中性粒细胞胞外诱捕网在中枢神经系统感染的研究进展.pdf

Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解经部立神2023,39(3):355358中性粒细胞胞外诱捕网在中枢神经系统感染的研究进展李蓉，尹榕？，葛朝明1*（1.兰州大学第二医院神经内科，兰州7 30 0 30；2.甘肃省中心医院神经内科，兰州7 30 0 7 0）摘要中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由DNA-组蛋白复合物组成的细胞外网状结构，且由一组中性粒细胞颗粒蛋白装饰，如抗菌肽、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE）等。NETs在先天免疫反应中是把“双刃剑”，既有抗菌作用，也会造成机体免疫病理损伤。本文就NETs在中枢神经系统感染中的免疫病理作用、靶向治疗及目前研究存在的问题进行综述。关键词中性粒细胞胞外诱捕网；中枢神经系统感染；中枢神经系统结核D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.017中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellulartraps，NETs）是由DNA、组蛋白（H1、H 2 A、H 2 B、H 3和H4）和多种颗粒蛋白，如中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，M PO）、组织蛋白酶G、溶菌酶C和抗菌肽等组成的三维结构,NETs形成的过程称为中性粒细胞胞外诱捕网调零（neutrophilextracellulartra-posis,NETosis)。NET o s i s 是一种不同于细胞凋亡和坏死的死亡途径，它通过中性粒细胞固定病原体防止传播，并确保局部高浓度的抗菌药物降解毒力因子和杀死细菌，上述概念于2 0 0 4年首次提出2 。目前已研究的NETosis方式有两种：自杀式NETosis和活性NETosis，调节这两种细胞死亡的具体机制尚未完全阐明3。NETs在中枢神经系统感染中的研究刚起步,目前研究重点是NETs在疾病中的免疫病理损伤及针对NETs的靶向治疗。1.中性粒细胞胞外诱捕网凋零的分类1.1自杀性中性粒细胞胞外诱捕网调零中性粒细胞被佛波酯（phorbolmyristateacetate,PMA）等激活，核膜破裂，染色质进人细胞质，与胞质内颗粒蛋白酶结合，细胞发生去极化，染色质致密结构减少，形成NETs，随后NETs冲破细胞膜，释放入细胞外空间发挥作用，细胞死亡，整个过程发生较慢，持续约数小时,需依赖活性氧41.2活性中性粒细胞胞外诱捕网调零中性粒细胞被多种病原体或其产物激活，核膜破裂，染色质进人细胞质，染色质致密结构减少，随后，染色质通过小泡出芽的方式排出细胞外，同时，细胞质通过脱颗粒形式释放颗粒蛋白酶，失去致密结构的染色质与颗粒蛋白酶在细胞外结合形成NETs发挥作用，而不含有细胞核的中性粒细胞可继续存活并发挥吞噬等作用4。NETs的形成过程中,位于中性粒细胞核中的肽酰精氨酸脱氨酶4催化组蛋白H3瓜氨酸化,将必需的精氨酸残基转化为瓜氨酸，整个过程发生迅速，数分钟内完成，不需要氧化剂4,52.中性粒细胞胞外诱捕网在中枢神经系统感染中的作用2.1血脑屏障损伤及神经毒性研究发现，NETs与脑型症疾(cerebral malaria)血脑屏障完整性的破坏有关6 。脑型症疾中，受感染的红细胞破裂并释放尿酸钠（monosodiumurate，MSU)晶体,这些晶体可诱导NETs的形成7.8 ,重要的是，在感染疟原虫儿童的血管中发现了捕获寄生虫的NETs9。NETs纤维网的形成可能为血液中凝血级联反应激活提供了一个支架：NETs纤维网可以防止MSU晶体损伤内皮细胞；同时NETs纤维网也减少了器官血流灌注，情况严重时，可能发生弥散性血管内凝血6 。在NETs释放和血栓形成过程中，大量炎症因子释放,破坏血脑屏障完整性，导致脑型疮疾发生6.10 O2.2促进细菌性脑膜炎中细菌存活最近的一项研究首次在肺炎球菌脑膜炎患者脑脊液中发现了NETs,而在病毒性脑膜炎、神经系统莱姆病和蛛网膜下腔出血患者脑脊液中没有检测到NETs。从多种脑膜炎（肺炎球菌、脑膜炎球菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、口腔链球菌和表皮葡萄球菌）患者体内分离的人中性粒细胞体外培养显示，除单核细胞增生李斯特菌外，其余细菌均在1h内诱导了NETs。对肺炎球菌脑膜炎患者脑脊液进行蛋白组学分析，证实了多种NETs相关蛋白的存在，如多种组蛋白、MPO、NE、蛋白酶3、抗菌肽LL-37、基质金属蛋白酶9等 。