LY∕T 3191-2020 林木DNA条形码构建技术规程.pdf

ICS 65.020 B 60 LY 中 华 人 民 共 和 国 林 业 行 业 标 准 LY/T 31912020 林木 DNA 条形码构建技术规程 Technical regulations of DNA barcodes in woody species 2020 - 03 - 30 发布 2020 - 10 - 01 实施 国家林业和草原局 发 布 LY/T 31912020 I 前 言 本标准按照 GB/T1.12009 给出的规则起草。 本标准由国家林业和草原局提出。 本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）会归口。 本标准起草单位：中国林业科学研究院热带林业研究所，湖南省林业科学院，中国科学院华南植物园，中国科学院植物研究所，江西农业大学林学院。 本标准主要起草人：裴男才、梁军生、陈步峰、葛学军、米湘成、刘娟。 LY/T 31912020 1 林木林木 DNA 条形条形码构建码构建技技术规程术规程 1 范围 本标准规定了林木 DNA 条形码构建中样本采集策略、核心 DNA 条形码片段选取标准、DNA 提取技术和保存、序列测定和编辑方法、系统发育关系构建等技术要求。 本标准适用于林木DNA条形码的构建。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 4625-2016 DNA条形码筛选与质量要求 SN/T 4626-2016 DNA条形码物种鉴定操作规程 SN/T 4714-2016 DNA条形码数据库技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 DNA 条形码 DNA barcodes 是从线粒体、叶绿体或核基因组区域中筛选的一段短的通用的DNA序列，以期对现存生物在物种水平上进行快速而准确的识别和鉴定。 3.2 引物 Primer 是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。 3.3 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction (PCR) 一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点。 3.4 DNA序列 DNA sequence LY/T 31912020 2 多核苷酸链中的核苷酸的排列顺序。可能的字母只有A、C、G和T，分别代表组成DNA的四种核苷酸腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶；无间隔地排列在一起，例如序列AAAGTCTGAC。 3.5 DNA测序 DNA sequencing technology 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测定，也就是测定组成DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。 3.6 系统发育关系 Phylogeny 生物有机体随着时间变化而呈现的起源、演化历史及其亲缘关系。 3.7 简约法系统发育分析 Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other Methods) (PAUP) 一款用于构建进化树(系统发育树)及进行相关检验的软件，包含了众多分子进化模型和方法，可利用最大似然法、简约法、距离法等分析分子数据(DNA、蛋白质序列)、形态数据及其他类型数据。 3.8 系统发育研究赛百平台 Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research (CIPRES) 一款为科研机构和研究人员设计和开放的远程超级计算机平台， 可满足巨量数据的运行要求， 能大幅节约时间成本，提高运算结果的可靠性。 3.9 分子进化遗传分析软件 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) 一款操作便捷、功能强大的分子进化遗传分析免费开源软件，可与其他在线公共超算平台互补。 3.10 DNA条形码系统发育R包 Phylotools 一款可自动进行大规模DNA序列排列和比对的软件，可构建基于多个条形码片段的超级矩阵，获取群落水平系统发育关系。