针刺疗法对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡的影响.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）；博士后科研启动金资助项目（）；博士后科研启动金资助项目（）作者简介：韩亚光（），男，博士，副主任医师，研究方向：中医药防治子宫内膜异位症、不孕症、月经失调等，：通信作者：朱小琳（）女，博士，副主任医师，研究方向：中药复方治疗 相关机制，：实验研究针刺疗法对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡的影响韩亚光宋思钰孙小惠韩延华朱小琳（黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨，；黑龙江中医药大学，哈尔滨，；黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨，）摘要目的：基于磷脂酰肌醇 激酶 蛋白激酶 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（）信号通路，探究针刺疗法对子宫内膜异位症（）大鼠异位内膜组织细胞凋亡的影响及相关可能机制。方法：采用自体移植法构建 动物模型，按照随机数字表法分为模型组、针刺组、对照组，每组 只。针刺组给予针刺治疗，次 ，连续治疗 ，对照组和模型组不给予任何治疗。采用苏木精 伊红染色法（染色）观察大鼠内膜组织病理形态；原位末端凋亡法（）观察在位及异位内膜组织细胞凋亡变化；采用荧光定量 （）和蛋白质印迹法检测在位及异位内膜组织雌激素受体（）、雌激素受体 （）、胱天蛋白酶 （）、相关 蛋白（）和 细胞淋巴瘤（）的基因表达和蛋白含量变化。结果：与对照组比较，模型组异位组织有明显异位增生和炎症介质浸润，、基因表达和蛋白含量显著升高（）；治疗干预后，与模型组比较，针刺组异位组织中，细胞增殖和炎症介质浸润明显缓解，、基因表达和蛋白含量均降低，而 、基因表达和蛋白含量明显升高（）。结论：针刺治疗可加速异位病灶组织中的细胞凋亡，这可能与调控 信号通路促进相关凋亡因子密切相关。关键词子宫内膜异位症；针刺疗法；细胞凋亡；信号通路；异位增生；胱天蛋白酶 ；相关 蛋白；雌激素 ，（，；，；，）：（），（）：，（）（）（）（），（），（），（），（）：，（），（）：，；中图分类号：文献标识码：子宫内膜异位症（，）指正常脱落的子宫内膜上皮细胞种植在腹壁、卵巢等位置，常见于育龄期妇女，主要临床表现为下腹痛、不孕、性交痛。该病发病率逐年上升，达 ，不孕妇女中发病率更高，严重影响患者身心健康。目前其发病机制尚不清楚，雌激素依赖性疾病、炎症性疾病是对 的统一认识 。西医治疗 主要是以激素和手术为主，但不良反应大或有创伤性损伤 。近年来中医疗法在治疗 等慢性疾病中被广泛认可，针刺治疗灵活、不良反应少，深受 患者青睐，越来越多的研究表明针刺能够缓解 疼痛、抑制异位组织血管生成和侵袭黏附、调节免疫功能及内分泌，改善相关症状 。本课题组探究其疗效及作用机制，现报道如下。材料与方法 材料 动物选取 周龄未孕健康 （）清洁级雌性大鼠 只，体质量 ，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号：（黑）。实验大鼠饲养于黑龙江中医药大学妇科实验室，日常保持饲舍温度（），湿度（），自然采光，对实验动物采用自由饮水和采食。所有实验均遵守黑龙江省中医药大学动物伦理研究委员会发布的伦理指南（伦理审批号：）。器具毫针：贵州安迪牌针灸针，规格为 ，贵州安迪药械有限公司产。改良后使用。