Mohanty等 采用大鼠脑膜炎和体外模型基金项目：甘肃省自然科学基金（2 2 JR5RA720）；甘肃省科技计划临床医学研究中心建设项目（2 0 JR10FA663）；*通信作者：葛朝明电话：138 9 32 8 512 0，E-mail：138 9 32 8 512 0 16 3.c o m3562023年5月第39 卷第3期神经解部学杂志，进行了一系列实验以阐明NETs在脑膜炎发病机制中的作用,用DNA酶降解NETs,发现DNA酶显著清除了受影响器官（大脑、肺、脾脏)和血液中的细菌,同时在体外有中性粒细胞存在时降低了细菌的活力,经DNA酶处理的大鼠大脑中细菌的清除与白细胞介素-1（i n t e r l e u k i n,IL-1）水平降低相关，而上述这些作用可以被吞噬作用抑制剂、NADPH氧化酶和MPO的抑制剂所消除，进一步证实了吞噬作用和氧化应激在肺炎球菌脑膜炎中的杀菌机制。该研究也发现肺炎球菌脑膜炎感染期间脑脊液中NETs的形成可能对宿主反应有害，NETs通过保护肺炎球菌不被吞噬，促进肺炎球菌在大脑中的存活,而使用DNA酶降解NETs有助于增强大脑中细菌的清除。该研究也强调了肺炎球菌脑膜炎中各种炎症机制和NETs之间复杂的相互作用。Beiter等12 也观察到肺炎球菌被NETs捕获，但不能被杀死，这些观察结果与Tillet等13 进行的临床研究结果一致。与单独使用青霉素治疗相比,使用青霉素联合DNA酶治疗肺炎球菌脑膜炎患者的死亡率下降了2 5.5%。有几项研究表明，肺炎球菌可通过降解NET-DNA分泌的核酸酶或通过将带正电荷的D-丙氨酸合并到细胞表面的磷脂酸中,细菌可以排斥与NETs结合的阳离子抗菌肽，从而逃避NETs介导的杀伤，并使细菌进一步播散到其他器官12.1415。同时有研究发现，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也能够在NETs中存活16 2.3石破坏脑脊液循环脑脊液中的NETs可能改变脑脊液流体动力学,阻碍脑脊液循环,造成脑水肿17 。肺炎球菌脑膜炎诱发脑水肿的机制尚未完全阐明，多认为是中枢神经系统中常驻和循环的免疫细胞受到细菌中某些成分刺激后产生的炎症反应18 。近期,Chiara 等19 在肺炎球菌脑膜炎大鼠的小脑延髓池注射脑脊液示踪剂以评估脑部胶状淋巴系统的功能，发现流入脑实质和颈部淋巴结的脑脊液引流显著减少,脑脊液积聚，揭示了细菌性脑膜炎中脑水肿形成的一种新机制。而脑内NETs形成的同时，脑脊液转运显著减少，颈部淋巴结外排被抑制，通过DNA酶处理降解NETs，恢复了大鼠的脑部胶状淋巴系统运输，并消除了肺炎球菌大鼠脑重量的增加，提示脑水肿减轻，相比之下，头孢曲松治疗对恢复脑脊液循环没有影响192.4促进脑微血栓形成据统计，急性脑血栓形成在新型冠状病毒感染患者中并不少见,尤其是重症感染合并有脑血管危险因素的患者2 0 。近期有大量数据支持NETs参与新型冠状病毒感染的致病作用。NETs可以诱导巨噬细胞分泌IL-1，而IL-1在动脉血栓形成中增强了NETs的形成2 1,因此在严重的新型冠状病毒感染中,NETs和IL-1循环可能被激活,参与脑微血栓的形成3.中性粒细胞胞外诱捕网与中枢神经系统结核NETs可能仅通过捕获细菌和防止传播，以及通过促进巨噬细胞和其他免疫细胞的激活,在分枝杆菌感染中发挥有益作用，NETs也可能是有害的，它们可能结合其他免疫细胞,抑制NETs功能,直接损害宿主组织2 2 。有证据表明，脓肿分枝杆菌可被NETs杀死，而结核分枝杆菌则不能2 ONETs可能在肺结核非特异性炎症和组织破坏通路中发挥关键作用，血清瓜氨酸化组蛋白H3是NETs形成的标志性物质，在严重肺结核患者血清中测得瓜氨酸化组蛋白H3水平明显升高，NETs可作为一种潜在生物标志物，预测治疗前肺结核的不良预后2 3。最近，在肺结核患者和结核病易感小鼠切除的肺部病变中观察到NETs,这为NETs在结核病发病机制中的作用提供了支持2 4。研究者对结核性脑膜炎患者进行脑活检时，发现在肉芽肿坏死区和脑梗死区存在高浓度表达MPO的中性粒细胞2 5,在中枢神经系统结核患者脑活检中也观察到NE的染色2 6 ,MPO和NE均是NETs的重要组成成分。结合上述研究结果,推测活性NETosis可能与中枢神经系统结核分枝杆菌感染有关，NETs可以阻止被吞噬的细菌释放，而中性粒细胞可以继续存活并执行趋化、吞噬、杀菌等作用5。在结核分枝杆菌感染的中性粒细胞中已证实有NETs诱导5,但中性粒细胞是否发生NETosis，发生形式属于自杀性NETosis还是活性NETosis还有待进一步证实。NETs与多种血栓形成相关的非感染性疾病有关，包括糖尿病肾病2 7 、自身免疫病2 8 、动脉粥样硬化2 9、血管炎30 和血栓形成31。