运动特里顿杆菌的分离鉴定及其抑菌与群体感应淬灭活性检测.pdf

文章编号:1 6 7 4-1 4 8 X(2 0 2 3)0 3-0 1 8 8-0 6运动特里顿杆菌的分离鉴定及其抑菌与群体感应淬灭活性检测张培军1,沈煜1,兰江华2,单虎1,蔡秀磊1(1.青岛农业大学动物医学院,山东青岛 2 6 6 1 0 9;2.山东碧蓝生物科技有限公司,山东泰安 2 7 1 4 1 1)摘 要:为研究海洋源性微生物对细菌性疾病潜在的防控作用,对海水中分离得到的纯化菌株Q 1 6 5进行1 6 S r R NA基因序列测定和分析,并检测Q 1 6 5的群体感应淬灭活性和常见病原菌抑菌谱。1 6 S r R NA基因序列测定结果显示,菌株Q 1 6 5与运动特里顿杆菌(T r i t o n i b a c t e r m o b i l i s)D S M 2 3 4 0 3T相似性为9 9.4 7%,与斯氏特里顿杆菌(T.s c o t t o m o l l i c a e)LMG 2 4 3 6 7T相似性为9 8.9 5%,与大西洋鲁杰氏菌(R u e g e r i a a t l a n t i c a)C E C T 4 2 9 2T相似性为9 7.2 0%。系统发育分析表明,Q 1 6 5与运动特里顿杆菌聚为一簇,亲缘关系近,鉴定为运动特里顿杆菌。群体感应淬灭活性检测结果表明,Q 1 6 5对N-酰基高丝氨酸内酯(N-a c y l h o m o s e r i n e l a c t o n e s,AHL s)信号分子具有降解活性,采用琼脂扩散法测得,Q 1 6 5能显著抑制金黄色葡萄球菌和鳗弧菌的生长。为菌株Q 1 6 5及其活性产物的进一步研究和应用奠定了基础。关键词:运动特里顿杆菌;群体感应淬灭;抑菌活性中图分类号:Q 9 3-3文献标识码:AD O I:1 0.3 9 6 9/J.I S S N.1 6 7 4-1 4 8 X.2 0 2 3.0 3.0 0 5收稿日期:2 0 2 2-0 4-2 1 基金项目:山东省新旧动 能转换重大工 程重大课题攻关 项目(鲁发改动能办 2 0 2 01 2 2 0号);青岛农 业大学高层次 人才科研基金(6 6 3/1 1 1 9 0 0 4)作者简介:张培军(1 9 9 4),男,重庆合川人,在读硕士,研究方向为兽医微生物学。E-m a i l:4 5 5 0 8 7 7 9 6q q.c o m通信作者:蔡秀磊(1 9 8 0),女,山东招远人,博士,副教授,研究方向为兽医微生物学。E-m a i l:x l c a i_9 91 6 3.c o mI s o l a t i o n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f T r i t o n i b a c t e r M o b i l i s a n d D e t e r m i n a t i o n o f I t s A n t i b a c t e r i a l A c t i v i t y a n d Q u o r u m Q u e n c h i n g A c t i v i t yZ HANG P e i j u n1,S HE N Y u1,L AN J i a n g h u a2,S HAN H u1,C A I X i u l e i1(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,Q i n g d a o 2 6 6 1 0 9,C h i n a;2.S h a n d o n g B i l a n B i o t e c h n o l o g y C o.,L t d,T a ia n 2 7 1 4 1 1,C h i n a)A b s t r a c t:I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e p o t e n t i a l r o l e o f m a r i n e m i c r o o r g a n i s m s i n t h e p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f b a c t e r i a l d i s e a s e s,s t r a i n Q 1 6 5 w a s i s o l a t e d f r o m s e a w a t e r b y o u r l a b o r a t o r y.1 6 S r R NA g e n e s e q u e n c e a n d a n a l y s i s o f s t r a i n Q 1 6 5 w e r e p e r f o r m e d,w h i l e t h e q u o r u m q u e n c h i n g a c t i v i t y a n d a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y