T∕CAFFCI 45-2021 化妆品中4-羟基苯甲酸及其盐类和酯类的检测高效液相色谱-质谱法.pdf

T/CAFFCI 452021ICS 71.100.70Y42团体标准T/CAFFCI 45-2021化妆品中4-羟基苯甲酸及其盐类和酯类的检测高效液相色谱-质谱法Determination of 4-Hydroxybenzoic acid and its salts and esters incosmeticsHigh performance liquid chromatography - mass spectrometry2021-03-29 发布2021-04-28 实施中国香料香精化妆品工业协会发 布T/CAFFCI 452021前言本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。本标准由中国香料香精化妆品工业协会提出。本标准由中国香料香精化妆品工业协会归口。本标准起草单位：通标标准技术服务（上海）有限公司、上海市食品药品检验研究院、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。本标准主要起草人：廖晓全、郁琼花、杨扬、冯颖、简龙海、陈静、许勇、杨振宇、王粮子。T/CAFFCI 4520211化妆品中 4-羟基苯甲酸及其盐类和酯类的检测高效液相色谱-质谱法1 范围本标准规定了化妆品中 22 种 4-羟基苯甲酸及其盐类和酯类的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）测定方法的试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、结果计算、回收率与精密度、允许差等内容。本标准适用于乳液、膏霜、蜡基类化妆品中 22 种 4-羟基苯甲酸及其盐类和酯类的测定，水基、凝胶、粉基类等化妆品中 22 种 4-羟基苯甲酸及其盐类和酯类的测定也可参考本标准。本标准方法最低定量限参见附录 A 中表 A.1。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 试验方法化妆品样品用乙酸-甲醇溶液超声提取，经 0.45 m 滤膜过滤后，用 HPLC-MS 分析，外标法定量。3.1 试剂与材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。a）甲醇（色谱纯）；b）乙酸（色谱纯）；c）四氢呋喃（色谱纯）；d）0.5%乙酸-甲醇溶液：取2.5 mL乙酸（b）用甲醇（a）定容至500 mL，混匀；e）标准样品/物质：4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苯甲酯、4-羟基苯甲酸正戊酯、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸乙酯。中英文名称、CAS号参见附录B中表B.1。f）标准储备溶液（10000 mg/L）：准确称取：4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苯甲酯、4-羟基苯甲酸正戊酯、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸乙酯，10种标准物质各0.10000.0020g分T/CAFFCI 4520212别置于10个10mL容量瓶中，用甲醇（a）溶解并稀释定容至刻度。标准溶液于-18 下保存，建议保存时间不超过12个月。g）混合标准储备溶液：分别准确移取一定体积的10种标准储备溶液于同一10 mL容量瓶中，用甲醇（a）稀释并定容至刻度。混合标准溶液于4 下保存，建议保存时间不超过6个月。标准储备溶液的移取体积及混合标准储备溶液中各物质的最终浓度见下表1：表1 标准储备溶液的移取体积及混合标准溶液中各标准物质的最终浓度序号标准物质名称移取体积（L）最终浓度（mg/L）14-羟基苯甲酸异丙酯404024-羟基苯甲酸异丁酯404034-羟基苯甲酸苯酯404044-羟基苯甲酸苯甲酯404054-羟基苯甲酸正戊酯404064-羟基苯甲酸20020074-羟基苯甲酸甲酯20020084-羟基苯甲酸丁酯404094-羟基苯甲酸丙酯4040104-羟基苯甲酸乙酯4040h）混合标准工作溶液：准确移取 500 L 混合标准储备溶液（g）于 10 mL 容量瓶中，用甲醇（a）稀释并定容至刻度。