经过非参数速率平滑NPRS法(r8s)转换后的进化树，就可以进行相应的群落系统发育分析。此外， 可根据实际情况增加MAFFT等算法更新、运行速度更快的比对软件，获得更准确的分析结果。 4 样本采集策略 4.1 采集部位。干净的成熟叶片最佳，特殊情况下可采集枝条、树根和树皮韧皮部等材料；避免采集被虫咬、有病菌的叶片。 4.2 样品重量。阔叶树叶片5-10片，细羽状复叶或针叶树叶片5-10克；足够用于DNA提取。 4.3 样品数量。常见种3-5个来源于不同居群的个体，稀有种尽量多采集；避免样品中出现错误鉴定的物种。 4.4 样品编号。 结合样地中物种号和树牌号进行编号；多个个体时， 需作区分； 如樟树-1(+树牌号)，樟树-2(+树牌号)。详细记录采集时间。 LY/T 31912020 3 4.5 样品保存。直接将材料置于封口袋，在封口袋中倒入干净的硅胶；或将材料放入空茶包中，可不与硅胶直接接触，确保材料不受污染。若材料含水量较高，注意及时换新的硅胶，保证材料品质；正常情况下硅胶颜色深蓝， 若吸水较多， 硅胶颜色将变为浅紫红， 此时需换新的硅胶。 条件允许的情况下，对一些叶片材料不容易提取DNA的样品可以采用冷藏保存。 4.6 凭证标本。植株整体/局部、大生境/微生境的照片和信息，记录伴生种及经纬度等。凭证标本要求带花或果实的枝条；无花或果实时，则用带叶的枝条。记录树木的标牌号以及与自封口袋上的样品编号。每个样点和每个物种采集3份以上凭证标本；采集后当天压制，最后统一交付标本馆保存。 5 核心DNA条形码片段选取标准 5.1 进化速率。 进化速率较慢的片段可以锚定目标物种到科/属的较高分类等级， 化速率较快的片段则可将近缘类群进行识别和分辨。 5.2 分辨能力。种间有明显的遗传变异，而种内变异足够小；片段所含的变异位点多则分辨力高；进化速率较快的片段比进化速率较慢的片段有更高分辨力；组合片段比单个片段提供更多的变异位点。 5.3 片段长度。足够短，减少测序工作，且便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对存在DNA降解的材料(如：保存已久的腊叶标本、处理过的民间药材)；降低测序费用；不同物种间序列长度变异尽可能小。 5.4 片段通用性。存在保守区域，便于设计通用引物。也可以从已发表的基因组、转录组数据中筛选合适的DNA片段作为特定物种的条形码。 6 DNA提取技术和保存方法 6.1 CTAB法。对少数富含次生代谢物质或油脂的物种(如樟科、桑科植物)，在CTAB程序之前增加冰浴步骤以消除影响。详见附录I。 6.2 试剂盒法。一般推荐离心柱型，具体操作步骤可在所用试剂盒说明书上获得。 6.3 DNA保存方法。所有提取出的DNA，经过电泳检测之后，一部分保存在-80冰柜长期保存备用，一部分放置在-20冰箱中用于后续实验。 LY/T 31912020 4 7 PCR扩增及测序 7.1 PCR扩增反应体系(如下表)。 条目 体积 Genomic DNA 0.5 L 10 buffer (无MgCl2) 3 L MgCl2 (视情况添加) 2 L dNTPs (2 mmol L1) 0.5 L Forward Primer (10 mmol L1) 1 L Reverse Primer (10 mmol L1) 1 L Taq E (5U L1) 0.5 L ddH2O 加至总体积30 L 总体积 30 L 7.2 PCR扩增反应策略。根据引物测序长度，PCR扩增反应策略可分为两类；具体如下表。 类别 片段 PCR扩增程序 较短片段 rbcLa、 trnH-psbA和ITS2 95 C变性3分钟，接着是35个循环的95 C变性30秒+51 C退火30秒+72 C延伸1分钟，最后是 72 C延伸7分钟。退火的温度变化幅度可在48-53 C之间调整 较长片段 matK和ITS 95 C变性3分钟，接着是35个循环的95 C变性30秒+51 C退火30秒+72 C延伸90秒，最后是 72 C延伸7分钟。退火的温度变化幅度可在48-53 C之间调整；循环数可增加至40 7.3 序列测定策略 测序使用ABI系列自动测序仪(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)。 测序引物使用 PCR扩增引物。测序时需提供PCR产物和相应引物(引物需提供正反方向)。为了验证测序的准确性或材料受到污染的准确性，每一条序列均在GenBank中进行比对。详见附录II。 7.4 常用DNA条形码片段测序引物对。 