w e r e d e t e r m i n e d.1 6 S r R NA g e n e s e q u e n c e r e s u l t s s h o w e d t h a t s t r a i n Q 1 6 5 h a d a 9 9.4 7%s i m i l a r i t y t o T r i t o n i b a c t e r m o b i l i s D S M 2 3 4 0 3T,a n d a 9 8.9 5%s i m i l a r i t y t o T.s c o t t o m o l l i c a e LMG 2 4 3 6 7T,f o l l o w e d b y a 9 7.2 0%s i m i l a r i t y t o T.r u e g e r i a a t l a n t i c a C E C T 4 2 9 2T.P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t Q 1 6 5 c l u s t e r e d t o g e t h e r w i t h T.m o b i l i s,t h e c l o s e s t r e l a t i v e s,s o i t w a s i d e n t i f i e d a s T.m o b i l i s.S t r a i n Q 1 6 5 h a d s t r o n g q u o r u m q u e n c h i n g a c t i v i t y a n d c o u l d d e g r a d e AHL s i g n a l i n g m o l e c u l e s.A g a r d i f f u s i o n r e s u l t s s h o w e d t h a t s t r a i n Q 1 6 5 c o u l d i n h i b i t g r o w t h o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s a n d V i b r i o a n g u i l l a r u m.F r o m t h i s s t u d y,s t r a i n Q 1 6 5 w a s c o n f i r m e d w i t h q u o r u m q u e n c h i n g a c t i v i t y a n d a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y,w h i c h i s w o r t h f u r t h e r r e s e a r c h o n i t s a p p l i c a t i o n.K e y w o r d s:T r i t o n i b a c t e r m o b i l i s;q u o r u m q u e n c h i n g;a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y青岛农业大学学报(自然科学版)4 0(3):1 8 81 9 3,2 0 2 3J o u r n a l o f Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)抗生素在畜牧业生产养殖环节中常被用于治疗动物细菌性疾病。随着畜牧业养殖规模的不断扩大,细菌性疾病不仅对畜牧业生产带来持续不断的经济损失,还造成了抗生素和抗菌促生长剂的滥用,从而导致药物残留、环境污染、耐药菌株扩散等严重问题,给食品安全、人类健康和社会公共卫生带来威胁1。如果细菌耐药性得不到有效控制,畜牧业将会受到巨大影响。我国规定,自2 0 2 0年7月1日起,饲料生产企业不得再生产含有饲用抗生素的商品饲料,畜牧业进入禁抗时代2。因此,寻找抗生素替代品成为保障畜牧业生产安全的头等大事。运动特里顿杆菌是2 0 2 1年发现的一个新种3,属于红杆菌科,特里顿杆菌属,海洋玫瑰杆菌类群。群体感应作为细菌间的一种信息交流机制,能调控基因的表达和微生物的群体行为,如调控细菌毒力相关基因的表达、生物被膜的形成等4。N g等5发现多种病原菌的群体行为与群体感应密切相关。群体感应机制并不是细菌生存的必要条件,群体感应淬灭(q u o r u m q u e n c h i n g,QQ)不会给细菌带来生与死的选择压力,理论上不易产生耐药性,可在不破坏病原菌生存条件的基础上,降低甚至消除病原菌的致病性6。本研究从海水中分离得到一株运动特里顿杆菌Q 1 6 5,根据其1 6 S r R NA序列和系统发育分析进行初步鉴定,并测定该菌株对临床分离病原菌的抑菌活性和群体感应淬灭活性,为进一步开展该菌株拮抗活性产物的应用研究奠定基础,也为群体感应淬灭技术在动物 细菌性病 害防控 中 的 应 用 提 供 新思路。