于 4 下保存，建议保存时间不超过 1 个月。混合标准工作溶液中各标准物质的最终浓度见下表 2：表 2 混合标准工作溶液中各标准物质的最终浓度序号标准物质名称最终浓度（mg/L）14-羟基苯甲酸异丙酯224-羟基苯甲酸异丁酯234-羟基苯甲酸苯酯244-羟基苯甲酸苯甲酯254-羟基苯甲酸正戊酯264-羟基苯甲酸1074-羟基苯甲酸甲酯1084-羟基苯甲酸丁酯294-羟基苯甲酸丙酯2104-羟基苯甲酸乙酯2i）标准工作曲线溶液：用 0.5 %乙酸-甲醇（d）稀释适量混合标准工作溶液（h）于 1 mL 进样小瓶中得标准工作曲线溶液，配制方法如下表 3：T/CAFFCI 4520213表 3 标准工作曲线溶液配制方法浓度水平混合标准工作溶液的加入体积（L）0.5 %乙酸-甲醇的加入体积（L）110990240960380920410090051508506200800表 4 各浓度水平下标准物质最终浓度表j）20%甲醇-水溶液：取 20 mL 甲醇（a），用水定容至 100 mL，混匀。3.2 仪器和设备a）高效液相色谱-质谱仪（HPLC-MS）b）移液器： 20 L，200 L，1 mL，10 mLc）分析天平（精确到 0.0001 g）：Mettler-Toledo 或类似仪器d）容量瓶：10 mL，100 mL，500 mLe）冷冻离心机： Eppendorf5804R 或类似仪器(0-12000 rpm)f）漩涡混合器：IKA MS3 或类似仪器g）超声仪：2300TH或类似仪器h）10mL 具塞比色管i）塑料离心管：15mL，50 mLj）滤膜：密理博 Millex PTFE 0.45 m 或类似仪器序号浓度水平最终浓度(mg/L）标准物质名称12345614-羟基苯甲酸异丙酯0.020.080.160.20.30.424-羟基苯甲酸异丁酯0.020.080.160.20.30.434-羟基苯甲酸苯酯0.020.080.160.20.30.444-羟基苯甲酸苯甲酯0.020.080.160.20.30.454-羟基苯甲酸正戊酯0.020.080.160.20.30.464-羟基苯甲酸0.10.40.81.01.52.074-羟基苯甲酸甲酯0.10.40.81.01.52.084-羟基苯甲酸丁酯0.020.080.160.20.30.494-羟基苯甲酸丙酯0.020.080.160.20.30.4104-羟基苯甲酸乙酯0.020.080.160.20.30.4T/CAFFCI 45202143.3 分析步骤3.3.1 样品前处理准确称取试料 1.00.1 g（精确至 0.01 g）于 10 mL 具塞比色管中，加入 0.5 %乙酸-甲醇（3.1 d）至刻度，漩涡振荡 2 min 使样品分散均匀，超声 15 min。移取 5 mL 提取溶液于 15 mL 离心管中，加入5 mL 20 %甲醇-水，摇匀，于 7000 r/min 离心 5 min，吸取上清液过 0.45 m PTFE 滤膜后用 HPLC-MS分析。含蜡质样品（唇膏、口红等）的前处理方法：准确称取切割成碎块的试料 1.00.1 g（精确至 0.01 g）于 50 mL 塑料离心管中，加入四氢呋喃10 mL，漩涡振荡 10 min 使样品分散均匀，再加入 10 mL 0.5 %乙酸-甲醇，超声 30 min，于 7000 r/min离心 5 min，取上清液待测。3.3.2 基质校正溶液将与待测样品基质同类型的阴性样品，按步骤 3.3.1 处理，获得阴性样品基质溶液。根据被测样品中 4-羟基苯甲酸及其酯和盐类的浓度水平，用阴性样品基质溶液稀释适量混合标准工作溶液（3.1 h）得到基质校正溶液。不同类型的阴性样品可在平时收集，并经测试确认。3.3.3 测定步骤3.3.3.1 色谱条件液相色谱分析条件参考如下表 5：表 5 液相色谱分析条件参考液相柱Zorbax SB-C182.1 mm 150 mm ，粒径 3.5 m流动相时间（min）甲醇（%）水（%）0.020802.020803.050509.0604014.0604014.1901019.0901019.1208025.02080柱流速0.3 mL/min进样体积5 L柱温30 运行时间25 minT/CAFFCI 4520215若 4-羟基苯甲酸丁酯和 4-羟基苯甲酸异丁酯为阳性时，需采用如下洗脱程序进行分离。