长链非编码RNA-GAS5靶向miR-29下调铜转运蛋白CTR1抑制肾脏纤维化的机制研究.pdf

DOI:10.12289/j.issn.1008-0392.22389基础研究 收稿日期:2022-09-25 基金项目:上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项(20194Y0115)作者简介:余 莹(1986),女,主治医师,博士.E-mail:tongjiyuying 通信作者:余 晨.E-mail:yuchen 长链非编码 RNA-GAS5 靶向 miR-29 下调铜转运蛋白 CTR1 抑制肾脏纤维化的机制研究余 莹,张颖莹,牛阳阳,余 晨(同济大学附属同济医院肾脏内科,上海 200065)【摘要】目的 研究长链非编码 RNA-生长阻滞特异转录物 5(GAS5)对肾脏纤维化的作用及机制。方法收集临床肾穿刺患者的组织标本,用原位免疫荧光方法检测 GAS5 在组织上的定位和表达情况;构建小鼠单侧输尿管梗阻肾脏纤维化模型,用原位免疫荧光方法检测 GAS5 在肾组织上的定位以及表达情况;用转化生长因子-(TGF-)刺激肾小管上皮细胞后,用 Real-time PCR 方法检测 GAS5 的表达水平;在肾小管上皮细胞中转染 GAS5 过表达质粒后,用 Western 印迹法检测细胞外基质蛋白胶原蛋白 3(Col3)、纤连蛋白 1(FN1)、铜转运蛋白 1(CTR1)和铜离子转运 ATP 酶 肽(ATP7a)的表达水平,用 Real-time PCR 方法检测 miR-21、miR-29、CTR1 和 ATP7a 的表达。在肾小管上皮细胞中过表达 miR-29 后,用 Western 印迹法检测 CTR1 的表达;在肾小管上皮细胞中过表达 miR-21后,用 Western 印迹法检测 ATP7a 的表达。结果 在不同肾脏纤维化模型中,GAS5 均较对照组表达下调。在肾小管上皮细胞中,过表达 GAS5 抑制 Col3 和 FN1 的合成(P0.05);过表达 GAS5 可上调 miR-29 的表达,并下调miR-21 的表达(P0.05)。miR-29 在转录后水平抑制 CTR1 的蛋白表达(P0.05),且过表达 GAS5 能够降低CTR1 的蛋白表达(P0.05);miR-21 在转录后水平抑制 ATP7a 的蛋白表达(P0.05),但过表达 GAS5 不影响ATP7a 的表达。结论 长链非编码 RNA-GAS5 通过上调 miR-29,在转录后水平抑制铜转运蛋白 CTR1,进而抑制肾脏纤维化。【关键词】肾脏纤维化;生长阻滞特异转录物 5;miR-29;铜转运蛋白【中图分类号】R692【文献标志码】A【文章编号】10080392(2023)04049408Long non-coding RNA-GAS5 downregulates copper transporter protein CTR1 to inhibit renal fibrosis through targeting miR-29YU Ying,ZHANG Yingying,NIU Yangyang,YU Chen(Department of Nephrology,Tongji Hospital,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 200065,China)【Abstract】Objective To study the effect of long non-coding RNA-GAS5 on renal fibrosis and the involving mechanisms.Methods Renal tissue specimens were collected from renal puncture patients and mouse kidney fibrosis model,the localization and expression of GAS5 in human and mouse renal tissues were detected by in situ immunofluorescence.Rat renal tubular epithelial NRK-52E cells were treated with transforming growth