多功能酶标仪.ppt

酶标仪的使用酶标仪的使用主要内容主要内容一、一、ELISA法介绍法介绍二、酶标仪和多功能酶标仪二、酶标仪和多功能酶标仪三、仪器操作三、仪器操作一、一、ELISA法介绍法介绍经典的化学分析方法（如滴定分析、重量分析、经典的化学分析方法（如滴定分析、重量分析、分光光度法）能对化学体系组分进行常量或微量分光光度法）能对化学体系组分进行常量或微量分析，而对复杂生物体系的微量成分的测定往往分析，而对复杂生物体系的微量成分的测定往往力不从心。力不从心。在此背景下，科学家研发了一系列测定生物体系在此背景下，科学家研发了一系列测定生物体系成分含量的方法，其中免疫化学法（如酶联免疫成分含量的方法，其中免疫化学法（如酶联免疫法、免疫荧光法、放射免疫法）因具有高特异性、法、免疫荧光法、放射免疫法）因具有高特异性、超微量分析生物体有机成分的特点而得到迅速推超微量分析生物体有机成分的特点而得到迅速推广和发展。广和发展。1971年人们建立了用年人们建立了用酶来标记抗原或抗体酶来标记抗原或抗体的的分析技术，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分析技术，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，并进行定量，这种技术被称分钟后就可被识别出来，并进行定量，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法，简称为酶联免疫吸附试验法，简称ELISA。（E Enzyme-L Linked I Immuno-S Sorbent A Assay）酶联免疫法的专用仪器就是酶标仪。酶联免疫法的专用仪器就是酶标仪。分析原理酶标仪的分析原理与分光光度法一样，服从朗伯比尔酶标仪的分析原理与分光光度法一样，服从朗伯比尔定律。物质的含量与显色液的颜色深浅成正比，而颜定律。物质的含量与显色液的颜色深浅成正比，而颜色深浅可用吸光度表示，所以物质的含量与吸光度值色深浅可用吸光度表示，所以物质的含量与吸光度值成正比。成正比。酶标记抗原或者抗体发生免疫学反应后，与底物的结酶标记抗原或者抗体发生免疫学反应后，与底物的结合物，在特定波长下有最大吸收，可通过测定显色液合物，在特定波长下有最大吸收，可通过测定显色液的吸光度对待测物进行定量。的吸光度对待测物进行定量。ELISA法知识1.1.免疫学知识免疫学知识2.2.常用的常用的ELISA分析分析3.3.ELISA 应用应用1.免疫学知识什么是抗体？什么是抗体？什么是抗原？什么是抗原？什么是抗原抗体反应？什么是抗原抗体反应？什么是抗体(Antibody)？抗体是机体受抗体是机体受抗原抗原抗原抗原刺激后，在体液中出现的一种刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)。人类免疫球蛋白有五类，即人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和和IgE。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。免疫球蛋白免疫球蛋白（Ig）免疫球蛋白（免疫球蛋白（Ig）是机体受抗原刺激后产生的，其是机体受抗原刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物。抗体复合物。可以阻断病原体对机体的危害，也可以引起过敏反应可以阻断病原体对机体的危害，也可以引起过敏反应或其他有害反应。或其他有害反应。免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构免疫球蛋白都是大分子的物质，轻链和重链，免疫球蛋白都是大分子的物质，轻链和重链，且具有抗原结合的部位。且具有抗原结合的部位。什么是抗原什么是抗原(Antigen)？凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性这种特性称为抗原性。抗原的物质可以是机抗原的物质可以是机体自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。