杂合抗菌肽NK-LPd的设计、表达及抑菌活性评价.pdf

刘子琦，刘正宇，郭银虹，等.杂合抗菌肽 NK-LPd 的设计、表达及抑菌活性评价 J.食品工业科技，2023，44（18）：173180.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100277LIU Ziqi,LIU Zhengyu,GUO Yinhong,et al.Design,Expression and Evaluation of Bacteriostatic Activity of Hybrid AntimicrobialPeptide NK-LPdJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):173180.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100277 生物工程 杂合抗菌杂合抗菌肽肽 NK-LPd 的设计、表达及的设计、表达及抑菌活性评价抑菌活性评价刘子琦1，刘正宇1，郭银虹1，王鸿飞1，姚波1,2,*（1.重庆科技学院化学化工学院，重庆 401331；2.工业发酵微生物重庆市重点实验室，重庆 401331）摘要：目的：了解杂合抗菌肽 NK-LPd 的抑菌活性，探讨进一步开发潜力。方法：用两个甘氨酸作接头连接 NK-lysin 和 Piscidin 的活性片段，生物信息学技术预测杂合抗菌肽的理化性质和功能结构，根据毕赤酵母（Pichiapastoris）的密码子偏好性优化杂合抗菌肽 NK-LPd 基因序列，重叠延伸聚合酶链式反应（gene splicing by overlapextension polymerase chain reaction，SOE-PCR）扩增基因并与分泌型表达载体 pPIC9K 连接，通过化学法将其转化至毕赤酵母 KM71 感受态细胞中，经 0.5%甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽 NK-LPd，评价其抗菌活性。结果：成功构建了 KM71/pPIC9K-NK-LPd，经诱导表达 5 d 后上清液中获得了相对分子质量约 6 kDa 的表达产物，与预期大小相符；抗菌活性实验表明，NK-LPd 对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较强的抑菌活性，与母体肽相比，杂合抗菌肽 NK-LPd 的抑菌活性显著增强。结论：设计并在毕赤酵母 KM71 中分泌表达了杂合抗菌肽NK-LPd，其抑菌活性优于母体肽。本研究可为新型杂合抗菌肽的设计和生产提供技术参考。关键词：杂合抗菌肽，NK-LPd，设计，表达，抑菌活性评价本文网刊:中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18017308DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100277Design,ExpressionandEvaluationofBacteriostaticActivityofHybridAntimicrobialPeptideNK-LPdLIUZiqi1，LIUZhengyu1，GUOYinhong1，WANGHongfei1，YAOBo1,2,*（1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University ofScience and Technology,Chongqing 401331,China；2.Chongqing Municipal Key Laboratory of Fermentative Microbes,Chongqing 401331,China）Abstract：Objective:To reveal the bacteriostatic activity of hybrid antimicrobial peptide NK-LPd,and discuss its furtherexploitation potential.Methods:Two glycines were utilized as the linker to connect the active fragments of NK-lysin andPiscidin,and the physicochemical properties and functional structures of the hybrid