factor-(TGF-),the expression level of GAS5 was detected by Real-time PCR.The NRK-52E cells were transfection with GAS5 overexpression plasmid,the expression levels of extracellular matrix proteins collagen 3(Col3),fibronectin 1(FN1),copper transporter protein 1(CTR1)and copper-transporting ATPase alpha peptide(ATP7a)were detected by Western blotting,and the expression level of miR-21,miR-29,CTR1 and ATP7a was detected 494第 44 卷第 4 期2023 年 8 月同 济 大 学 学 报(医 学 版)JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.44 No.4Aug.2023by Real-time PCR.After overexpression of miR-29 in NRK-52E cells,the expression of CTR1 and ATP7a was detected by Western blotting.Results In situ immunofluorescence showed that in renal fibrosis models,the expression of GAS5 was down-regulated compared with the control group.GAS5 overexpression inhibited the synthesis of Col3 and FN1 in NRK-52E cells(P 0.05).Overexpression of GAS5 up-regulated the expression of miR-29 and down-regulated the expression of miR-21(P0.05).miR-29 inhibited the expression of CTR1 at the post-transcriptional level(P0.05),and overexpression of GAS5 reduced the expression of CTR1(P0.05).miR-21 inhibited ATP7a protein expression at the post-transcriptional level(P0.05),but GAS5 overexpression did not affect ATP7a expression.Conclusion Long non-coding RNA-GAS5 inhibited the copper transporter CTR1 at the post-transcriptional level by upregulating the expression of miR-29,thereby attenuating renal fibrosis.【Key words】renal fibrosis;GAS5;miR-29;copper transporter 慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的发病率日益升高,据流行病学调查显示我国目前CKD 患者人数超过 1 亿,而每年约有 20 万人会进展至终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)1-2,已成为严重危害国民健康、加重经济负担的公共卫生问题。肾脏纤维化是以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度积聚为特征的病理改变,是各种慢性肾脏病发展为慢性肾衰竭的共同途径。由于对肾脏纤维化的调控机制缺少足够认识,其治疗干预存在众多阻碍。