1 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 菌株报告 菌 根 癌 农 杆 菌(A g r o b a c t e r i u m t u m e f a-c i e n s)A 1 3 6(p C F 2 1 8/p C F 3 7 2)组成株,报告菌紫色色 杆 菌(C h r o m o b a c t e r i u m v i o l a c e u m)C V 0 2 6和V I R 2 4株,大 肠埃希氏菌(E s c h e r i c h i a c o l i)菌 株E 1、E 2、E 3、E 4株,链球菌(S t r e p t o c o c c u s)菌株Q P-2、S S 2、S S T-9、S S T-1、S S T-7株,金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)菌 株QT B 1-1、PM J 4-1、PM J 1 0-1、F T B E T、T T B H、PM J 3 0-2、Q P-1株,绿脓杆 菌(P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a)菌 株Q P-3、WANG-1、WANG-4、GU-T 3株,鳗 弧 菌V I B 7 2(V i b r i o a n g u i l l a r u m)。以上菌株均由青岛农业大学预防兽医实验室分离并保存。1.1.2 培养基及试剂海洋细菌液体2 2 1 6 E(MB)培养基,美国B D公司上海有限公司;L B培养基和琼脂粉,青岛海博生物技术有限公司;AT培养基,实验室制备;四环素(1 0 m g/m L)和盐酸壮观霉素(5 0 m g/m L),上海源叶生物科技有限公司;N-酰基高丝氨酸内酯(N-a c y l h o m o s e r i n e l a c t o n e s,AHL s)信号分子、N-己酰基高丝氨酸内酯(C 6-H S L)、N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯(3-o x o-C 6-H S L)、N-辛酰基高丝氨酸内酯(C 8-H S L),美国开曼生物公司;N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯(3-o x o-C 8-H S L)、N-癸酰基高丝氨酸内酯(C 1 0-H S L)、N-3-氧-癸 酰 高 丝 氨 酸 内 酯(3-o x o-C 1 0-H S L)、N-十二酰基高丝氨酸内酯(C 1 2-H S L)、N-3-氧-十四烷酰-高丝氨酸内酯(3-o x o-C 1 4-H S L),美国西格玛-奥德里奇化学品公司;X-G a l溶液、二甲基亚砜(DM S O)溶液、哌嗪-1,4-二乙磺酸(P I P E S)缓冲液、磷酸缓冲盐溶液(P B S),生工生物工程(上海)股份有限公司。信号分子使用DM S O溶液配成终浓度1 0 mm o l/L的储存液。1.1.3 仪器与设备ML S G 3 7 5 1 L高压灭菌锅,日本松下公司;D N-P G 9 0 8 2电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;H Z Q G F X全温振荡培养箱,B S C G 1 1 0 0 G L I A 2生物安全 柜,北京东联 哈尔仪器制 造有限公司;T 1 0 0基因扩增仪(P C R仪),美国伯乐生命医学产品有限公司;S p a r k-1 0 M酶标仪,瑞士帝肯公司上海有限公司;5 4 2 5 R高速冷冻离心机,德国艾本德生命科学公司。1.2 试验方法1.2.1 细菌分离与纯化从青岛近海采集表层海水,采用薄膜过滤法富集海水中的微生物7,将富集后的海水样品涂布于MB固体培养基上,2 8 恒温过夜培养,得到若干菌株。分离纯化培养后,挑取各菌株的单菌落点种在涂有鳗弧菌V I B 7 2的培养平板上,2 8 恒温过夜培养,能在培养平板上产生抑菌圈的菌株命名为Q 1 6 5。1.2.2 1 6 S r R NA基因序列测定将已纯化培养的菌株Q 1 6 5接种到MB液体培养基中,于1 7 0 r/m i n的摇床中2 8 恒温过夜培养,将菌液收集到离心管中,4、1 2 0 0 0 r/m i n离心5 m i n,弃去上清液,收集菌体沉淀。使用酚-氯仿抽提法提取Q 1 6 5的总D NA作为基因扩增模板,采用细菌1 6 S r R NA通用引物进行P C R扩增后8,委981 3期 张培军,等:运动特里顿杆菌的分离鉴定及其抑菌与群体感应淬灭活性检测 托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。使用B l a s t程 序9和1 6 S-b a s e d I D程 序1 0对1 6 S r R NA基因序列进行比对分析,采用综合分析软件ME GA 7.0中的C l u s t a l W程序比对后,用亲缘重建选项(p h y l o g e n y r e c o n s t r u c t i o n)进行分析,采用邻接法(n e i g h b o r-j o i n i n g,N J)、最大似然法(m a x i m u m l i k e l i h o o d,ML)和最大简约法(m a x i m u m p a r s i m o-n y,MP)分别构建并重合比较Q 1 6 5的系统发育树。