antimicrobial peptides were predictedby bioinformatics.The hybrid antimicrobial peptide NK-LPd gene was optimized according to Pichia pastoris codonpreference principle.The optimized gene was amplified by gene splicing via overlap extension polymerase chain reaction(gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR)and inserted into the secretory expression vectorpPIC9K.The recombinant plasmid was chemically transformed into P.pastoris KM71 competent cells.The recombinantexpression was induced by 0.5%methanol as the inducer,which products were purified by affinity purification and its 收稿日期：20221101 基金项目：重庆市技术创新与应用发展专项面上项目（CSTB2022TIAD-LDX0006）；重庆科技学院研究生科技创新计划项目（YKJCX2020528，YKJCX2220514）。作者简介：刘子琦（1998），女，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail：。*通信作者：姚波（1977），男，博士，副教授，研究方向：遗传学，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 activity was evaluated.Results:KM71/pPIC9K-NK-LPd was successfully constructed.After expression for 5 days,anexpression product with a relative molecular mass of about 6 kDa was obtained in the supernatant,which was in line withthe expected size.Bacteriostatic activity experiments showed that NK-LPd had strong bacteriostatic activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria.Compared with the parent peptides,the bacteriostatic activity of NK-LPd wassignificantly enhanced.Conclusion:The hybrid antimicrobial peptide NK-LPd was designed and expressed in P.pastorisKM71,and its bacteriostatic activity was superior to that of the parent peptides.This study could provide technicalreference for the design and production of novel hybrid antimicrobial peptides.Keywords：hybrid peptide；NK-LPd；design；expression；evaluation of bacteriostatic activity 抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一类广泛存在于自然界中的多肽，是生物体先天免疫系统的重要组成部分，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用1。由于超级耐药菌的出现以及对抗生素的过度使用促进了 AMPs 研究发展，其在医药、食品、畜牧、农业和水产养殖等领域具有良好的应用前景2。AMPs 通过与细菌细胞膜相互作用，导致细胞膜损伤和细菌死亡，或是与细胞内蛋白质、核酸等物质相互作用使细菌死亡3。