长链非编码 RNA(LncRNAs)是一类长度超过200 nt 的 RNA 分子3,尽管不编码蛋白,但是其在转录水平、表观修饰水平及转录后水平多层次调控基因的表达,并与多种疾病的发生、发展、诊断以及治疗具有密切的关系3-5。生长阻滞特异转录物 5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)是一种LncRNA,最早从具有增殖活性高的小鼠 NIH3T3 细胞中被鉴定出来6。GAS5 目前被认为是多种实体肿瘤的干预靶点,其通过引导转录因子定位、吸附microRNA 等多种机制,实现抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、减轻肿瘤放化疗抵抗等效应,被认为是一种有效的肿瘤抑制因子7-10。铜离子是人体必需的微量金属元素,参与细胞呼吸、自由基清除、色素形成、神经肽的合成等生命活动11。研究者发现肾脏纤维化过程中存在铜离子过载的现象,且应用铜螯合剂后小鼠肾脏纤维化程度显著减轻12。因此,本研究将探索在肾脏纤维化过程中,GAS5 是否能够调节铜转运蛋白表达水平,进而参与肾脏纤维化的发展。1 材料与方法1.1 细胞培养大鼠肾小管上皮细胞系 NRK-52E,将10%FBS、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 链霉素加入 DMEM培养基中,制备全培养基进行细胞培养,至细胞汇合度达 70%80%时进行传代。吸除培养液后,灭菌的1PBS 缓冲液清洗细胞 3 次,吸除 PBS,加入适量的含 EDTA 的胰酶消化,在显微镜下观察到细胞形态呈圆球状时,说明消化情况良好,加入两倍胰酶体积的完全培养液中止消化,离心后重悬,按 13 的比例传至新培养皿中,继续培养。1.2 细胞转染细胞汇合度达到 30%50%时进行转染,按以下步骤准备 GAS5 质粒与 Lipo2000 混合液(以六孔板为例)。首先稀释质粒:用 250 L Opti-MEMI 稀释1 2 g 质粒(终浓度为 50 nmol/L),轻柔混匀;然后稀释 Lipo2000:用 250 L Opti-MEMI 稀释 2 4 L Lipo2000,轻柔混匀,室温孵育 5 min;将稀释的质粒和 Lipo2000 轻柔混匀,室温孵育 20 min;将上述混合液小心滴入培养皿中,并同时晃动培养板,置入细胞培养箱中培养;6 h 后更换为正常完全培养液继续培养,48 h 后收集细胞。1.3 临床标本于同济大学附属同济医院肾内科行肾穿刺的标本经病理室常规行 Masson 染色,本研究涉及人的生物医学研究部分严格遵循上海市同济医院伦理规范,并通过同济大学附属同济医院医学伦理委员会审查伦理号:(同)伦审第(K-W-2019-008)号。594 第 4 期余 莹 等:长链非编码 RNA-GAS5 靶向 miR-29 下调铜转运蛋白 CTR1 抑制肾脏纤维化的机制研究1.4 Western 印迹法将样本加入 RIPA 裂解液中提取总蛋白,BCA 法测定各组样本的蛋白浓度并以 RIPA 裂解液调齐,以10%SDS-PAGE 凝胶电泳后,转印至甲醇活化的PVDF 膜。以 5%脱脂奶粉室温封闭 1 h,加入一抗孵育过夜,第 2 天室温孵育 12 000 稀释的 HRP 标记的二抗,采用超敏 ECL 发光液,用化学发光仪曝光。抗体信息:Col3 抗体(Abcam,ab184993);FN1 抗体(Abcam,ab268020);CTR1 抗 体(CST,#13086);ATP7a 抗体(Invitrogen,PA5-103110)GAPDH 抗体(Abcam,ab8245)。1.5 Real-time PCRTRIzol 法提取样本总 RNA 后,利用反转录试剂盒将其反转录为 cDNA,并参照说明书配制 RT-PCR反应体系,设置反应条件。引物信息如下:Rat-CTR1-F:GTATTTGGTGGCTGGGGTTC;Rat-CTR1-R:TCGGGTTTCGGCGTAAGT;Rat-ATP7a-F:CCT-CAACAGCGTCGTCACTA;Rat-ATP7a-R:GACTAG-CAGCATCCCCAAAG;Rat-actin1-F:TACAACTC-CTTGCAGCTCC;Rat-actin-R:ATCTTCATGAGG-TAGTCAGT;microRNA 反转录试剂盒以及引物订购自广州市锐博生物科技有限公司。