体自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。也有外来的抗原（如病毒、污染物）。也有外来的抗原（如病毒、污染物）。抗原的特异性抗原的特异性 各种抗原物质的化学组成虽然很复杂，但能刺各种抗原物质的化学组成虽然很复杂，但能刺激机体产生抗体并与抗体反应相结合的化学组成，激机体产生抗体并与抗体反应相结合的化学组成，仅仅是仅仅是抗原物质表面抗原物质表面抗原物质表面抗原物质表面的一些具有活性的化学基团、的一些具有活性的化学基团、化学结构及空间构型，被称为化学结构及空间构型，被称为抗原物质决定簇抗原物质决定簇抗原物质决定簇抗原物质决定簇。分子结构的差异性，决定各种物质分子结构的差异性，决定各种物质抗原的特异性抗原的特异性抗原的特异性抗原的特异性。抗原抗体反应抗原抗体反应 抗原与抗体的反应统称为免疫学反应。在体内进抗原与抗体的反应统称为免疫学反应。在体内进行的抗原抗体反应称为免疫反应，在体外进行的抗行的抗原抗体反应称为免疫反应，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应。原抗体反应称为血清学反应。没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体可以检测抗原物质。可以检测抗原物质。ELISA法特点法特点ELISA法是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，法是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有因而，具有特异性特异性特异性特异性。由于测定中需要酶标记抗原或抗体，酶分子与抗原或由于测定中需要酶标记抗原或抗体，酶分子与抗原或抗体分子的结合物可以催化底物分子发生反应，产生抗体分子的结合物可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性敏感性敏感性敏感性。2.常用的ELISA分析1).测定抗原测定抗原2).测定抗体测定抗体(1)(1)测定抗原测定抗原A将将抗体抗体抗体抗体吸附于固相表面，这个过程叫包被。吸附于固相表面，这个过程叫包被。B 加抗原，形成抗原加抗原，形成抗原-抗体复合物。抗体复合物。C 加加酶标抗体酶标抗体酶标抗体酶标抗体。D 加酶反应的底物。反应终止时，反应液的颜色深浅与抗加酶反应的底物。反应终止时，反应液的颜色深浅与抗原的含量成正比。原的含量成正比。主要步骤主要步骤1.包被抗体包被抗体包被抗体包被抗体的酶标板（一抗）。的酶标板（一抗）。2.加待测抗原。抗原抗体反应，洗涤。加待测抗原。抗原抗体反应，洗涤。3.加酶标抗体（二抗）。反应，洗涤。加酶标抗体（二抗）。反应，洗涤。4.加显色底物（三抗），反应，洗涤。加显色底物（三抗），反应，洗涤。5.加终止液。加终止液。6.酶标仪上读取吸光度值。酶标仪上读取吸光度值。7.根据标准曲线对待测抗原进行定量。根据标准曲线对待测抗原进行定量。(2)(2)测定抗体测定抗体A 抗原包被抗原包被抗原包被抗原包被在酶标板。在酶标板。B 加抗体，形成抗原抗体复合物。加抗体，形成抗原抗体复合物。C 加酶标抗体（一抗）加酶标抗体（一抗）D 加酶底物（二抗），显色，比色。加酶底物（二抗），显色，比色。ABCD3.ELISA方法的应用方法的应用 原则上原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用中它和医学、生物化学、免疫学、微生在实际应用中它和医学、生物化学、免疫学、微生物学、药理学、环境学等方面密切相关。物学、药理学、环境学等方面密切相关。举例医学方面：肿瘤研究中检测甲胎蛋白；检测过敏原；医学方面：肿瘤研究中检测甲胎蛋白；检测过敏原；检测血清中白蛋白及免疫球蛋白；传染病诊断中检查检测血清中白蛋白及免疫球蛋白；传染病诊断中检查乙型肝炎表面抗原。乙型肝炎表面抗原。环境科学方面：测定污染物抗原干预下生长因子、细环境科学方面：测定污染物抗原干预下生长因子、细胞因子、酶的变化。胞因子、酶的变化。其他：植物组织浆液中检查植物病毒；普通比色分析。其他：植物组织浆液中检查植物病毒；普通比色分析。