Piscidin 是一类最常见的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗真菌和抗病毒活性，但 Piscidin 家族抗菌肽分子质量较小且容易降解，导致表达产量低，成为其生产应用的主要瓶颈4。抗菌肽 NK-lysin 是一类由细胞毒性 T 淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有多功能的抗菌肽，其成熟肽具有六个保守的半胱氨酸以及一个 Saposin B 结构域5，而 NK-lysin 含有 7478个氨基酸残基，难以通过化学法或生物法合成，研究证实 NK-lysin 的短截肽也具有抗菌活性，甚至较母体肽的抗菌活性更强6。杂合抗菌肽是通过将两个或多个抗菌肽的部分序列重新组合形成一个新的杂合肽7。本研究采用杂合的方式，基于抗菌活性和结构之间的关系对银鲫（Carassius gibelio）的 NK-lysin和 Piscidin 进行优化改造，改善两亲性和疏水性以提高其对细菌的选择性和抗菌活性。应用生物信息学等方法获得 NK-lysin 和 Piscidin 的保守片段，采用甘氨酸接头连接得到杂合抗菌肽，利用重叠延伸聚合酶链式反应（gene splicing by overlap extensionpolymerase chain reaction，SOE-PCR）技术合成杂合肽基因 NK-LPd，在毕赤酵母 KM71 中表达，评价其抗菌活性，以期获得一种具有更高抗菌活性和更广抗菌谱的杂合抗菌肽，为制备新型抗菌药物、饲料添加剂或免疫增强剂提供理论基础和技术支持。1材料和方法 1.1材料与仪器银鲫（Carassius gibelio）购自大学城菜市场，饲养于本实验室养鱼箱；毕赤酵母菌株 KM71 购自上海瑞楚生物；表达载体 pPIC9K由重庆擎科生物提供；大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25923）、金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）、沙门氏菌（Salmonella enterica，ATCC 12022）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，ATCC 7966）由本实验室保存；柱式质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、酵母 RNA 提取试剂盒、DNA Marker A（25500 bp）均购自生工生物工程有限股份公司；限制性内切酶 EcoR I、Not I、Sac I-HF购自 NewEngland Business Services 公司；DL2000 DNA Mar-ker、DNA 连接试剂盒购自 TaKaRa 公司；低分子量预染蛋白 Marker购自 Thermo Scientific 公司；其他试剂均为国产分析纯。A200 型 PCR 扩增仪杭州朗基科学仪器有限公司；6132 型紫外可见分光光度计德国 Eppendorf公司；蛋白质电泳系统伯乐 Bio-Rad；1100/26M 凝胶成像系统Quantum ST4；ZQTY-70N 型恒温振荡培养箱上海知楚仪器有限公司；LC5090 高效液相色谱系统浙江福立分析仪器股份有限公司。1.2实验方法 1.2.1 杂合肽的设计取银鲫（Carassius gibelio）的NK-lysin 氨基酸序列（XP_052436046.1）与 NKL-248氨基酸序列进行比对，获得同源部分，从 NCBI 数据库中收集 Piscidin 家族的氨基酸序列进行序列比对，获得保守序列，再用两个甘氨酸（GG）作接头将两个片段连接得杂合肽序列。1.2.2 生物信息学分析利用 Expasy 中的在线服务器 Prot Param 分析杂合抗菌肽 NK-LPd 的理化性质，Prot Scale 预测杂合肽 NK-LPd 的亲水、疏水性，Helical Wheel Projections 绘制杂合肽 NK-LPd 的三维螺旋轮图，在线服务器 SOPM Secondary StructurePrediction 预测杂合肽 NK-LPd 的二级结构，I-TASS-ER9预测 NK-LPd 的三级结构。1.2.3 目的基因片段的合成为了使表达后的抗菌肽具有天然的 N 端，在杂合肽序列 N 端加上 Kex2蛋白酶裂解位点，在 C 端加上 6His 标签便于后续纯化。参照毕赤酵母偏好性密码子翻译得到优化后的核苷酸序列，在杂合抗菌肽核苷酸序列的 5端加上 EcoR 酶切位点，在 3端加上终止密码子（TAA）和 Not 酶切位点。