试剂与仪器原位末端凋亡法（，）细胞凋亡原位检测试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司，货号：）；兔 抗 鼠 磷 脂 酰 肌 醇 激 酶（，）试剂盒（公司，美国，货号：）；蛋白激酶 （，）（公司，美国，货号：）；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（，）试剂盒（公司，美国，货号：）；兔抗胱天白酶（）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：）；相关 蛋白（，）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：）；细胞淋巴瘤 （，）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：）；核糖核酸（，）提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司，货号：；反转录试剂盒（公司，货号：）；荧光定量聚合酶链反应（，）试剂盒（公司，美国，货号：）。冰冻切片机（德国徕卡公司，德国，型号：）；光学显微镜（公司，日本，型号：）；多功能酶标仪（公司，瑞士，型号 ）；实时荧光定量 仪（公司，美国，型号：）；荧光倒置显微镜（德国蔡司公司，德国，型号：型）；电泳仪（公司，美国，型号：）。方法 分组与模型制备将 只 大鼠分为 组，对照组 只，只造模。造模过程中死亡 只，最后造模成功 只。将造模成功的 只大鼠，按随机数字表法分为模型组和针刺组，每组 只。实验动物经适应性饲养 周后，采用自体子宫内膜组织移植于肠系膜的建模方法 ，建立 大鼠模型。术前 皮下注射苯甲酸雌二醇注射液 ，使所有实验动物在造模前统一处于动情期 。腹腔 戊巴比妥钠（）注射麻醉，麻醉成功后，开腹找到子宫，在右侧子宫剪下长约 的子宫组织，行远端结扎包埋术，剥离剪下的子宫组织，切成 小组织片，选择 号肠线将组织片缝到靠近腹部内膜层的肠系膜上，使子宫组织的内膜层面向肠系膜，检查是否存在肠管损伤或者出血现象，确定均无此现象后，用可吸收的 线 将 切 开 逐 层 缝 合，腹 腔 注 射 青 霉 素 ，用碘伏消毒缝合处。在术后的前，每天给大鼠肌内注射青霉素。常规饲养 周，观察大鼠进食、活动状态、大小便情况。对照组前期准备工作同造模大鼠，切除子宫组织后仅用可吸收的 线在肠系膜缝合，并未将子宫组织片缝合到肠系膜上，余处理同造模大鼠。手术在黑龙江中医世界中医药 年 月第 卷第 期药大学中医妇科实验动物中心动物房内，严格按照无菌操作规范进行。造模 周后行开腹观察异位囊肿变化情况作为造模是否成功的初步判断，再进行苏木精 伊红（，）染色，若见内膜上皮细胞、腺体和间质细胞即为造模成功。将造模成功的大鼠，再次逐层缝合，均肌内注射青霉素 ，连续。干预方法采取以下治疗方案：对照组及模型组，无特殊干预，正常清洁饲养。模型组：造模成功后，正常清洁饲养，无特殊干预。针刺组：每日 时，在清醒状态下，将大鼠固定在手术固定台，用 针，选取大鼠腹部关元穴（脐下 ）、中极穴（脐下 ）和双侧子宫穴（卵巢解剖部位）以 深度进针，另取双侧三阴交穴（后肢内踝尖直上 ）以 深度进针，且刺入即刻和留针 时分别施提插捻转手法 ，留针 次，次 ，连续 。检测指标与方法治疗第 天，对组大鼠禁食 后，称重，在大鼠腹腔注射 戊巴比妥钠（），麻醉成功后对大鼠心脏采血。将采血管充分摇匀后，放于低温离心机，在，离心半径 ，离心 ，将上层血清用移液器分装到 的 管中，存放于 冰箱中待用。无菌手术条件下，开腹取在位内膜、异位内膜组织，截取长度 。将取出的造模区域和子宫组织浸泡到灭菌的生理盐水，将组织表面血液、脂肪、血管等清洗剥离干净。用小手术剪，将组织样品剪成 小组织块，取 浸泡于 甲醛溶液中，浸泡于 （）包埋剂中，剩余的组织块保存于冻存管中，用液氮速冻后，保存于 的超低温冰箱中待用。染色观察在位、异位内膜组织病理形态取浸泡于 甲醛溶液的子宫内膜组织，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明、石蜡液包埋、切片、苏木精染色、伊红染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片，倒置光学显微镜下观察子宫组织形态并拍照。检测在位、异位内膜组织细胞凋亡浸泡于 包埋剂的样品放置于预冷样品盘。