流动相时间（min）甲醇（%）水（%）0.0505010.0505015.0802020.08020质谱分析条件参考如下表 6：表 6 质谱分析条件参考离子源电喷雾电离离子源（ESI）干燥气温度350 干燥气流速12 L/min喷雾压力35 psi毛细管电压4000 V电离参数及特征离子Negative，SCAN扫描范围（m/z）60 300碎裂电压（V）175（4-羟基苯甲酸正戊酯）150（其余化合物）Negative，SIM化合物特征离子（m/z）碎裂电压（V）4-羟基苯甲酸异丙酯*179、92.11104-羟基苯甲酸异丁酯*193、92.11154-羟基苯甲酸苯酯*213、93.1954-羟基苯甲酸苯甲酯*227、92.11084-羟基苯甲酸正戊酯*207、92.11254-羟基苯甲酸*137、93.1904-羟基苯甲酸甲酯*151、92.11004-羟基苯甲酸丁酯*193、92.11154-羟基苯甲酸丙酯*179、92.11104-羟基苯甲酸乙酯*165、92.1105注：推荐标注*的特征离子作为定量离子。若该离子因样品内干扰物受到干扰，可选用其它特征离子用于定量。T/CAFFCI 45202163.3.3.2 标准曲线的绘制取标准工作曲线溶液（3.1 i）按色谱条件（3.3.3.1）进行测定，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，标准溶液质量浓度（X，mg/L）为横坐标绘制标准工作曲线。标准溶液液相色谱图参见附录 C 中图 C.1。3.3.3.3 试样定性根据 LC-MS SIM 分析所得样品中化合物的保留时间、特征离子及丰度比进行定性。如遇到阳性样品，可对样品进行 LC-MS SCAN 分析，根据在全扫描模式下与标准样品的特征离子及离子丰度比进行确认。3.3.3.4 试样定量依次取待测样品溶液（3.3.1）注入液相色谱仪，按色谱条件（3.3.3.1）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。根据标准曲线求得样品溶液中目标化合物的含量。试样溶液中的被测物响应值应在标准曲线的线性范围之内；若响应值高于标准曲线的线性范围，可用 20 %甲醇-水稀释样品溶液后测定。注：为保证试样定量的准确性，尽量在 12h 内完成测试过程。3.3.3.5 空白试验除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。3.3.3.6 平行试验按以上步骤，对同一样品进行两次平行试验测定。3.3.4 结果计算试样中 4-羟基苯甲酸及其酯和盐类含量按下式计算：式中：C试样中的含量，mg/kgA试样溶液的仪器读数，g/mLV试样最后定容体积，mLWSeSc试样称样量，g基质校准溶液理论值，g/mL基质校准溶液机读数，g/mL3.3.5 回收率与精密度对于 4-羟基苯甲酸和 4-羟基苯甲酸甲酯，在添加浓度 4 mg/kg20 mg/kg 的范围内，回收率在87.6%-111.0%之间，相对标准偏差小于 3.5%；对于 4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸正戊酯、4-羟基苯甲酸苯甲酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸乙酯，在添加浓度 0.8 mg/kg -4 mg/kg 的浓度范围内，回收率在 82.9%-107.0%之间，相对标准偏差小于 8.9%。3.3.6 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 20%。