸化能够在内皮细胞、单核细胞等多种细胞类型中激活血管内皮生长因子、转化生长因子-通路31-33，推测VSMC中也存在类似的细胞因子激活机制，即机械牵张可能通过组 蛋白乳酸化激活血管内皮生长因子、转化生长因子-等信号通路，促进VSMC增殖。周期性拉伸时，VSMC中高度糖酵解活性和高组 蛋白乳酸化水平的相互作用机制仍待进一步研究。综上所述，本研究说明了周期性拉伸后VSMC存在代谢状态的改变，糖酵解的最终代谢产物乳酸积累增加，并且组 蛋白乳酸化修饰水平也增加，这可能是VSMC增殖的早期启动信号。参考文献：1EAGLE K A，GUYTON R A，DAVIDOFF R，et al.ACC/AHA 2004guideline update for coronary artery bypass graft surgery：a report ofthe American College of Cardiology/American Heart AssociationTask Force on Practice Guidelines（Committee to Update the 1999Guidelines for Coronary Artery Bypass Graft Surgery）J.Circulation，2004，110：e340-e437.2 WADEYK，LOPESJ，BENDECKM，etal.Roleofsmoothmusclecellsin coronary artery bypass grafting failureJ.Cardiovasc Res，2018，114（4）：601-610.3 YAHAGI K，KOLODGIE F D，OTSUKA F，et al.Pathophysiology ofnative coronary，vein graft，and instent atherosclerosisJ.Nat RevCardiol，2015，13（2）：79-98.4 CARREL T，WINKLER B.Current trends in selection of conduits 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