切片机作 切片，采用丙酮浸泡、烘干、磷酸盐缓冲液（，）清洗、蛋白酶 溶液浸泡、清洗、过氧化氢（，）溶液浸泡、清洗、脱氧 核 糖 核 酸 酶（）溶液浸泡、冲洗后。再将滴加 的末端脱氧核苷酸转移酶（，）反应液，暗盒 避光反应 （加盖盖玻片），反复清洗。加入 的 ，二脒基 苯基吲哚（，）反应液，暗盒中 条件避光反应 （加盖盖玻片），用 反复清洗。荧光显微镜对切片拍照和分析。实时荧光定量 检测在位、异位内膜组织雌激素受体 （，）、雌激素受体（，）、基因表达取样品，采用研磨法提取信使 （，），测定总 浓度，按照逆转录试剂盒说明书将 逆转录为互补脱氧核糖核酸（，），按 试剂盒进行扩增，在 仪上进行检验，结果以 为内参，法分析相对 表达量。见表 。表 各基因引物系列指标引物序列产物长度（）蛋白质印迹法检测在位、异位内膜组织 、蛋白含量大鼠内膜组织加裂解液冷冻匀浆后，以，离心半径 ，离心 ，上清液经二喹啉甲酸（，）法检测蛋白浓度。上样量为 ，电泳条件 ，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，冰上转膜，加入 抗，孵育过夜，清洗，加入 抗，孵育，清洗，进行 ，显影、曝光及扫描，采用 软件分析蛋白条带灰度值，以 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。统计学方法采用 统计软件进行数据分析，若符合正态分布，用均数 标准差（珋 ）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用 检验，以 为差异有统计学意义。结果 针刺对大鼠在位、异位内膜组织病理学的影响病理切片结果发现，异位内膜组织中，对照组子宫内膜上皮细胞排列紧密多为柱状，腺体结构清晰，腺体结构完整；模型组可见细胞核排列紊乱，腺体结构不完整，有明显异位增生和炎症介质浸润；针刺组异位内膜组织形态分布规律趋于正常，异位增生和炎症介质浸润明显缓解。见图 。针刺对大鼠在位、异位内膜组织的细胞凋亡的影响与模型组比较，针刺组在位细胞凋亡无明显增加，差异无统计学意义（）。对照组和模型组异位组织细胞凋亡现象较少，而针刺组细胞凋亡显著增加，差异有统计学意义（）。见图 。针刺对大鼠在位、异位内膜组织 和 基因表达的影响组大鼠在位内膜组织中，和 基因相对表达量差异无统计学意义（图 组大鼠在位与异位内膜组织病理学变化（染色，）图 组大鼠细胞凋亡变化（染色，）世界中医药 年 月第 卷第 期 ）。组大鼠异位内膜组织中，模型组 和 基因相对表达量显著高于对照组和针刺组，差异均有统计学意义（均 ）；针刺组 和 基因相对表达量显著高于在位内膜组织的针刺组，差异有统计学意义（），基因相对表达量显著高于异位内膜组织的对照组，差异有统计学意义（）。在基因表达方面，在位内膜组织 组 差异无统计学意义（）；模型组异位内膜组织 显著高于（）对照组和针刺组（），也显著高于在位内膜组织模型组，差异有统计学意义（）；而针刺组 虽然高于对照组，差异无统计学意义（）。见表 。表 组雌激素受体基因表达变化（珋 ，）组别 对照组在位 异位 模型组在位 异位 针刺组在位 异位 注：与对照组异位比较，；与模型组比较，；与针刺组在位比较，针刺对大鼠在位、异位内膜组织 和 蛋白含量的影响组大鼠的在位内膜组织中，和 蛋白含量差异均无统计学意义（均 ）。组大鼠的异位内膜组织中，模型组 和 蛋白含量显著高于对照组和针刺组，差异有统计学意义（）；针刺组 和 蛋白含量显著高于在位内膜组织针刺组，差异有统计学意义（）。组在位内膜组织的 差异无统计学意义（）；模型组异位内膜组织 显著高于对照组和针刺组，差异均有统计学意义（均 ），也显著高于在位内膜组织模型组，差异有统计学意义（）；针刺组的 显著高于对照组和在位内膜组织模型组，差异均有统计学意义（均 ）。见表 。针刺对大鼠在位、异位内膜组织 基因表达的影响组大鼠在位内膜组织中，、和 基因表达差异均无统计学意义（均 ）。