脑梗死是中枢神经系统结核的一种严重并发症,发病率15%6 7%5。目前认为,结核性脑膜炎相关的中风可能与炎症失调有关,脑脊液样本中的肿瘤坏死因子-a（t u m o r n e c r o s i s f a c t o r,T NF-a）、巨噬细胞炎症蛋白-1(macrophage inflammatory protein-1,MIP-1a)、IL-6,IL-8,IL-4和IL-1浓度的上调与结核性脑膜炎患者脑梗死相关32,33Thalin等34 发现结核病感染免疫应答产生的NETs可能与血小板在血栓形成中存在协同作用,NETs会促进凝血酶生成，而活化的血小板会触发NETs形成。除此之外，NETs已被证明通过不同的机制促进血栓形成，包括在体外和体内模型中构成血小板的折叠，激活血小板和刺激凝血，与脑血栓的形成密不可分35。因此,NETs可能与中枢神经系统结核患者脑梗死的发生有关4.中性粒细胞胞外诱捕网作为中枢神经系统感染治疗的潜在靶点在肺炎球菌脑膜炎大鼠模型中，NETs破坏了脑脊液通过脑部胶质淋巴系统的运输，发生脑水肿，通过DNA酶降解NETs后，恢复了大鼠的脑部胶质淋巴系统运输，减轻了脑水肿，相比之下，头孢曲松治疗对恢复脑脊液循环没有影响19,因此，靶向NETs有望改善细菌性脑膜炎的治疗，值得进一步探索，由于靶向NETs治疗针对的是中性粒细胞介导的炎症,而不是直接针对细菌，不易受到抗菌素耐药性的影响19。此外,DNA酶已被批准用于囊性纤维化治疗36 ,将此研究结果转化为临床应用前景明朗，但后续仍需进一步的临床前研究来证明其有效性。5.目前存在的问题研究发现，相同病原体引起的中枢神经系统感染中NETs的检测结果及作用不一致。Mohanty等!I将免疫荧光显微镜下DNA和NE的共聚焦定义为存在NETs，结果显示357李蓉：中性粒细胞胞外诱捕网在中枢神经系统感染的研究进展神经系统莱姆病患者脑脊液中没有NETs形成，而在另一项研究中，研究者采用两种方法（MPO-DNA复合物和NE的活性）测定NETs，通过验证发现两种检测方法结果的一致性为93%,该研究首次证明儿童和成人神经系统莱姆病患者脑脊液中有NETs的形成37 。Mohanty等 的研究结果提示NETs形成的网状结构为一些病原体播散提供了稳定的空间支持1,而Buhr等38 的研究结果表明NETs形成的网状结构可以捕获一些病原体并将其固定其中，防止感染进一步播散。NETs检测手段的多样性可能是实验结果不同的原因之一。NETs的形成可通过活体显微镜、透射电子显微镜、共聚焦显微镜、酶联免疫吸附试验、流式细胞术等方式检测，上述检测手段都有优缺点34，目前仍缺乏标准化的方法来评估NETs的形成，所以在解释关于NETs形成的数据时应谨慎。6.展望和总结目前,NETs在自身免疫病、癌症、心血管疾病中的研究较多，在中枢神经系统感染的研究刚起步，需要进一步探索。NETs的研究已从先天免疫防御中的抗菌作用转到一些临床条件下的致病作用,结合现有研究,NETs的抗菌作用是明确的，但不能忽视NETs在中枢神经系统感染中的免疫病理作用，下一步针对NETs的靶向干预是研究的热点之一。本文基于中枢神经系统感染相关的NETs在疾病发生发展中的机制研究以及在此基础上开发以NETs为靶点的治疗药物进行了总结，期望为中枢神经系统感染的治疗提供新的思路。参考文献1 Conceicao-Silva F,Reis CSM,De Luca PM,et al.The immunesystem throws its traps:Cells and their extracellular traps in diseaseand protectionJ.Cells,2021,10(8):1891.D0I:10.3390/cells10081891.2 Brinkmann V,Reichard U,Goosmann C,et al.Neutrophil extracel-lular traps kill bacteriaJ.Science,2004,303(5663):1532-1535.D0I:10.1126/science.1092385.3 Chen T,Li Y,Sun R,et al.Receptor-mediated NETosis on neutro-philsJ.Front Immunol,2021,12:775267.DOI:10.3389/fim-mu.2021.775267.4 Chen Y,Zhang H,Hu X,et al.Role of NETosis in central nervoussystem injuryJ.Oxid Med Cell 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