1.6 原位免疫荧光常规固定、预杂交:使用预杂交液 37 孵育1 h;杂交:弃去预杂交液,滴加杂交液(含 GAS5 lncRNA 探针,浓度 8 ng/L),37 杂交过夜;杂交后洗涤:弃去杂交液,37 使用 2SSC 洗 10 min,37 使用 1SSC 洗 5 min2 次,室温 0.5SSC 洗10 min;DAPI 复染细胞核,使用抗荧光淬灭封片剂进行封片;于倒置荧光显微镜下观察染色结果并拍照。探针序列如下。小鼠 GAS5 探针:5-TCCAC-CAGATGTCCCATCACAGAGGTCCACAGGGC-3,探针 5端标记 Alexa Fluor 488;大鼠 GAS5 探针:5-CAGAAATGAAGGACCTTGTGTGGAGCTTGC-CATGCC-3,探针 5 端标记 Alexa Fluor 488;人GAS5 探针 5-GTGAGGCAAGACCCTTTCAAGCA-GTAA-3,探针 5端标记 CY3。1.7 小鼠单侧输尿管梗阻模型选取 6 8 周龄的健康雄性 SPF 级 C57BL/6J 小鼠。将小鼠仰卧位固定于小动物手术台上,连接异氟烷吸入麻醉。实验组脱毛后,常规消毒腹部,以腹部正中切口,依次切开皮肤至腹腔,游离左侧输尿管,输尿管用组织钳托起中段部位,止血钳轻柔钳夹,两端用 6-0 丝线两次结扎,剪断输尿管,然后关腹缝皮。假手术组手术入路均和模型组相同,进腹腔后仅游离输尿管并不结扎。本研究涉及实验动物的研究部分严格遵循上海市同济医院伦理规范,并得到上海市同济医院动物实验伦理委员会批准。UUO 术后 7 d 观察到梗阻肾体积增大,进一步对肾组织行 Masson 染色见细胞外基质沉积,H-E 染色见肾小管管腔增大、间质纤维化等表现,代表造模成功。1.8 统计学处理本实验涉及的统计分析及图形绘制均使用Graphpad Prism 8.0 软件,实验数据报告形式为 xs,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)及t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 GAS5 在多种肾脏纤维化模型中表达下调依据 Masson 染色结果,将肾穿刺标本分为纤维化组和非纤维化组,原位免疫荧光染色提示 GAS5荧光信号强度在纤维化组明显下降;在小鼠肾脏纤维化模型中,原位免疫荧光染色表明 UUO 组同假手术组相比,GAS5 荧光信号强度显著下调;在肾小管上皮细胞中,同对照组相比,2 ng/mL TGF-刺激48 h 显著降低 GAS5 的荧光信号强度(图 1)。上述结果表明,GAS5 在肾脏纤维化标本、小鼠肾脏纤维化模型及肾小管上皮细胞的肾脏纤维化细胞模型中均一致性表达下调,这提示 GAS5 很可能是肾脏纤维化的重要调节因子。2.2 过表达 GAS5 抑制肾小管上皮细胞的细胞外基质合成 将剂量为 1、4 g 的 GAS5 的过表达质粒,分别转染至肾小管上皮细胞中,以空载质粒作为对照,48 h后收集细胞样本,并以 Western 印迹法检测肾脏细胞外基质主要成分 胶原蛋白(Collagen,Col3)和纤连蛋白(FN1)的表达水平,结果提示转染 4 g的 GAS5 过表达质粒 48 h 能够显著抑制肾小管上皮细胞的细胞外基质合成(图 2)。2.3 肾小管上皮细胞中过表达 GAS5 上调 miR-29表达,下调 miR-21 表达 通过在 starbase(https: MEM(https:biit.cs.ut.ee/mem)网站联合分析,miR-29 和 miR-21 可能是 GAS5 的潜在作用靶点。将剂量为 1、4 g 的 GAS5 的过表达质粒,转染至肾694 同济大学学报(医学版)第 44 卷小管上皮细胞中,以空载质粒作为对照,48 h 后收集细胞样本,以 RT-PCR 法检测 miR-29 和 miR-21 的表达水平,结果提示过表达 GAS5 上调 miR-29 的表达,下调 miR-21 的表达(图 3)。