蛋白冻干保护剂.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂,添加剂作用机理的几种说法,冷冻干燥配方需要注意的问题,冷冻干燥配方举例,5.6,添加剂作用机理的几种说法,1.,冻结过程中低温保护的机理,冻结过程的保护也称为低温保护。关于液体状态下保护剂蛋白质稳定的机理，目前较被接受的是,Timasheff,的“优先作用”机理。,在冻结过程中，蛋白质溶液大多数时间是处于溶液状态，只有在冻结快结束时，才达到最大冻结浓度。,“优先作用”机理认为蛋白质溶液，在达到最大冻结浓度之前，优先与水作用（,优先水合,）；而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（,优先排斥,）。这是由于保护剂的加入，增大了水分子的表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用。在这种情况下，蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子，从而也就保护了蛋白质的天然构象。,其他机理,表面张力减小机理,用来解释表面活性剂对蛋白质溶液冻结过程的保护。,限制蛋白质分子扩散的机理,认为许多保护剂都能够提高溶液的黏度，抑制活性分子的扩散。,2.,干燥过程中的保护机理,在干燥过程中，蛋白质的水合层被除去，这时，“优先作用”机理已不再适用。在干燥过程中的保护机理，目前主要有两大观点：,（,1,）玻璃态假说；（,2,）水替代假说。,1,）玻璃态假说,这种观点认为在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会形成玻璃态。这种玻璃态的形成可以使得冻干品的黏度达到,10,12,Pa.s,，这也是玻璃态的黏度。,保护剂在蛋白质周围形成玻璃体，使大分子蛋白质的链段运动受阻，阻止蛋白质的展开和沉淀，从而抑制了蛋白质结构亚能级与结构松弛之间的相互转换，维持蛋白质分子三维结构的稳定性。,2,）水替代假说,由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，,保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。,目前许多研究者比较赞同“水替代假说”的观点，这主要是因为通过傅立叶红外线频谱仪（,FTIR,）对蛋白质分子的结构以及蛋白质与保护剂之间的氢键作用进行直接检测，为该理论提供了证据。,波 长,cm-1,-,天然蛋白质溶液,含有添加剂的蛋白质溶液,干扰素,-,分别在冷冻干燥固体状态和复水后的频谱图,冻干干扰素,-,的频谱图。含有浓度为,1M,蔗糖的冻干干扰素,-,的频谱，与天然水溶液蛋白质极为相似；而没有蔗糖时，频谱差异较大。在不含蔗糖的干燥样品中，在,1656cm-1,处出现吸收率减少，表示,-,螺旋结构的损失，作为补偿，相应地分别在,1640-1645cm-1,和,1665-1695cm-1,处出现吸收率增加而转换成,-,折叠和弯曲（,turns,）结构。,-,折叠结构的优先出现，是对蛋白质与水之间氢键作用减少的一种补偿，即代表了干燥样品中氢键作用损失的最大程度。,3.,贮藏过程中的保护机理,和冷冻干燥过程一样，在冻干制品的长期贮藏过程中也存在着多种影响因素。两者之间的主要区别在于时间尺度上。干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时；而对于贮藏而言，时间尺度为月或年。在正确的冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转变温度；而,在正确的贮藏条件下，环境温度应当比其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松弛时间。,在冻干生物制品的长期贮藏过程中，各种赋形剂对它的保护作用机理，同样有“玻璃态假说”和“水替代假说”之争论。