1.2.3 群体感应淬灭活性的检测采用汤开浩1 12 9建立的高通量法快速检测菌株Q 1 6 5的群体感应淬灭活性,若存在群体感应淬灭活性,则进一步采用平板检测法检测菌株Q 1 6 5对不同AHL s信号分子的淬灭活性。1.2.3.1 高通量法将Q 1 6 5种子液接种于MB液体培养基中,于1 7 0 r/m i n的摇床上2 8 培养2 4 h,得Q 1 6 5菌液。报告菌A 1 3 6接种于L B液体培养基中(含壮观霉素5 0 g/m L,四环素4.5 g/m L),于1 7 0 r/m i n的摇床上2 8 培养1 2 h,使A 1 3 6在波长6 0 0 n m的吸光值(O D6 0 0值)约为2,得A 1 3 6种子液。将上述Q 1 6 5菌液、P I P E S缓冲液(1 mm o l/L,p H=6.7)和C 6-H S L信号分子(1 mm o l/L)按照体积比1 010.1混匀,置于2 8 恒温培养箱中孵育2 4 h,得检测反应液。将检测反应液充分混合之后,4、1 2 0 0 0 r/m i n离心5 m i n,得检测反应液上清液。用d d H2O代替Q 1 6 5菌液,按照相同程序制备阴性对照上清液。取A 1 3 6种子液1 0 0 L接种到1 0 m L AT培养基(含壮观霉素5 0 g/m L,四环素4.5 g/m L)中,加入终浓度2 5 0 g/m L的X-g a l溶液,充分混合,得A 1 3 6/X-g a l溶液。在9 6孔板中加入1 0 L检测反应液上清液或阴性对照上清液,并与1 9 0 L A 1 3 6/X-g a l溶液混匀,分别得到Q 1 6 5+C 6-H S L检测液(简称Q 1 6 5检测液)和C 6-H S L阴性对照检测液(简称阴性对照液),2 8 恒温培养2 4 h,显色后,使用酶标仪分别在波长4 9 2 n m、6 3 0 n m处检测两种检测液的吸光值,根据标准化-半乳糖苷酶活性值公式1 12 5,分别计算Q 1 6 5检测液和阴性对照液的标准化-半乳糖苷酶活性值(简称活性值),若阴性对照液的活性值与Q 1 6 5检测液的活性值之差大于0.4,说明菌株Q 1 6 5具有群体感应淬灭活性。1.2.3.2 平板检测法分别用报告菌C V 0 2 6、V I R 2 4检测短链AHL s信号分子C 6-H S L、3-o x o-C 6-H S L、C 8-H S L、3-o x o-C 8-H S L和长链AHL s信号分子C 8-H S L、3-o x o-C 8-H S L、C 1 0-H S L、3-o x o-C 1 0-H S L、C 1 2-H S L、3-o x o-C 1 4-H S L。将2种报告菌分别接种于液体L B培养基中,于1 7 0 r/m i n的摇床上2 8 培养1 2 h,得2种报告菌种子液。用无菌玻璃纸覆盖MB固体培养基,取2 0 0 L Q 1 6 5菌液,均匀涂布在玻璃纸上,于2 8 培养4 8 h后,用灭菌P B S将玻璃纸上的菌苔缓缓洗下,得Q 1 6 5浓菌液(菌液O D6 0 0值约为2)。使用1.2.3.1节方法制备检测反应液上清液和阴性对照上清液。将2种报告菌种子液分别接种到不同的4 5 半固体L B培养基中,迅速混匀、倒板,待琼脂凝固后,在平板上打孔,每孔加入1 01 5 L检测反应液上清液(样品孔)或阴性对照上清液(对照孔),于2 8 恒温培养过夜,观察显色晕圈。1.2.4 抑菌试验采用琼脂扩散法测定菌株Q 1 6 5对2 1株常见病原菌的抑制效果。将病原菌接种于L B液体培养基中,于1 8 0 r/m i n的摇床上3 7 过夜培养;将鳗弧 菌V I B 7 2接 种 于MB液 体 培 养 基 中,于1 8 0 r/m i n的摇床上2 8 培养1 2 h,得活化病原菌菌液;取2 0 0 L活化病原菌菌液涂布在平板培养基上,然后用接种环挑取Q 1 6 5单菌落点种于平板培养基上,2 8 恒温培养1 2 h,观察Q 1 6 5单菌落在平板培养基上出现的抑菌圈情况,并测量抑菌圈直径。1.2.5 统计学分析样本 数 据 采 用 单 因 素 方 差 分 析(o n e-w a y ANOVA)进行多重比较,P0.0 5表示样本间差异不显著。2 结果与分析2.1 Q 1 6 5的1 6 S r R NA基因序列分析菌株Q 1 6 5的1 6 S r R NA基 因 扩 增 后 得 到1 3 6 6 b p序列,鉴定 比对结果显 示,Q 1 6 5的1 6 S r R NA序列与运动特里顿杆菌(T r i t o n i b a c t e r m o-b i l i s)D S M 2 3 4 0 3T相似性为9 9.4 7%,与斯氏特里顿杆菌(T.s c o t t o m o l l i c a e)LMG 2 4 3 6 7T相似性为9 8.9 5%,与大西洋鲁杰氏菌(R u e g e r i a a t l a n t i c a)C E C T 4 2 9 2T相似性为9 7.2 0%。