图 1 不同肾脏纤维化模型中,GAS5 的表达Fig.1 GAS5 expression in different renal fibrosis modelsA:原位免疫荧光法检测肾组织中 GAS5 的表达;B:原位免疫荧光法检测小鼠 UUO 手术组或假手术组中 GAS5 的表达;C:原位免疫荧光法检测 TGF-(2 ng/mL,48 h)或 PBS 刺激的肾小管上皮细胞中 GAS5 的表达图 2 过表达 GAS5 对肾小管上皮细胞细胞外基质合成的作用Fig.2 Effect of GAS5 overexpression on extracellular matrix synthesis in renal tubular epithelial cellsA:Western 印迹法检测 Col3 和 FN1,B:灰度半定量统计分析结果;EV:空载质粒;与 EV 相比,P0.05;n=6图 3 GAS5 调节 miR-29 和 miR-21 的表达Fig.3 GAS5 regulates the expression of miR-29 and miR-21Real-time PCR 法检测肾小管上皮细胞中 GAS5 过表达后 miR-29和 miR-21 的表达;EV:空载质粒;与 EV 相比,P0.05;n=62.4 肾小管上皮细胞中 miR-29 转录后抑制 CTR1的蛋白表达 作为 GAS5 的潜在作用靶标,miR-29 参与肾脏纤维化的调节机制尚未明确。通过 TargetScan(https:www.targetscan.org/vert_71/)网站预测,铜转运蛋白 CTR1 的 mRNA 3UTR 区存在 miR-29的结合位点。在肾小管上皮细胞中转染 miR-29 模拟物(50 nmol/L)48 h,同对照组相比,CTR1 mRNA水平无明显变化,这提示 miR-29 在转录水平对CTR1 无调节作用。进一步的荧光素酶报告实验结果证实,转染 miR-29 模拟物能够显著抑制 CTR1-3UTR 报告载体的荧光信号强度,而 Western 印迹法结果表明,转染 miR-29 模拟物使 CTR1 蛋白水平明显下调。因此,在肾小管上皮细胞中,miR-29 通过结合到 CTR1 mRNA 的 3UTR 区,在转录后水平抑制 CTR1 的蛋白表达(图 4)。2.5 肾小管上皮细胞中过表达 GAS5 抑制 CTR1的蛋白表达 为探究 GAS5 是否通过 miR-29 的调节作用来794 第 4 期余 莹 等:长链非编码 RNA-GAS5 靶向 miR-29 下调铜转运蛋白 CTR1 抑制肾脏纤维化的机制研究影响铜转运蛋白 CTR1 的表达,在肾小管上皮细胞中转染剂量为 1、4 g GAS5 过表达质粒 48 h,同对照组相比,CTR1 mRNA 水平无明显变化,而Western 印迹法结果表明,过表达 GAS5 使 CTR1蛋白水平显著下调。因此,过表达 GAS5 可能通过下调铜离子内向转运蛋白 CTR1 的水平,降低肾小管上皮细胞胞内铜离子水平,来抑制肾脏纤维化进展(图 5)。2.6 肾小管上皮细胞中 miR-21 转录后抑制 ATP7a的蛋白表达 miR-21 作为筛选得到的 GAS5 的另一个潜在靶标,其调节肾脏纤维化的机制尚未完全明确。通过 TargetScan(https:www.targetscan.org/vert _71/)网站预测,铜转运蛋白 ATP7a 的 mRNA 3UTR区存在 miR-21 的结合位点。在肾小管上皮细胞中转染 miR-21 模拟物(50 nmol/L)48 h,同对照组相比,ATP7a mRNA 水平轻微上调,但缺乏统计学意义,提示 miR-21 在转录水平不调节 ATP7a。进一步的荧光素酶报告实验结果证实,转染 miR-21 模拟物能够显著抑制 ATP7a-3UTR 报告载体的荧光信号强度,而 Western 印迹法结果表明,转染 miR-21 模拟物使 ATP7a 蛋白水平明显下调(图 6)。因此,在肾小管上皮细胞中,miR-21 通过结合到 ATP7a mRNA 的 3UTR 区,抑制 ATP7a 的蛋白表达。图 4 miR-29 对 CTR1 的作用Fig.4 Effect of miR-29 on CTR1A:Real-time PCR 方法检测 CTR1;B:制作包含 CTR1 的3 端 UTR 序列的 luciferase 质粒,和 miR-29 模拟物共转染入细胞,检测荧光值信号强度;C:Western 印迹法检测 CTR1,D:灰度半定量统计分析结果;NC:阴性对照;与 NC 相比,P0.05 vs NC;n=6图 5 过表达 GAS5 对铜转运蛋白 CTR1 表达的影响Fig.5 Effect of GAS5 overexpression on the expression of