组大鼠异位内膜组织中，模型组 、和 基因表达显著高于对照组表 组雌激素受体 和 蛋白含量变化（珋 ，）组别 对照组在位 异位 模型组在位 异位 针刺组在位 异位 注：与对照组异位比较，；与模型组比较，；与针刺组在位比较，和针刺组，差异有统计学意义（）；干预后，针刺组 、和 基因表达低于对照组，差异有统计学意义（）。对异位内膜及在位内膜组织比较，异位内膜对照组和模型组 、和 基因表达与在位内膜差异无统计学意义（），异位内膜针刺组显著低于在位内膜。见表 。表 组 通路基因表达变化（珋 ，）组别 对照组在位 异位 模型组在位 异位 针刺组在位 异位 注：与对照组异位比较，；与模型组比较，；与针刺组在位比较，针刺对大鼠在位、异位内膜组织 通路蛋白含量的影响组大鼠在位内膜组织中，、和 蛋白含量差异均无统计学意义（均 ）。在大鼠的异位内膜组织中，模型组 、和 蛋白含量显著高于对照组和针刺组，差异均有统计学意义（均 ），并且 蛋白含量显著高于在位模型组，差异有统计学意义（）；针刺组 、和 蛋白含量显著低于对照组，差异均有统计学意义（均 ）。异位对照组 和 蛋白含量显著低于在位对照组，差异有统计学意义（），蛋白含量显著高于在位对照组，差异有统计学意义（）；异位针刺组 和 ，蛋白含量显著低于在位对照组。组大鼠在位内膜组织和异位内膜组织 、蛋白含量的变化趋势与 、基因表达量相一致。见表 。表 组 蛋白表达变化（珋 ，）组别 对照组在位 异位 模型组在位 异位 针刺组在位 异位 注：与对照组异位比较，；与模型组比较，；与针刺组在位比较，针刺对大鼠在位、异位内膜组织 、基因表达的影响组大鼠在位内膜组织中，、和 基因相对表达量差异无统计学意义（）。干预后，组大鼠异位内膜组织中，针刺组 和 基因相对表达量显著高于对照组和模型组，差异均有统计学意义（均 ），基因相对表达量显著低于对照组和模型组，差异均有统计学意义（均 ）。对针刺组在位内膜和异位内膜 、和 基因相对表达量比较，发现异位内膜针刺组的 和 基因相对表达量显著高于在位内膜针刺组，差异均有统计学意义（均 ），异位内膜针刺组 基因相对表达量显著低于在位内膜针刺组，差异有统计学意义（）。见表 。表 组大鼠凋亡相关因子基因表达变化（珋 ，）组别 对照组在位 异位 模型组在位 异位 针刺组在位 异位 注：与对照组异位比较，；与模型组比较，；与在位针刺组比较，针刺对大鼠在位、异位内膜组织 、蛋白含量的影响组大鼠在位内膜组织 、和 蛋白含量差异无统计学意义（）。组大鼠异位内膜组织模型组 和 蛋白含量有高于对照组趋势，蛋白含量有低于对照组趋势，但差异无统计意义（）；干预后，针刺组 和 蛋白含量显著高于对照组和模型组，差异均有统计学意义（均 ），蛋白含量显著低于对照组和模型组，差异均有统计学意义（均 ）。异位内膜针刺组 和 蛋白含量显著高于在位内膜针刺组，差异均有统计学意义（均 ），而异位内膜针刺组 蛋白含量显著低于在位内膜针刺组，差异有统计学意义（）。见表 。表 组大鼠凋亡相关因子蛋白含量变化（珋 ，）组别 对照组在位 异位 模型组在位 异位 针刺组在位 异位 注：与对照组异位比较，；与模型组比较，；与针刺组在位比较，讨论 是指脱落的子宫内膜细胞种植于子宫体腔以外的其他部位，具有较高发病率和复发率，是女性极为常见的良性慢性雌激素依赖性疾病 ；又因其具有浸润生长、远处转移，可侵犯和损害周围组织等恶性肿瘤的生物学行为，也被称为是“不死亡的癌症”。其发病机制尚不明确，目前存在多种观点和理论，都具有一定说服力。“经血逆流学说”认为脱落的子宫内膜组织随经血逆流入卵巢或盆腹腔其他组织，种植生长 。而郎景和教授 的“在位内膜决定论”指出个体在位内膜的特性才是决定异位内膜能否逆流并转移、种植的关键，的发生进展可分为“黏附 侵袭 血管生成”阶段。本课题组前期研究通过基因芯片技术对差异表达基因进行筛查，发现在异位内膜组织中存在异位内膜细胞凋亡减弱现象 ，现为验证及探究其深层作用机制开展研究。凋亡是一种死亡机制，细胞通过基因调控死亡，使细胞进行更新迭代 ，此过程是维持细胞和组织稳态的关键机制，因此促进异位组织细胞凋亡对 的治疗至关重要。影响凋亡的相关蛋白分 世界中医药 年 月第 卷第 期类，一类是抗凋亡蛋白，如 ；一类为促凋亡蛋白，如 、，这 种凋亡因子在 研究较多。