针对群落水平林木DNA条形码研究， 国际通用的主要有rbcL、matK和ITS(或ITS2)等引物对，根据需要可增加trnH-psbA。详见附录III。 8 序列编辑方法 对于一个反应(单向序列)可以完成的个体，使用Chromas 2.13软件(Technelysium, Helensvale, Australia)检验序列质量和长度，编辑后保存为FASTA格式文档。对需两个反应(双向序列)的个体，使用LY/T 31912020 5 BioEdit或DNAStar的Seqman 5.3软件(Lasergene, Madison, USA)，选定一个方向作标准，双向校准序列，编辑后保存为FASTA格式文档。条件允许的情况下，建议全部双向测序，以保证准确性。所得序列可提交至GenBank中，并获得相应的序列号以供使用与核查。对于已初步编辑好的DNA序列，可导入phylotools软件，获取群落水平上的系统发育关系，进而用于群落系统发育分析。详见附录IV。 9 系统发育关系构建方法 利用植物DNA条形码数据，可根据数据量大小、物种的亲缘关系、所需系统发育树精确程度等条件，选择合适的构树方法。基于距离的方法在计算上通常快于基于性状的方法，并且很容易应用于分析不同类型的数据。详见附录V。 9.1 非加权配对算术平均法 Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) 一种较常用的聚类分析方法，最早是用来解决分类问题的。当用来重建系统发生树时，其假定的前提条件是：在进化过程中，每一世系发生趋异的次数相同，即核苷酸或氨基酸的替换速率是均等且恒定的。通过 UPGMA 法所产生的系统发生树是物种树的简单体现。该方法是基于分子钟假定的，并且生成有根树，可用于群体数据。 9.2 最小二乘法 Least-squares (LS) 将成对距离矩阵作为给定数据， 通过匹配那些尽可能近的距离来估计一棵进化树上的枝长， 即对给定的和预测的距离差的平方和最小化。 9.3 邻接法 Neighbor-joining (NJ) 一种快速的聚类方法，不需要关于分子钟的假设，不考虑任何优化标准，基本思想是进行类的合并时，不仅要求待合并的类是相近的，而且要求待合并的类远离其他的类，从而通过对完全没有解析出的星型进化树进行分解，来不断改善星型进化树。 9.4 最大简约法 Maximum parsimony (MP) 是一种常使用于系统发生学分析的方法，根据离散型性状包括形态学性状和分子序列(DNA，蛋白质等)的变异程度，构建生物的系统发育树，并分析生物物种之间的演化关系。在最大简约法的概念下，生物演化应该遵循简约性原则，所需变异次数最少(演化步数最少)的演化树可能为最符合自然情况的系统树。在具体的操作中，分为非加权最大简约分析(或称为同等加权)和加权最大简约分析，后者是根据性状本身的演化规律(比如DNA不同位点进化速率不同)而对其进行不同的加权处理。 9.5 最大似然法 Maximum likehood (ML) LY/T 31912020 6 一个比较成熟的参数估计的统计学方法， 在系统发生树重建方法中属于一类完全基于统计学构树的代表，该方法明确地使用核苷酸替换的概率模型，在每组序列比对中考虑了每个概率，寻找能够以较高概率产生观察数据的系统发生树。当前，主要有PhyML和RA ML等一些最大似然树构建程序和软件。 9.6 贝叶斯法 Bayesian Inference 已知类条件概率密度参数表达式和先验概率， 利用贝叶斯公式转换成后验概率， 根据后验概率大小进行决策分类。如MrBayes软件。 LY/T 31912020 7 附 录 附录I(规范性). CTAB法提取植物DNA的技术步骤 步骤 内容或注意事项 1 CTAB提取液预热：取 CTAB 1000 L，巯基乙醇2-5 L， 65水浴中预热 2 取0.1 g 硅胶干燥的叶片，(针对少量样品时)将叶片放入研钵并倒入液氮，快速研磨至粉末状态，移入ep离心管；或(针对大量样品时)放入ep离心管中，加入钢珠，放入破碎仪中破碎成粉末 3 加800 L预热的CTAB提取液，65水浴1-2h, 每10 min左右摇匀。取出后，10000 r/min 离心10分钟 4 上清液转到新离心管， 加等体积(约650 L)氯仿： 异戊醇(24： 1)混合液， 混匀， 12000 r/min离心10 min 5 重复步骤4 6 取上清液，加入1/10体积的5 mol/LNaCl溶液，加入等体积(约550 L)冰冷的异戊醇或无水乙醇，在-20下沉淀2-3 h。