copper transporter CTR1A:Real-time PCR 法检测 CTR1;B:Western 印迹法检测 CTR1;C:灰度半定量统计分析结果;EV:空载质粒;与 EV 相比,P0.05;n=6图 6 miR-21 对 ATP7a 的作用Fig.6 Effect of miR-21 on ATP7aA:Real-time PCR 法检测 ATP7a;B:制作包含 ATP7a 的 3 端 UTR 序列的 luciferase 质粒,和 miR-21 模拟物共转染入细胞,检测荧光值的变化;C:Western 印迹法检测 ATP7a;D:灰度半定量统计分析结果;NC:阴性对照;与 NC 相比,P0.05;n=6894 同济大学学报(医学版)第 44 卷2.7在肾小管上皮细胞中过表达 GAS5 不影响ATP7a 的表达 为探究 GAS5 是否通过 miR-21 的调节作用来影响 ATP7a 的蛋白表达,在肾小管上皮细胞中转染剂量为 1、4 g GAS5 过表达质粒 48 h,同对照组相比,ATP7a mRNA 水平轻微上调,但差异无统计学意义。而 Western 印迹法结果表明,过表达GAS5 使 ATP7a 蛋白水平轻微下调,差异不具有统计学意义(图 7)。因此,过表达 GAS5 并不影响ATP7a 的表达。图 7 过表达 GAS5 对铜转运蛋白 ATP7a 表达的影响Fig.7 Effect of GAS5 overexpression on the expression of copper transporter ATP7aA:Real-time PCR 法检测 ATP7a;B:Western 印迹法检测 ATP7a;C:灰度半定量统计分析结果3 讨 论慢性肾脏病的发病率高,肾脏纤维化是各种慢性肾脏病进展到终末期肾病的共同病理过程,因此发现可以抑制肾脏纤维化机制的物质至关重要。本研究发现 GAS5 在肾脏纤维化中表达下降,且可抑制细胞外基质蛋白的表达。进一步的机制研究结果提示 GAS5 上调 miR-29 的表达,并升高其靶基因CTR1 的表达;而 GAS5 下调 miR-21 的表达,但是不影响后者靶基因 ATP7a 的表达。肾脏纤维化的发病机制至今尚未完全明确。目前认为肾脏纤维化主要与以下 5 个方面有关:(1)ECM的合成与降解失衡,肾间质 ECM 过度堆积;(2)肾损伤启动炎症反应,炎症细胞浸润增加;(3)细胞释放大量纤维化相关细胞因子,如转化生长因子(transforming growth factor-,TGF-)等;(4)肾脏固有细胞表型发生间充质转变,固有细胞数量减少;(5)肾脏微血管病变13。探索肾脏纤维化的发生发展机制,并从中寻找治疗靶点成为预防和治疗慢性肾衰竭最关键的科学问题。人类基因中超过 97%为非编码序列。哺乳动物基因组中,4%9%的转录本为 LncRNA,而相应的蛋白编码 RNA 的比例为 1%。随着越来越多的LncRNAs 被发现,有更多证据表明 LncRNAs 与肾脏纤维化的发生发展密切相关。在 3 种常用的肾脏疾病大鼠模型:Dahl 盐敏感性大鼠、自发性高血压大鼠和 Dahl 盐抵抗性大鼠模型中,发现 3 273 种LncRNAs 在肾脏组织中表达;进一步通路分析提示,这些 LncRNAs 参与的途径十分广泛,包括:分泌机制(唾液与胆汁分泌)、脂肪酸代谢、免疫功能、蛋白消化和吸收等14。有学者利用全转录组 RNA测序检测 UUO 诱导的梗阻性肾病模型和免疫介导的抗肾小球基底膜肾小球肾炎模型中 LncRNAs 的表达,发现 Smad3 基因敲除小鼠模型中与肾脏炎症和纤维化相关的差异表达 LncRNAs15。GAS5 是一种含有许多小核糖核酸的长链非编码 RNA,最初是从小鼠 NIH3T3 细胞分离纯化后鉴定出来。在肿瘤领域,GAS5 被确定为一种肿瘤抑制因子。许多研究发现,GAS5 在不同类型的肿瘤细胞系中表达下调16-19。本研究在细胞、动物和临床样本 3 个不同的水平观察到,GAS5 在肾脏纤维化中的表达水平均一致性下调,而过表达 GAS5 可抑制肾小管上皮细胞 ECM 蛋白合成,进而抑制肾脏纤维化。本研究结果表明,肾脏纤维化中 GAS5的下调可能是 ECM 沉积和肾脏纤维化进展的关键因素之一,而外源性上调 GAS5 可抑制肾脏纤维化,这可能为探索肾脏纤维化、慢性肾衰竭早期治疗的提供新的靶点。铜离子是机体代谢过程中多种重要催化酶的必需辅基。