,5.7,冷冻干燥配方需要注意的问题,由于生物物料中活性组分各不相同，因而,一般均须针对物料单独配方。,为了确保生物制品冷冻干燥后最大程度地获得活性恢复率，必须,充分考虑各种保护剂和添加剂与生物制品活性组分之间的最大相容性。,1.,确定最优的,pH,值,由于生物制品中的活性组分（如蛋白质）只有在很小的,pH,值范围内才是稳定的；并且不同的,pH,环境会影响某些蛋白质的溶解性。所以，选择最优的,pH,环境有利于蛋白质的稳定性和它在溶液中的溶解性。例如，在中性环境中冻结卵清蛋白（,ovalbumin,），不会导致蛋白质变性，但在,pH1.9,环境下，蛋白质的结构发生了明显的变化。,另外，冷冻干燥配方的,pH,值对冻干生物制品长期贮藏的稳定性也会带来很大影响。酸碱度会影响固体状态下蛋白质的物理和化学稳定性。例如，冻干的核糖核酸酶（,RNase,）在贮藏过程中发生不可逆聚集程度就与蛋白质溶液冷冻干燥前的,pH,值有关。,2.,缓冲剂的选择,有许多缓冲剂能够用于生物制品的冷冻干燥配方中，但是，并非每一种缓冲剂都能够用于任何溶液，例如，对,pH,敏感的蛋白质溶液，就应当避免使用磷酸钠缓冲剂，这是由于在冻结过程中，,Na,2,HPO,4,易于优先结晶，使得溶液的,pH,值降低，最终引起蛋白质变性。,另外，正确选择,缓冲剂的浓度,也是很重要的。例如，,-,牛乳糖水溶液（,2g/ml,）冷冻干燥过程中，因为甘露醇结晶而不能起到保护作用。当添加浓度为,10mM,的磷酸盐缓冲液（,pH7.4,）后，部分抑制了甘露醇的结晶，并且酶的活性达到,95%,；而将磷酸盐缓冲液（,pH7.4,）的浓度提高到,200mM,就能够完全抑制甘露醇结晶。,3.,填充剂的选择,在生物制品的配方中添加一种易于结晶的填充剂，可以取得一些功能：为最终的冻干产品提供足够的机械支撑作用；改进冻干制品的外观；提高配方的溶解度；防止冻干制品发生塌陷和溢出容器。,为此填充剂的选择要满足以下几点：有相当好的溶解性；与生物制品中活性组分相容；没有或者很小的毒性；以及具有较高共晶温度。甘露醇和甘氨酸就是两种常用填充剂。,冷冻干燥生物制品配方中的,有些赋形剂可能会抑制填充剂的结晶，,从而影响生物制品的稳定性。甘露醇与蔗糖、海藻糖、乳糖或麦芽糖的混合物中，只有当甘露醇的浓度达到,30%,（,w/w,）以上，才有结晶现象。,4.,低温、干燥保护剂的选择,糖类是生物制品冷冻干燥过程中使用最频繁的保护剂，这是因为大多数糖在正常操作条件下不会结晶。并且，一般不选用还原性糖，因为它可能与蛋白质之间发生,Maillard,反应。蔗糖、海藻糖是最常用的保护剂。,某些聚合物，因其能提高玻璃化转变温度，而常被用作保护剂。但是，聚合物与蛋白质分子形成氢键的能力远远低于糖类，所以常常,采用聚合物与糖联合使用,。这样既可以提高配方的玻璃化转变温度，又可以与蛋白质形成很强的氢键作用。,生物制品中活性组分如蛋白质也属于聚合物，具有较高的玻璃化转变温度。因此，,提高蛋白质与赋形剂之间的质量比率,也可以明显提高生物制品冷冻干燥配方的玻璃化转变温度；并且，提高蛋白质的浓度还可以抑制赋形剂的结晶。当然，蛋白质的浓度也不能提高得太多，否则会因为没有足够的保护剂而使得蛋白质发生变性。,某些盐类也可用作生物制品在冷冻干燥过程中的保护剂。然而这可能会降低溶液的玻璃化转变温度。,所以在生物制品配方中应当尽量少地使用盐。,5.8,冷冻干燥配方举例,一般来讲，,蛋白质配方中固体成分含量在,2%-10%,之间。,当固体含量低于,2%,时，不能形成结实的冻干产品；而固体含量高于,10%,时，又不能很好地进行冷冻干燥，即使冷冻干燥完成，也会给复水带来困难。,由于添加剂之间的物理作用是相互的，因此,保持各添加剂之间的相对合适含量是很重要的。,如果某种添加剂同时能起到几种功能，如有的糖既能起到低温保护剂的功能，又能起到冻干保护剂的功能，那么它应当是首选的添加剂。,另外，,应当尽量避免大量使用缓冲剂或盐类，因为它们有可能在冻结过程中改变,pH,值，也有可能降低配方的玻璃化转变温度,。,