T/CAFFCI 4520217附录 A（规范性附录）表 A.1 22 种 4-羟基苯甲酸及其盐类和酯类测定方法最低定量限序号中文名称英文名称最低定量限（mg/kg）14-羟基苯甲酸异丙酯Isopropyl 4-hydroxybenzoate0.824-羟基苯甲酸异丁酯Isobutyl 4-hydroxybenzoate0.8（以 4-羟基苯甲酸异丁酯计）34-羟基苯甲酸异丁酯钠Sodium isobutylparaben44-羟基苯甲酸苯酯Phenyl 4-hydroxybenzoate0.854-羟基苯甲酸苯甲酯Benzyl 4-hydroxybenzoate0.864-羟基苯甲酸正戊酯Pentyl 4-hydroxybenzoate0.874-羟基苯甲酸4-Hydroxybenzoic acid;Paraben4（以 4-羟基苯甲酸计）84-羟基苯甲酸钾Potassium paraben94-羟基苯甲酸钠Sodium paraben104-羟基苯甲酸钙Calcium paraben114-羟基苯甲酸甲酯Methylparaben4（以 4-羟基苯甲酸甲酯计）124-羟基苯甲酸甲酯钠Sodium methylparaben134-羟基苯甲酸甲酯钾Potassium methylparaben144-羟基苯甲酸丁酯Butylparaben0.8（以 4-羟基苯甲酸丁酯计）154-羟基苯甲酸丁酯钠Sodium butylparaben164-羟基苯甲酸丁酯钾Potassium butylparaben174-羟基苯甲酸丙酯Propylparaben0.8（以 4-羟基苯甲酸丙酯计）184-羟基苯甲酸丙酯钠Sodium propylparaben194-羟基苯甲酸丙酯钾Potassium propylparaben204-羟基苯甲酸乙酯Ethylparaben0.8（4-羟基苯甲酸乙酯计）214-羟基苯甲酸乙酯钾Potassium ethylparaben224-羟基苯甲酸乙酯钠Sodium ethylparaben注：1）4-羟基苯甲酸异丁酯和 4-羟基苯甲酸异丁酯钠含量以合量表示，其浓度以 4-羟基苯甲酸异丁酯计；2）4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸钾、4-羟基苯甲酸钠、4-羟基苯甲酸钙含量以合量表示，其浓度以 4-羟基苯甲酸计；3） 4-羟基苯甲酸甲酯、 4-羟基苯甲酸甲酯钠、 4-羟基苯甲酸甲酯钾含量以合量表示，其浓度以 4-羟基苯甲酸甲酯计；4） 4-羟基苯甲酸丁酯、 4-羟基苯甲酸丁酯钠、 4-羟基苯甲酸丁酯钾含量以合量表示，其浓度以 4-羟基苯甲酸丁酯计；5） 4-羟基苯甲酸丙酯、 4-羟基苯甲酸丙酯钠、 4-羟基苯甲酸丙酯钾含量以合量表示，其浓度以 4-羟基苯甲酸丙酯计；6） 4-羟基苯甲酸乙酯、 4-羟基苯甲酸乙酯钾、 4-羟基苯甲酸乙酯钠含量以合量表示，其浓度以 4-羟基苯甲酸乙酯计。T/CAFFCI 4520218附录 B（资料性附录）表 B.1 10 种 4-羟基苯甲酸及其酯类标准物质的名称、CAS 号、参考纯度No标准物质英文名称标准物质中文名称CAS 号参考纯度%1Isopropyl 4-hydroxybenzoate4-羟基苯甲酸异丙酯4191-73-599.82Isobutyl 4-hydroxybenzoate4-羟基苯甲酸异丁酯4247-02-31003Phenyl 4-hydroxybenzoate4-羟基苯甲酸苯酯17696-62-7994Benzyl 4-hydroxybenzoate4-羟基苯甲酸苯甲酯94-18-8995Pentyl 4-hydroxybenzoate4-羟基苯甲酸正戊酯6521-29-59864-Hydroxybenzoic acid4-羟基苯甲酸99-96-799.77Methylparaben4-羟基苯甲酸甲酯99-76-399.58Butylparaben4-羟基苯甲酸丁酯94-26-81009Propylparaben4-羟基苯甲酸丙酯94-13-399.510Ethylparaben4-羟基苯甲酸乙酯120-47-8100T/CAFFCI 4520219附录 C（资料性附录）说明：1：4-羟基苯甲酸，保留时间：2.6min2：4-羟基苯甲酸甲酯，保留时间：6.1min3：4-羟基苯甲酸乙酯，保留时间：7.7min4：4-羟基苯甲酸异丙酯，保留时间：9.6min5：4-羟基苯甲酸丙酯，保留时间：10.2min6：4-羟基苯甲酸苯酯，保留时间：11.6min7：4-羟基苯甲酸异丁酯，保留时间：13.3min8：4-羟基苯甲酸丁酯，保留时间：13.7min9：4-羟基苯甲酸苯甲酯，保留时间：13.8min10：4-羟基苯甲酸正戊酯，保留时间：15.9min图 C.1 10 种 4-羟基苯甲酸及其酯类标准物质的液相色谱图