根据其序列设计 4 条引物 NL 1、NL 2 和 NL 3、NL 4（表 1）两两互为模板，采用 SOE-PCR（两次 PCR，第一次 PCR 的产物作为第二次 PCR的模板）的方法合成目的基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。174 食品工业科技2023 年 9 月表 1 SOE-PCR 使用的引物序列Table 1 The sequences of primers used in SOE-PCR引物名称序列Tm值（）NL-1CGGAATTCAAAAGACACCACATCTTCAGAGGTATCGTTCACGGTGGTATC69NL-2CCGATCTCGTCACAGATCATACCCAACTTGATCTTGATACCACCGTGAACGATACC71NL-3GGGTATGATCTGTGACGAGATCGGTTTCTTGAAGTCCATGTGTAGAAACTTGG70NL-4ATTCGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTAACCAAGTTTCTACACATGGAC75 1.2.4 pPIC9K-NK-LPd 表达载体的构建将获得的 PCR 产物和质粒 pPIC9K DNA 分别用限制性内切酶 EcoR I 和 Not I 进行双酶切，利用 DNA 凝胶回收试剂盒回收相应目的片段然后用 T4 DNA 连接酶连接，得到重组质粒 pPIC9K-NK-LPd，用重组的质粒转化大肠杆菌感受态细胞 DH5，用含 Amp 的 LB平板筛选获得阳性克隆。将阳性克隆送测序鉴定。1.2.5 毕赤酵母 KM71 的转化及筛选用含有氨苄青霉素 LB 培养液过夜培养，提取质粒，Sac I-HF 酶切线性化后转化入毕赤酵母 KM71。用不含组氨酸的 MD 平板筛选后，加 1 mL 无菌水重悬转化子，将菌液依次涂布于 G418 浓度为 1.0、2.0、3.0 mg/mL的 YPD 平板上筛选高拷贝酵母转化子。使用载体的引物 5AOX 和 3AOX，PCR 检测获得阳性重组菌株 KM71/pPIC9K-NK-LPd，空载体转化的酵母菌株作为阴性对照。1.2.6 酵母菌的 RT-PCR取重组酵母菌液，用酵母菌 RNA 提取试剂盒提取重组酵母 RNA，由反转录为 cDNA 第 1 条链，以此为模板，用特异性引物 NL1 和 3AOX 进行 RT-PCR 扩增。反应条件：预变性94 3 min，变性 94 30 s，退火 60 30 s，延伸72 30 s，循环数 35，4 10。1.2.7 重组酵母的诱导表达挑取筛选获得的高拷贝酵母转化子，接种于 YPD 培养基中培养过夜。取1 mL 菌液接种于 100 mL BMGY 培养基中，振荡培养至 OD600=26，离心，收集菌体，弃上清，用灭菌水清洗菌体沉淀，离心，弃上清。用 20 mL BMMY 培养液重悬菌体沉淀，转入锥形瓶振荡培养，用 100%甲醇诱导表达，每隔 24 h 加一次甲醇至终浓度仍为0.5%，诱导表达 5 d 后，12000 r/min，10 min 离心收集上清，使用 TCA 法浓缩蛋白，用于 Tricine-SDS-PAGE 检测。1.2.8 重组杂合肽的纯化将上清液与等体积 BindingBuffer（5 mmol/L 咪唑）混合后上柱，使用 15 倍柱体积的 Binding Buffer 冲洗层析柱，洗去杂蛋白，然后使用 Eluent Buffer（25 mmol/L 咪唑）冲洗层析柱，直至收集的洗脱液在 280 nm 处的吸光度接近基线，收集洗脱液，将纯化后的蛋白进行 HPLC 鉴定。1.2.9 HPLC 条件本实验采用液相色谱柱为 C18柱（4.6250 mm5 m），Pump A：含 0.1%三氟乙酸的水，Pump B：含 0.1%三氟乙酸的乙腈，流速控制为1 mL/min，保持色谱柱温度为 32，进样量：40 L，波长：214 nm11。1.2.10 重组杂合肽的抗菌活性评价采用琼脂糖扩散法初步测定重组表达产物的抗菌活性及抗菌谱12。选择大肠杆菌、金黄葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌作为供试菌。用液体培养基将菌稀释至 1106 CFU/mL，按照 1%的比例接种至固体培养基中，混匀后倾注平板。待平板冷却后，用灭菌的打孔器打孔，向孔中加入 100 L 纯化后的抗菌肽溶液，37 培养过夜后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小。