系统发育分析结果(图1)说明,Q 1 6 5与运动特里顿杆菌(T r i t o n i-b a c t e r m o b i l i s)D S M 2 3 4 0 3T聚为一簇,亲缘关系最近,可初步判断菌株Q 1 6 5为运动特里顿杆菌。091 青岛农业大学学报(自然科学版)4 0卷 图1 基于邻接法构建的菌株Q 1 6 5系统发育树F i g.1 P h y l o g e n e t i c t r e e o f s t r a i n Q 1 6 5 b a s e d o n 1 6 S r R NA s e q u e n c e b y n e i g h b o u r-j o i n i n g m e t h o d注:“”表示此处与选择最大似然法、最大简约法的结果相同;“”表示此处与选择最大似然法的结果相同。2.2 Q 1 6 5的群体感应淬灭活性分析2.2.1 高通量法分析由图2可知:孵育后Q 1 6 5检测液不显色,说明其中的标准值-半乳糖苷酶活性较低。根据标准化-半乳糖苷酶活性值公式1 12 5得出Q 1 6 5检测液的活性值为0.5 2,阴性对照液的活性值为1.0 0(见表1)。经过计算,阴性对照液的活性值与Q 1 6 5检测液的活性值之差为0.4 8,说明Q 1 6 5具有群体感应淬灭活性,可通过平板检测法验证Q 1 6 5对不同AHL s信号分子的淬灭活性。A.阴性对照液;B.Q 1 6 5检测液。图2 高通量法检测菌株Q 1 6 5的群体感应淬灭活性F i g.2 R e s u l t s o f q u o r u m q u e n c h i n g a c t i v i t y o f s t r a i n Q 1 6 5 b y h i g h-t h r o u g h p u t m e t h o d表1 检测液的标准化-半乳糖苷酶活性值T a b l e 1 S t a n d a r d i z e d-g a l a c t i v i t y v a l u e o f t e s t s o l u t i o n s检测液名称T e s t s o l u t i o n n a m e标准化-半乳糖苷酶活性值S t a n d a r d i z e d-g a l a c t i v i t y样本差异性B e t w e e n-s a m p l e d i f f e r e n c eQ 1 6 5检测液0.5 2P0.0 0 0 1阴性对照液1.0 0P0.0 0 0 1 注:差异性分析采用单因素方差分析,P0.0 0 0 1表示差异极显著。2.2.2 平板检测法分析由 图3可 知:Q 1 6 5对3-o x o-C 8-H S L、C 1 0-H S L、C 1 2-H S L无 淬 灭 活 性;Q 1 6 5对3-o x o-C 6-H S L、C 8-H S L、3-o x o-C 1 4-H S L有 很 强 的 淬 灭 活性,样品孔完全不显色;Q 1 6 5对3-o x o-C 1 0-H S L有较强的淬灭活性,样品孔呈现淡紫色晕圈,明显淡于对照孔;Q 1 6 5对C 6-H S L有较弱的淬灭活性,样品孔的紫色晕圈轻微变淡,大量C 6-H S L未被淬灭。191 3期 张培军,等:运动特里顿杆菌的分离鉴定及其抑菌与群体感应淬灭活性检测 A.C 6-H S L;B.3-o x o-C 6-H S L;C.C 8-H S L;D.3-o x o-C 8-H S L;E.C 1 0-H S L;F.3-o x o-C 1 0-H S L;G.C 1 2-H S L;H.3-o x o-C 1 4-H S L。图3 菌株Q 1 6 5对AHL s信号分子的淬灭活性F i g.3 D e g r a d a t i o n o f AHL s s i g n a l i n g m o l e c u l e s b y s t r a i n Q 1 6 52.3 Q 1 6 5的抑菌活性分析由表2可知:Q 1 6 5可以有效抑制鳗弧菌和金黄色葡萄 球 菌,其 中 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌PM J 4-1、PM J 1 0-1、PM J 3 0-2、T T B H株和鳗弧菌V I B 7 2抑制效果较强,对金黄色葡 萄球菌QT B 1-1、F T B E T、Q P-1株的抑制效果较弱;Q 1 6 5无法抑制所选取的链球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌系列菌株。