而 信号通路、核因子 信号通路是影响凋亡的上游通路。信号通路是细胞内非常重要的信号转导通路，参与子宫内膜的黏附、侵袭、血管形成以及细胞凋亡等过程，而 信号通路和雌激素调控在此过程中发挥着至关重要的作用 。研究发现 患者体内雌激素相关受体比正常对照组明显升高，尤其是雌激素受体 。被认为具有抗增殖和促凋亡作用，高水平的 通过诱导环氧合酶 的合成从而刺激组织细胞中前列腺素产生并与相应受体结合，激活 通路，使 信号通路调控作用异常，影响细胞的凋亡、迁移和自噬等，促进 发生、发展 。而针刺治疗可以下调在位及异位内膜组织中 表达，使其趋于正常子宫内膜水平，达到治疗大鼠 的效应 ；还能通过诱导基因释放与转导、细胞因子及细胞内小分子释放和传递等对细胞凋亡产生影响 。因此基于 信号通路探究针刺疗法治疗 的作用机制理论上是可行的。中医学注重整体观念与辨证论治的相统一，在治疗 上尤其注重整体调整机体内环境及微稳态，针刺作为中医整体观念的具体体现，在辨证选穴的基础上，直接作用于病变位置，充分发挥“直达病所”的优势。选取关元、中极、子宫、三阴交等穴以活血化瘀，散结止痛。病位在胞宫，与冲任二脉关系密切，其中关元、中极、子宫穴同居小腹，关元为小肠经募穴，统治足三阴、小肠、任脉诸经病，具有补肾壮阳、温通经络、理气和血、补虚益损等作用 ，古今均作为保健要穴；中极通于胞宫具有补气行气活血、调理冲任的作用；子宫属经脉奇穴，为妇科要穴之一，主治月经不调、痛经等；三阴交为足三阴经交会穴，主治生殖系统疾病，能够具通调冲任，缓急止痛。研究发现针刺通过影响中枢神经系统的疼痛感觉机制，镇静止痛，从而达到治疗 痛经的目的，且针刺腹部腧穴能降低异位内膜的活性，促进异位内膜萎缩 。目前研究多从针刺阵痛、抑制“黏附、侵袭、血管生成”和雌激素代谢等方向研究治疗 ，但作用机制尚不明确 。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠异位内膜组织细胞核排列紊乱，腺体结构不完整，有明显异位增生和炎症介质浸润，雌激素受体 、表达升高，符合 特征。而针刺治疗后，模型组异位组织抑凋亡蛋白 表达降低，促凋亡蛋白 、表达明显升高，大鼠异位增生和炎症介质浸润得到缓解，异位组织凋亡明显增加，表明针刺治疗能够上调凋亡因子的表达，促进异位组织凋亡。针刺治疗前后雌激素受体和 信号通路基因表达和蛋白含量的变化，提示针刺的治疗作用可能是通过调控了体内 水平，进而影响了 信号通路促进病灶细胞凋亡。本实验研究针刺对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡及 信号通路的影响，为针刺治疗子宫内膜异位症机制研究提供了新思路。利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突关系。参考文献 刘璇，王海军，张黎，等“秩边透水道”针法对子宫内膜异位症大鼠 、调节作用的研究 上海针灸杂志，（）：中华医学会妇产科学会分会子宫内膜异位症协作组 子宫内膜异位症的诊治指南 中华妇产科杂志，（）：商志浩，芮靖琳，苗芙蕊，等 针灸治疗子宫内膜异位症研究进展 中国中医药现代远程教育，（）：沈群，陆菁 针灸治疗子宫内膜异位症临床观察 上海针灸杂志，（）：黄尉，刘署鹏，蒋凌飞 电针八?穴治疗子宫内膜异位性痛经 例临床观察 湖南中医杂志，（）：李双杰 针刺配合异痛舒治疗子宫内膜异位痛经的临床观察 哈尔滨：黑龙江中医药大学，席瑾，曹星星，高友玲，等 针灸治疗子宫内膜异位症的机制研究进展 针刺研究，（）：郑嘉尧 子午流注纳甲法治疗气滞血瘀型子宫内膜异位症痛经的临床研究 广州：广州中医药大学，陈元欢，武权生，周小静，等 子宫内膜异位症动物模型建立方法 医学综述，（）：杨春惠，侯顺玉，邱伍英 榆栀止血颗粒对子宫内膜异位症大鼠 信号通路及异位内膜体积的影响 世界中医药，（）：彭艳，何援利 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