实验重复三次，取平均值。1.3数据处理全部数据用 Excel 2019 计算平均值和标准偏差，使用 Origin 9.0 软件作图。所有实验检测均重复 3 次。2结果与分析 2.1杂合抗菌肽的设计NK-lysin 序列比对结果如图 1 所示，获得同源部 分：IKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN。再 从NCBI 数据库中收集 Piscidin 家族的氨基酸序列进行序列比对，Piscidin 序列比对结果如图 2，获得保守序列：HHIFRGIVH。再采用两个甘氨酸接头（GG，以方框表示）将两个片段连接得到杂合肽序列：HHIFRGIVHGGIKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN。Score42.6 bits(93)QuerySbjct1712494Expect2e-11Identities15/24(63%)Positives17/24(70%)Gaps0/24(0%)图 1 NK-lysin 序列比对结果Fig.1 NK-lysin sequence alignment results 2.2杂合抗菌肽 NK-LPd 的生物信息学分析杂合抗菌肽的理化性质如表 2 所示，预期分子量为 3950.80 Da，理论等电点为 9.39，理化性质较稳定。由螺旋轮图 3b 和疏水性图 3a 可知，杂合肽 NK-LPd 包含 13 个亲水性氨基酸残基；11 个疏水性氨基酸；2 个带负电荷氨基酸残基；16 个正电荷的氨基酸残基。NK-LPd 的亲水性氨基酸和疏水性氨基酸大体分别位于螺旋轮的两侧，能形成明显的疏水界面和亲水界面，使其具有两亲性，且疏水性为 54%。杂合肽 NK-LPd 二级结构主要含有 螺旋结构，占整体结构的 85.71%。第 44 卷 第 18 期刘子琦，等：杂合抗菌肽 NK-LPd 的设计、表达及抑菌活性评价 175 20JN_ACLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment20J0_A2J0S_AXP_035533992.12MCU_AQ8UUGO.1P59906.1Q8UUG2.1QNV47924.1P0C006.12MCW_AAPQ32046.1QNV47926.1图 2 Piscidin 序列比对结果Fig.2 Piscidin sequence alignment results 表 2 杂合抗菌肽 NK-LPd 理化性质分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of hybride antimicrobial peptide NK-LPd名称分子量（Da）等电点电荷数脂肪系数总水平疏水性不稳定指数半衰期NK-LPd3950.809.39负氨基酸残基数：2正氨基酸残基数：5116.860.40315.533.5 h（哺乳动物网织红细胞半衰期）10 min（酵母半衰期）10 h（大肠杆菌半衰期）1.6acdb1.41.21.00.80.6Score0.40.20.00.20.40.65101520Position255101520255101520253035ProtScale output for user_sequenceHphob./Kyte&DoolittleL33L26L16I19I12I23C30R5V34H1V8K15F4E22M29M18F25I7I3D21G10G17G6G24R31K13H2C20K27H94.57281.2N35S28I14N32G11图 3 NK-LPd 结构预测Fig.3 Structure prediction of NK-LPd注：a.亲疏水性分析结果：分值0 为疏水性，分值0 为亲水性；b.螺旋轮图；c.二级结构预测：h 代表-螺旋，t 代表转角，c 代表无规卷曲；d：I-TASSER 模拟三级结构。176 食品工业科技2023 年 9 月 2.3杂合抗菌肽 NK-LPd 的基因合成通过 SOE-PCR 的方法，设计 4 条引物经过两次 PCR 合成杂合抗菌肽的 NK-LPd 的目的基因。第一次 PCR 分别使用引物 NL 1、NL 2 和 NL 3、NL 4两两互为模板进行扩增得到延伸液 1 和延伸液 2。经 3.0%琼脂糖凝胶电泳检测，如图 4a 所示，分别在85 和 91 bp 处出现明显的条带，与预期大小符合。以第一次 PCR 获得的产物作为模板进行第二次 PCR，得到相应的目的基因，经 3.0%琼脂糖凝胶电泳检测如图 4b，得到单一条带大小为 152 bp，与目标条带大小相符，证明成功扩增得到目的基因。