二、酶标仪和多功能酶标仪二、酶标仪和多功能酶标仪1.普通酶标仪普通酶标仪2.多功能酶标仪多功能酶标仪1.普通酶标仪普通酶标仪即酶联免疫检测仪即酶联免疫检测仪(ELISAReader）Bio-RadModel5504万元万元光源光源光电检测器光电检测器电信号经前置放大、对电信号经前置放大、对数放大、模数转换等数放大、模数转换等滤光片滤光片或单色器或单色器酶标仪结构及原理光源：钨灯光源：钨灯滤光片：常用的波长范围：滤光片：常用的波长范围：405nm450nm(四甲基联苯胺四甲基联苯胺)490nm(邻苯二胺邻苯二胺)630nm单色器：可调节波长的光单色器：可调节波长的光比色装置：比色装置：聚苯乙烯塑料微孔板：聚苯乙烯塑料微孔板：96孔孔光电检测器光电检测器酶标仪与光度计的区别波长：波长：4 4-6个个比色装置：酶标板，非比色杯比色装置：酶标板，非比色杯光路：垂直光路：垂直功能：不能波长扫描；只在固定波长的可见光范围测功能：不能波长扫描；只在固定波长的可见光范围测定；可对化学物及生命组分进行终点分析。定；可对化学物及生命组分进行终点分析。酶标仪的应用普通酶标仪基本功能有普通酶标仪基本功能有2个：个：（1）相当于分光光度计：测定化合物含量或者细胞存）相当于分光光度计：测定化合物含量或者细胞存活率等。活率等。（2）基于免疫反应的）基于免疫反应的ELISA分析。分析。新型的多功能酶标仪价格在新型的多功能酶标仪价格在20-50万元，分析功能得到万元，分析功能得到广泛拓展，这对酶标仪的应用有深刻的意义。广泛拓展，这对酶标仪的应用有深刻的意义。ELISA的局限性的局限性世界卫生组织专家组提出对世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：的评价认为：“ELISA作为免疫诊断应用是一个好办法，但要作为免疫诊断应用是一个好办法，但要做好它不容易。做好它不容易。”1.1.对对ELISA法的非特异性评价的资料尚不够完法的非特异性评价的资料尚不够完善，因此，对出现一些非特异性反应的时候，善，因此，对出现一些非特异性反应的时候，往往不易解释。往往不易解释。2.2.固相载体的质量常不统一，主要是原料及制固相载体的质量常不统一，主要是原料及制备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验结果。结果。3.3.试剂不统一，现在处于试剂不统一，现在处于“八仙过海，各显神八仙过海，各显神通通”，标准还不能统一。，标准还不能统一。2.多功能酶标仪Thermo公司全公司全波长多功能酶波长多功能酶标仪标仪50多万元多万元多功能酶标仪的特点1.1.比色杯或者微孔板（比色杯或者微孔板（6 6、1212、2424、4848、9696和和384384孔微孔微孔板孔板 ）,测样量大测样量大 ；2.200-1000 2.200-1000 nm，有紫外可见光、荧光、偏振光等有紫外可见光、荧光、偏振光等,波长变化可达到波长变化可达到1nm,只要是有色溶液即可测定吸光只要是有色溶液即可测定吸光度；度；3.3.可可提供终点检测、动力学、单孔扫描和光谱扫描等提供终点检测、动力学、单孔扫描和光谱扫描等测读模式测读模式 ；4.4.分析功能扩大。分析功能扩大。多功能酶标仪的实验应用举例 DNA/RNADNA/RNA定量和纯度检测定量和纯度检测定量和纯度检测定量和纯度检测 Bradford/LowryBradford/Lowry实验实验实验实验 细胞活性细胞活性细胞活性细胞活性/细胞毒性检测细胞毒性检测细胞毒性检测细胞毒性检测 MTTMTT分析分析分析分析 （IC50/LD50）细菌生长分析细菌生长分析细菌生长分析细菌生长分析 钙流检测钙流检测钙流检测钙流检测 膜电位检测膜电位检测膜电位检测膜电位检测 双荧光素酶报告基因分析双荧光素酶报告基因分析双荧光素酶报告基因分析双荧光素酶报告基因分析 多功能酶标仪的实验应用 ATPATP检测检测检测检测 微生物生长微生物生长 绿荧光蛋白分析绿荧光蛋白分析 药代毒性分析药代毒性分析 膜渗透分析膜渗透分析荧光偏振分析荧光偏振分析 三、酶标仪操作三、酶标仪操作 1.注意事项注意事项 2.酶标板酶标板 3.操作要点操作要点1.注意事项1）反复研读）反复研读试剂盒试剂盒说明，熟悉操作步骤。