取出后12000 r/min离心15 min 7 小心弃去上清液，用75%的乙醇漂洗30 min以上，10000 r/min，离心10 min 8 重复步骤7 9 得到DNA沉淀物，烘干后加入50-100 L TE 溶解，30 min后取出或4过夜 注：提取富含多糖、多酚类物种(如樟科、桑科植物)DNA时，可在步骤1之前增加冰浴环节以减少影响。 附录II(规范性). 不同引物测序策略 片段名称 内容 rbcLa 总长度在550 bp左右，一个测序反应即可测全 matK 总长度在850 bp左右，一端不能测完，需反向增加测定 ITS 不同类群，需要选取不同引物对 trnH-psbA 根据不同物种的长度而定，有些物种存在POLY结构，也即在序列当中存在A/T，或C/G的重复出现，此时也要加测另外一段，之后拼接这条序列 附录III(规范性). 国际通用的DNA条形码引物对 片段 引物 序列(5- 3) 有效长度/bp rbcLa SI_F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC 约550 SI_R GTYAAATCAAGTCCACCYCG matK KIM_3F CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 约850 KIM_1R ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC KIM_1F AATATCCAAATACCAAATCC 约850 KIM_1R ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 2.1a-f ATCCATCTGGAAATCTTAGTTC 约890 LY/T 31912020 8 5r GTTCTAGCACAAGAAAGTCG ITS/ITS2 ITS4 ITS5 TCCTCCGCTTATTGATATGC GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG 560-660 ITS2-S2F ITS2-S2R ATGCGATACTTGGTGTGAAT GACGCTTCTCCAGACTACAAT 220-250 trnH-psbA psbA GTTATGCATGAACGTAATGCTC 约470 (280-750) trnH CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 附录IV(资料性). 不同DNA条形码片段的序列编辑方法 片段名称 内容 rbcLa 该片段的序列排列整齐， 没有碱基的插入或缺失。 使用Chromas软件检验序列测序质量和长度，编辑后保存为FASTA格式文档作为BLAST搜寻，同时从Chromas上用nexus文件格式导出序列信息作为后续的系统发育重建文件 matK 该片段属编码基因，不同引物对测序时所得序列长度不等，存在较大变异；用相同的引物测序，所得序列在不同类群中也有较大变异。使用matK片段的序列前，需将这些粗略的序列进行反向翻译处理。使用MEGA软件，反向翻译成核苷酸序列后以比对过的FASTA格式输出， 其他样本的matK序列(每个物种有一个序列可用)以同样的方式同时进行相互间比对。 ITS/ITS2 参考matK的编辑方法。该片段存在长的POLY-G、POLY-C和POLY-A，存在多拷贝间的杂合，种内序列变异较大，导致测序和分析困难。 trnH-psbA 为了系统发育分析，FASTA文件通过科或目的分类方法进行模块分割处理。当样地中一个科只有一个物种，就将其与同目的另外一个科放在一起进行比对；而当一个目只含有一个物种时， 分析时将这个物种的trnH-psbA序列在系统发育分析时排除在外， 处理为数据缺失。 附录V(资料性). 常用的系统发育关系构建方法 名称 类别 操作平台 最佳适用范围或特征 部分链接 非加权配对算术平均法 基于距离 PAUP等 用于群体或居群数据 PAUP: http:/ CIPRES: http:/www.phylo.org/ MEGA: https:/ phylotools: https:/ 最小二乘法 基于距离 PAUP等 亲缘关系较近的类群 邻接法 基于距离 PAUP等 亲缘关系较近的类群；可用于大样本的数据 最大简约法 基于性状 PAUP、CIPRES等 可用于大样本的数据；需考虑“长枝吸引”作用 最大似然法 基于性状 PAUP、CIPRES等 可用于大样本的数据；需选择合适的模型 贝叶斯法 基于性状 PAUP、CIPRES等 可用于大样本的数据；对统计学的要求较高 _