Mab400 bp500 bp400 bp300 bp200 bp150 bp100 bp75 bp50 bp25 bp300 bp200 bp150 bp100 bp75 bp1M12图 4 SOE-PCR 扩增 NK-LPd 基因Fig.4 SOE-PCR amplifies NK-LPd gene注：a：第一次 PCR 扩增：M：DL500 DNA Marker，1 为 91 bp的延伸液 2 基因片段，2 为 85 bp 的为延伸液 1 基因片段；b：第二次 PCR 扩增；M：DL500 DNA Marker，1 为 152 bp 的杂合抗菌肽 NK-LPd 目的基因。2.4重组质粒的构建从氨苄抗性平板上挑取 10 个长势较好单菌落作为模板，分别以 NL 1 和 NL 2 为引物进行菌落 PCR，经过 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测在 152 bp 处出现单一目标条带，与理论值相符，证明挑取的单克隆均为阳性克隆。将阳性克隆送擎科生物公司测序验证，证明基因片段 NK-LPd 成功连接至 pPIC9K 表达载体的多克隆位点，并且核苷酸序列未发生碱基突变，与预先设计的序列相同。2.5毕赤酵母的转化及筛选线性化的 pPIC9K-NK-LPd 通过原生质法转入毕赤酵母 KM71 感受态细胞中，全部涂布至 MD 培养基（His+缺陷型），4 d 后长出转化子。重悬转化子，将菌液依次涂布于 G418 浓度为 1.0、2.0、3.0 mg/mL的 YPD 平板上筛选高拷贝酵母转化子。以 3 AOX和 5 AOX 为引物进行酵母菌 PCR，1%琼脂糖电泳检测结果如图 5，除 9 号泳道外，其余阳性克隆扩增得到一条大小 620 bp 的清晰条带，空载体没有插入目标基因，得到条带大小为 494 bp。将阳性菌株提取总 RNA，通过 RT-PCR 验证目的基因的表达（图 6）。结果表明，重组表达质粒 pPIC9K-NK-LPd 已经成功转入酵母 KM71，并能够稳定表达。M2000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp12345678910 11 12 13图 5 重组毕赤酵母 PCR 鉴定Fig.5 Identification of recombinant P.pastoris by PCR注：M 为 DL2000 DNA Marker，112 为不同酵母转化子，13 为空载体转化的酵母。M500 bp400 bp300 bp200 bp150 bp100 bp75 bp50 bp25 bp1图 6 酵母 RT-PCR 结果Fig.6 RT-PCR result of P.pastoris注：M 为 DL500 DNA Marker，1 为 cDNA 扩增条带 255 bp。2.6NK-LPd 重组蛋白在毕赤酵母的表达及纯化选取阳性酵母转化子，在 0.5%甲醇浓度的条件下进行诱导表达 5 d 后，离心收集培养上清经 TCA kDa402515104.6M12345678图 7 杂合抗菌肽 NK-LPd 在毕赤酵母中的分泌表达Fig.7 Hybrid antimicrobial peptide NK-LPd secretedexpression in yeast Pichia pastoris注：M 为蛋白 Marker；1 为重组酵母转化子 KM71/pPIC9K 诱导上清液；28 为挑选的阳性转化子 KM71/pPIC9K-NK-LPd诱导表达上清液。第 44 卷 第 18 期刘子琦，等：杂合抗菌肽 NK-LPd 的设计、表达及抑菌活性评价 177 法浓缩之后进行 Tricine-SDS-PAGE 分析，如图 7 所示。酵母转化子的培养上清在 4.610 kDa 处有一个较明显的条带（黑色箭头所示），而空载体阴性对照的培养上清则无此条带，说明重组肽 NK-LPd 在酵母中成功表达。HPLC 结果如图 8，NK-LPd 的保留时间为 14.469 min，纯度 75.7%。250000.02.55.07.510.0时间(min)丰度(mV)12.5 15.0 17.5 20.0图 8 纯化的 NK-LPd 高效液相色谱分析结果Fig.8 Analytical results of purified NK-LPd by HPLC 2.7重组 NK-LPd 的抑菌活性评价重组 NK-LPd 对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌的抑菌圈直径如图 9。