表2 菌株Q 1 6 5对所选取病原菌的抑菌活性T a b l e 2 A n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f s t r a i n Q 1 6 5菌株号S t r a i n n u m b e r菌株名称S t r a i n n a m e抑菌圈直径/mmD i a m e t e r o f i n h i b i t i o n z o n eQ T B 1-1金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)2P M J 4-1金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)1 5P M J 1 0-1金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)1 6F T B E T金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)1T T B H金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)1 1P M J 3 0-2金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)1 3Q P-1金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)2V I B 7 2鳗弧菌(V i b r i o a n g u i l l a r u m)1 4Q P-2链球菌(s t r e p t o c o c c u s)0S S 2链球菌(s t r e p t o c o c c u s)0S S T-9链球菌(s t r e p t o c o c c u s)0S S T-1链球菌(s t r e p t o c o c c u s)0S S T-7链球菌(s t r e p t o c o c c u s)0Q P-3铜绿假单胞菌(P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a)0W A N G-1铜绿假单胞菌(P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a)0W A N G-4铜绿假单胞菌(P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a)0G U-T 3铜绿假单胞菌(P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a)0E 1大肠埃希氏菌(E s c h e r i c h i a.c o l i)0E 2大肠埃希氏菌(E s c h e r i c h i a.c o l i)0E 3大肠埃希氏菌(E s c h e r i c h i a.c o l i)0E 4大肠埃希氏菌(E s c h e r i c h i a.c o l i)03 讨论在当前全面禁抗的大环境下,如何有效防治动物细菌性感染,应对目前较严重的细菌耐药性问题,已经引起广泛关注,研发高效、绿色、环保的抗生素替代品势在必行。经鉴定,本试验分离得到的菌株Q 1 6 5为运 动 特 里 顿 杆 菌,它 能 有 效 抑 制 鳗 弧 菌V I B 7 2株 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌PM J 4-1、PM J 1 0-1、PM J 3 0-2、T T B H株,且具有较强的群体感应淬灭活性,能 完 全 淬 灭3-o x o-C 6-H S L、C 8-H S L、3-o x o-C 1 4-H S L,部分淬灭C 6-H S L、3-o x o-C 1 0-H S L。运动特里顿杆菌属于海洋玫瑰杆菌类群,目前已发现该类群在海洋微生物群落分布广泛1 2,且丰度较高,能有效抑制多种病原菌生长。作为海洋玫瑰杆菌类群中的一员,运动特里顿杆菌生理性质可能与同 类 群 中 的 抑 菌 褐 杆 菌(P h a e o b a c t e r i n h i-b e n s)、大西洋鲁杰氏菌(R u e g e r i a A t l a n t i c a)等菌株相似1 3-1 4。海洋玫瑰杆菌类群可产生抑菌活性物质,包括对二硫辛酸(t r o p o d i t h i e t i c-a c i d,T D A)1 5、靛青素(i n d i g o i d i n e)1 6、r o s e o c h e l i n B(玫瑰红素B,作者译)1 7、m e t h y l t r o p o s u l f e n i n(甲基硫磺胺,作者译)1 8等,因此,Q 1 6 5也可能会产生具有拮抗其他菌株的活性物质。群体感应淬灭作用是通过干扰或淬灭信号分子来影响或者破坏细菌的群体感应系统,从而调控细菌相关毒力因子的产生。这是一种以毒力因子为靶点的新型抗毒力治疗方式,是自然菌群在优势竞争中采用的常规调控手段,符合生物自身的发展规律。常规的抗生素通过破坏细菌来控制致病性,所带来的生存性压力使细菌产生耐药基因而形成耐药性,而群体感应淬灭作用能在不杀灭细菌的条件下降低其致病力,可显著减少细菌耐药性的产生1 9。