有学者在肾脏纤维化模型中观察到铜离子过载,同时应用铜螯合剂可延缓肾脏纤维化的发生发展,提示了铜离子在肾脏纤维化进展过程中的重要作用12。GAS5 负向调控肾脏纤维化的机制研究发现994 第 4 期余 莹 等:长链非编码 RNA-GAS5 靶向 miR-29 下调铜转运蛋白 CTR1 抑制肾脏纤维化的机制研究GAS5 可调节多种 miRNA 的表达,其中 miR-29 和miR-21 引起研究者的关注,miR-29 和 miR-21 都是参与肾脏纤维化的重要 miRNA20-21。本研究观察到在肾小管上皮细胞中过表达 GAS5 能够显著增加miR-29 的表达,同时可降低 miR-21 的表达。本课题组通过 microRNA.org-Targets and Expression、TargetScanHuman 7.2 等生物学网站寻找 miR-29 和miR-21 下游靶基因,尤其关注与铜离子相关的蛋白,发现:miR-29 和 miR-21 的潜在靶基因分别可能为CTR1 和 ATP7a,而 CTR1 和 ATP7a 均为铜离子转运蛋白。生理状态下,细胞内铜离子的浓度处于动态平衡的状态,依赖一系列特定蛋白的维持11。其中铜转运蛋白 1(CTR1)负责将铜离子从细胞外向细胞内转运,ATP7a 则负责将铜离子转运到细胞外。本实验观察到 miR-29 不影响 CTR1 的 mRNA表达,但是过表达 miR-29 降低 CTR1 的蛋白表达水平,荧光素酶实验证实 miR-29 通过结合于 CTR1 的3UTR 区,在转录后水平抑制 CTR1 的表达。亦即,GAS5 在不影响 CTR1 mRNA 表达的情况下,抑制CTR1 蛋白的表达。相似的,miR-21 在转录后水平抑制 ATP7a 的表达,但是 GAS5 不影响 ATP7a 在mRNA 和蛋白水平的表达。这提示外源性过表达GAS5 可能是干预肾脏纤维化的潜在策略。如图 8所示,lncRNA-GAS5 的竞争性内源 RNA(ceRNA)机制可能在当中发挥重要作用,结合 TargetScan 网站的预测结果,GAS5 通过碱基互补配对原则,吸附了 miR-29,削弱了 miR-29 对 CTR1 mRNA 翻译的抑制作用。当外源性过表达 lncRNA-GAS5 时,通过上述机制抑制铜转运蛋白 CTR1 表达,进而减少铜离子向细胞内转运,使胞内铜离子积聚降低,最终抑制肾脏纤维化进展。图 8 GAS5 抑制肾脏纤维化的作用示意图Fig.8 Schematic diagram of GAS5 inhibiting renal fibrosis【参考文献】1 ZHANG L X,WANG F,WANG L,et al.Prevalence of chronic kidney disease in China:a cross-sectional surveyJ.Lancet,2012,379(9818):815-822.2 CHEN W,CHEN W Q,WANG H,et al.Prevalence and risk factors associated with chronic kidney disease in an adult population from Southern ChinaJ.Neph-rol Dial Transplant,2009,24(4):1205-1212.3 LIU Z W,WANG Y,SHU S Q,et al.Non-coding RNAs in kidney injury and repairJ.Am J Physiol Cell Physiol,2019,317(2):C177-C188.4 GHAFOURI-FARD S,ABAK A,TALEBI S F,et al.Role of miRNA and lncRNAs in organ fibrosis and agingJ.Biomedecine Pharmacother,2021,143:112132.5 谢荷樱,王陶,赵倩,等.长链非编码 RNA CCAT2 在不同亚型乳腺癌的表达特征及亚结构分布J.同济大学学报(医学版),2022,43(5):611-617.6 SCHNEIDER C,KING R M,PHILIPSON L.Genes 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