结果表明杂合肽 NK-LPd 对大肠杆菌（2.4020.11 cm）、金黄葡萄球菌（2.5800.13 cm）、沙门氏菌（1.9920.22 cm）、铜绿假单胞菌（2.1400.24 cm）和嗜水气单胞菌（2.6480.08 cm）均显示出良好的抑菌性。并且与母体肽相比，杂合肽 NK-LPd 对铜绿假单胞菌的抑菌活性介于 NK-lysin（2.2020.13 cm）和 Piscidin（1.8140.07 cm）之间，但对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、沙门氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌活性增强，尤其 NK-LPd 对嗜水气单胞菌的抑菌活性为 Piscidin 的两倍。因此，可以证明重组 NK-LPd 肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有明显的抑制作用，与母体肽相比抗菌活性增加。3讨论目前对于病原菌的治疗主要依靠抗生素，但抗生素的作用靶点单一导致大量的耐药菌的出现，已经成为临床感染管理的主要挑战13。抗菌肽在对抗各种病原微生物方面表现出显著的效果和优势，被认为是替代抗生素的理想候选者14。迄今为止，抗菌肽数据库（APD）已经储存了 3000 多种 AMP，包括抗菌、抗病毒、抗寄生虫等15。虽然已经有少数抗菌肽进入了临床阶段16，但天然的 AMP 存在溶血活性和细胞毒性等问题使其在实际生产应用中受到了严重限制。因此，需要对天然抗菌肽进行适当的改造使其更适合于应用。将不同的抗菌肽连接得到杂合抗菌肽是目前抗菌肽分子改造的主要手段之一。Al 等17利用 LL-37 和 BMAP-27 的序列开发了一个新的杂合肽 B1，具有选择性，细胞毒性降低并且对哺乳动物的溶血作用降低，抗菌活性和联合用药后毒性显著改善。对天然抗菌肽开展分子改造主要从 AMP 结构与功能的关系出发，AMP 的抗菌活性受到多种结构参数的影响18，如净电荷、两亲性、疏水性和结构倾向等。所有的参数都是相互关联的，因此在设计杂合肽的时候要考虑结构的改变对其功能的影响。AMP 的电荷数量与抗菌活性并不是单纯的线性相关，只有在一定的范围内才能提高抗菌活性，通常认为杂合肽的电荷在+3+8 之间较为合适19。疏水性决定着抗菌肽插入磷脂双分子层的程度，通常在 50%左右20。抗菌肽的两亲性使其具有独特的杀菌机制，亲水区域可以与细胞膜的磷脂分子的头部结合，而疏水区域与磷脂分子尾部相互作用。但完美的两亲性会降低 AMP的选择性，导致抗菌活性与细胞毒性同时增加21。本 0.0S.aureusP.aeruginosaSalmonellaA.hydrophilaE.coli0.51.01.52.02.53.0b抑菌圈直径(cm)NK-LPdNK-lysinPiscidin图 9 重组 NK-LPd 的抑菌活性测定Fig.9 Antibacterial activity of the recombinant NK-LPd注：a.抑菌圈图片；b.抑菌圈直径柱状图。aSalmonellaA.hydrophilaP.aeruginosaS.aureusE.coliNK-LPdNK-lysinPiscidin 178 食品工业科技2023 年 9 月研究中，对设计的杂合肽 NK-LPd 进行生物信息学分析发现，NK-LPd 的净电荷为 4.5，疏水性为 54%，绘制的螺旋轮图谱的亲水性氨基酸和疏水性氨基酸大体分别位于螺旋轮的两侧，不是完美的两亲性，但能形成明显的疏水界面和亲水界面。结构预测发现NK-LPd 主要含有 螺旋结构，占整体结构的 85.71%，通过 APD 预测有成为新型抗菌肽的可能。本研究选择的母体肽 Pisicidn 和 NK-lysin 具有不同的抗菌作用机制，Piscidin 通过环形孔机制破坏细菌细胞膜，-螺旋体插入膜的脂质之间，导致细胞破裂死亡22。而 NK-lysin 进入目标微生物的细胞质后与微生物核酸相互作用并导致细胞死亡23。Shan 等8发现斑马鱼 NK-lysin 的 24 个残基的截短肽，通过膜活性的细胞杀伤机制对副溶血性弧菌具有强大的抗菌作用并且可以提高非特异性免疫参数。鉴于 NK-lysin 和 Piscidin 具有不同的抗菌机制，为了获得抗菌活性更强，抗菌谱更广的抗菌肽，本研究基于杂合抗菌肽的设计思想，将银鲫 NK-lysin 和 NK-lysin 的短截肽 NKL-24 通过 NCBI 网站进行 Blastn 比对发现 NK-lysin 的 7194 氨基酸（IKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN）具有70%相似度，将 Piscidin 家族的氨基酸序列进行比对发现HHIFRGIVH 序列保守。