金黄色葡萄球菌有一类以自诱导肽(a u t o i n-d u c i n g p e p t i d e s,A I P s)为信号分子的群体感应系统,自诱导肽能够被菌体细胞膜上的感应器感知并291 青岛农业大学学报(自然科学版)4 0卷 结合,结合后产生的调控因子驱动R NA(一种小分子R NA)转录,而R NA对金黄色葡萄球菌的毒素调节具有重要作用,如金黄色葡萄球菌溶血素和金黄色葡萄球菌肠毒素等2 0。费氏弧菌的群体感应系统通过L u x I蛋白酶催化生成3-o x o-C 6-H S L,可激活转录调控因子L u x R,启动某些毒力相关基因的表达2 1,因为AHL s信号分子具有特异性,这使得弧菌能够在不同环境下精准识别出自身特定的信号分子,从而调控自身种群的生理变化,如生物被膜的形成和细菌素的分泌。此外,一些益生菌也能利用AHL s信号分子来进行种间交流并调控自身的生理特性。通过对不同细菌群体感应系统的深入了解可以发现,与传统抗生素防控细菌的方式相比,利用群体感应淬灭技术靶向调控细菌的方式具有更好的可持续性和优势,具有替代抗生素进行防控细菌性疾病的潜力。因此,本试验分离得到的具有抑菌活性和群体感应淬灭活性的菌株Q 1 6 5,具有被开发为新型抗毒力益生菌的潜力。4 结论本文分离并鉴定了一株运动特里顿杆菌Q 1 6 5,1 6 S r R NA基因序列与运动特里顿杆菌(T r i t o n i-b a c t e r m o b i l i s)D S M 2 3 4 0 3T亲缘关系近。Q 1 6 5可以降解AHL s信号分子,并对金黄色葡萄球菌和鳗弧菌有明显的抑菌活性,推测Q 1 6 5对病原菌的拮抗作用是通过抑菌活性物质和群体感应淬灭作用来实现的。今后应进一步对Q 1 6 5的活性代谢产物进行分离纯化和作用机制研究,探讨Q 1 6 5在动物细菌性疾病防治中的应用。参考文献:1 D E F O I R D T T,S O R G E L OO S P,B O S S I E R P.A l t e r n a t i v e s t o a n t i b i o t i c s f o r t h e c o n t r o l o f b a c t e r i a l d i s e a s e i n a q u a c u l t u r eJ.C u r r e n t O p i n i o n i n M i c r o b i o l o g y,2 0 1 1,1 4(3):2 5 1-2 5 82 王蕾蕾,许金新.饲料“禁抗令”施行后养殖业面临的挑战及对策J.中国动物保健,2 0 2 1,2 3(9):33 L I A N G K Y H,O R A T A F D,B O U C H E R Y F,e t a l.R o s e o b a c t e r s i n a s e a o f p o l y-a n d p a r a p h y l y:W h o l e g e n o m e-b a s e d t a x o n o m y o f t h e f a m i l y R h o d o b a c t e r a c e a e a n d t h e p r o p o s a l f o r t h e s p l i t o f t h e“R o s e o b a c t e r C l a d e”i n t o a n o v e l f a m i l y,R o s e o b a c t e r a c e a e f a m.n o vJ.F r o n t i e r s i n M i c r o b i o l o g y,2 0 2 1,1 2:e 6 8 3 1 0 94 WA T E R S C M,B A S S L E R B L.Q u o r u m s e n s i n g:c e l l-t o-c e l l c o mm u n i c a t i o n i n b a c t e r i aJ.A n n u a l R e v i e w o f C e l l a n d D e-v e l o p m e n t a l B i o l o g y,2 0 0 5,2 1:3 1 9-3 4 65 N G W-L,B A S S L E R B L.B a c t e r i a l q u o r u m-s e n s i n g n e t w o r k a r-c h i t e c t u r e sJ.A n n u a l R e v i e w o f G e n e t i c s,2 0 0 9,4 3:1 9 7-2 2 26 AHMA D I,KHAN M S A,HU S A I N F M,e t a l.B a c t e r i a l q u o-r u m s e n s i n g a n d i t s i n t e r f e r e n c e:m e t h o d s a n d s i g n i f i c a n c eM/M i c r o b e s a n d M i c r o b i a l T e c h n