说明，熟悉操作步骤。2）加样的准确性。操作中须注意显色剂和终止的加量）加样的准确性。操作中须注意显色剂和终止的加量准确，最好使用加样枪加液以保证比色时吸光度的准准确，最好使用加样枪加液以保证比色时吸光度的准确性。枪头不要混用。确性。枪头不要混用。3）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码洗涤）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码洗涤5次，切次，切要把残液甩干。要把残液甩干。4 4）观察和判读吸光度结果应在）观察和判读吸光度结果应在1515min 内完成，否则液体内完成，否则液体颜色会减退。颜色会减退。5 5）待测生物样品要放在）待测生物样品要放在44冰浴上。冰浴上。6 6）显色液要现用现配，避光低温保存）显色液要现用现配，避光低温保存 。7 7）注意购买抗体的保存。）注意购买抗体的保存。2.2.酶标板酶标板酶标板材料酶标板材料可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚丙烯、聚苯乙烯聚苯乙烯、聚乙烯及、聚乙烯及聚氯乙烯聚氯乙烯等等。但在等等。但在ELISA中最常用的是中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应微量反应板。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适板。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。合于大规模应用。酶标板材料酶标板材料国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结测定，并且获得了满意的结果。但果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。酶标板鉴定酶标板鉴定 对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板抽样，用定的方法和标准是对每批购置的微量反应板抽样，用检测试剂盒进行试验，当显色并终止反应后，在酶标检测试剂盒进行试验，当显色并终止反应后，在酶标比色计中测定其比色计中测定其O.D值。值。一般认为全板中每两孔间一般认为全板中每两孔间O.D值的误差不超过值的误差不超过10%10%为合为合格。如果中间孔与四周孔格。如果中间孔与四周孔O.D值相差太大，或者反应值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的板的这一边与另一边凹孔的O.D值相差大，均不合格。值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清此外，还要检查阳性和阴性参考血清O.D值是否有明值是否有明显差别。一般要求有显差别。一般要求有1010倍左右的差异为合格。倍左右的差异为合格。酶标仪单、双波长检测酶标仪单、双波长检测 一般的酶标仪在测定中均有单波长和双波长的模式，一般的酶标仪在测定中均有单波长和双波长的模式，为什么呢？为什么呢？酶标仪是垂直光路，受被测样本液面是否水平、酶标酶标仪是垂直光路，受被测样本液面是否水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的影响较大。板透光性、孔底是否平整等的影响较大。选择选择 630 630nm为参比波长为参比波长,测定其吸光度测定其吸光度A0;在测定波长在测定波长（如（如49490nm/450nm）下测定样本的吸光度下测定样本的吸光度A,双波长测定双波长测定后后,取二者的差值取二者的差值,测定结果的标准偏差比单波长下测测定结果的标准偏差比单波长下测定的要小定的要小,实验误差小。实验误差小。在在ELISA测测定定所所使使用用的的底底物物如如邻邻苯苯二二胺胺或或四四甲甲基基联联苯苯胺胺，显显色色终终止止后后，在在 630630nm处处的的吸吸光光度度值值都都只只有有吸吸收收峰峰处处（49490nm/450nm）吸吸光光度度值值的的1%1%以以下下，因因此，利用双波长检测，不会影响检测灵敏度。