为了使连接的片段具有正确的构象和生物学活性，选择合适的连接肽进行连接。但目前对于连接肽的研究较少，并没有明确的统一标准。连接肽中常用的氨基酸包括甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）等24，Gly 分子质量较小并且无侧链基团，作为连接肽柔软易弯折，不会影响连接肽的空间结构25。陈香君等26截取 LL-37 和HNP-1 的活性作用片段 KEKIGKEF 和 RIPACIA，经“-甘氨酸（Gly，G）甘氨酸（Gly，G）-”两两拼接，设计合成新型 LL-37 杂合肽能够显著抑制乳腺癌MCF-7 细胞的增殖、周期进展并促使其凋亡。Tonk等27测试了将 CopA3 和 Hp1090 与两个（InSco2）或六个（InSco6）甘氨酸残基的接头连接而产生的两种杂合肽的抗菌活性，发现杂合肽 InSco2 显示出比亲本 AMP 或 InSco6 更有效的杀菌活性。基于上述的研究报道，本研究选择两个 Gly 作连接肽将两个片段连接构建杂合抗菌肽，期望得到更高活性的杂合抗菌肽。由于抗菌肽本身具有抗菌作用，采用大肠杆菌表达系统会抑制其进一步表达。有研究表明，用毕赤酵母表达系统表达的抗菌肽的抗菌活性比大肠杆菌表达系统的产物抗菌活性强28。薛剑锋29分别用大肠杆菌和毕赤酵母表达了对虾素 Chp3、Chp5，原核表达的重组蛋白抑菌活性不高，而用毕赤酵母表达的重组蛋白的抑菌活性与从凡纳对虾和大西洋白对虾发现的天然对虾素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抑菌活性相似。这是因为毕赤酵母是真核表达系统，能够将翻译后的蛋白进行修饰加工，如添加二硫键等。由于母体肽 NK-lysin 的成熟肽具有6 个保守的半胱氨酸，能够形成 3 个二硫键，对其结构的稳定具有关键性的作用，这种结构与其抗菌活性密切相关30。为了使重组杂合肽具有正确的结构功能，本研究采用毕赤酵母表达系统中的真核表达载体 pPIC9K，利用甲醇调控启动子 AOX 1 使目标蛋白大量表达，将杂合抗菌肽 NK-LPd 的序列克隆在-factor 序列后实现目的蛋白的分泌表达。经过设计后杂合抗菌肽 NK-LPd 的空间结构、两亲性和疏水性等都发生了巨大的变化，本研究将杂合抗菌肽与杂合前的两种抗菌肽通过抑菌圈法进行抑菌活性比对。母体肽均由本实验室前期通过相同的方法进行毕赤酵母诱导表达获得。实验发现，杂合抗菌肽的抑菌活性显著增加，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有明显的抑制作用。这可能是由于两种抗菌肽的作用方式不同，位于 N 端的 Piscidin 通过环型孔作用方式破坏细菌的细胞膜，进入细胞后NK-lysin 与胞内目标成分结合加速了细胞的死亡。下一步我们将对其作用机制进行进一步分析验证。4结论本研究将 Piscidin 和 NK-lysin 的活性片段融合拼接成杂合抗菌肽，通过毕赤酵母 KM71 分泌表达获得重组杂合肽，纯化的杂合肽 NK-LPd 对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有明显的抑制作用。本研究设计了一种新型具有生物学活性的杂合肽 NK-LPd，能够代替抗生素在动物性食品中的使用，提高食品的安全性，在食品防护和动物饲料添加剂方面具有很好的应用前景。参考文献 1 SINHA R,SHUKLA P.Antimicrobial peptides:Recent in-sights on biotechnological interventions and future perspectivesJ.Protein and Peptide Letters，2019，26（2）：7987.2 GIANNAMARIA A,GABRIELE C.Antimicrobial peptides(AMPs):A patent review(2015-2020)J.Expert Opinion on Thera-peutic Patents，2020，30（12）：931947.3 LEI J,SUN L C,HUANG S Y,et al.The antimicrobial pep-tides and their potential clinical applicationsJ.American Journalof Translational Re