此，利用双波长检测，不会影响检测灵敏度。一般酶标仪比色应该首选双波长。一般酶标仪比色应该首选双波长。酶标仪的工作环境酶标仪的工作环境1.仪器应放置在无强磁场和干扰电压的位置。仪器应放置在无强磁场和干扰电压的位置。2 2.仪器应放置在噪音低于仪器应放置在噪音低于4040分贝的环境下。分贝的环境下。3.为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。4.操操作作环环境境温温度度应应在在151540之之间间，环环境境湿湿度度在在15%85%15%85%之间。之间。5.操作时电压应保持稳定。操作时电压应保持稳定。6.操作环境空气清洁，避免水汽、烟尘。操作环境空气清洁，避免水汽、烟尘。7.保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。的操作空间。3.Bio-Rad Model 550酶标仪操作酶标仪操作1.接通电源，打开酶标仪开关。接通电源，打开酶标仪开关。2.仪器开始自检。仪器开始自检。Selfdisgonsisinprogress3.按箭头光标到按箭头光标到Mode,设置参数。当仪器出设置参数。当仪器出现现setanalysismode时，按时，按enter确定。确定。4.选择测定波长的类型。按箭头光标到选择测定波长的类型。按箭头光标到D/S,按按select选中，选中，enter确定。光标出确定。光标出现在现在Dual/Single，选择双波长，按选择双波长，按select选中，选中，enter确定。确定。5.5.选择滤光波长，此酶标仪有四个波长：选择滤光波长，此酶标仪有四个波长：1 1：405405nm;2:450nm;3:490nm;4:630nm。按箭头光标按箭头光标到到Filt,按按select选中，选中，enter 确定。光标出确定。光标出现在现在Mes=#X Ref=#Y，如按光标选择数字如按光标选择数字3 3，即即490490nm的测定波长的测定波长,enter确定。再按确定。再按Next,到到Ref,按光标选择参考波长，如选数字按光标选择参考波长，如选数字4.4.即为即为630630nm，enter 确定。确定。6.6.选择是否混合。按箭头光标到选择是否混合。按箭头光标到Mix,按按select选中，选中，enter 确定。光标出现在确定。光标出现在yes/No，如光标选择如光标选择No，按按select选中选中,enter 确定，说明样品不混合。确定，说明样品不混合。7.7.返回原显示，返回原显示，set analysis 的的D/S FiltMix,按按enter出现出现set analysis的的Mode。说明仪器已经到达测试状态。说明仪器已经到达测试状态。8.8.推开测定盖，将酶标板小心正确放到测定槽推开测定盖，将酶标板小心正确放到测定槽内，合住盖。内，合住盖。9.9.上好酶标仪专用的光敏打印纸。上好酶标仪专用的光敏打印纸。10.10.按按Start，开始测量吸光度，并自动打印测开始测量吸光度，并自动打印测定结果。定结果。11.11.测定完成后，取出酶标板，合上盖，关仪器测定完成后，取出酶标板，合上盖，关仪器开关和电源，盖上防尘罩。开关和电源，盖上防尘罩。4.Thermo多功能酶标仪的操作1.1.开机，点击开机，点击 SkanIt RE for Varioskan flash2.4.3,进入分析系统；进入分析系统；2.2.选择选择new session;name;next；3.3.选择酶标板，如选择酶标板，如96孔版；孔版；next；4.选定文件夹；设定测定方法，如波长；选定文件夹；设定测定方法，如波长；5.连接仪器连接仪器connect；放板（；放板（in）,save;点击点击excute session;开始读板，开始读板，Results,保存数据；保存数据；观察结果，记录或保存；观察结果，记录或保存；6.取板（取板（out）,断开连接断开连接disconnect,关机。关机。思考题思考题 普通酶标仪测定时为什么选择双波长测定？普通酶标仪测定时为什么选择双波长测定？ELISA法的原理是什么？法的原理是什么？普通酶标仪和紫外分光光度计有什么区别？普通酶标仪和紫外分光光度计有什么区别？