序列分析软DNAMAN的使用方法PPT课件.ppt

nDNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软是一种常用的核酸序列分析软件。由于它功能强大，使用方便，已成件。由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。序列分析工具。打开打开DNAMANDNAMAN，可以看到如下界面：，可以看到如下界面：n第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，个常用主菜单，n第二栏为工具栏：第二栏为工具栏：n第三栏为浏览器栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作在浏览器栏下方的工作区左侧，可见区左侧，可见Channel Channel 工具条，工具条，DNAMAN DNAMAN 提供提供20 20 个个ChannelChannel，点击，点击Channel Channel 工具条上相应的工具条上相应的数字，即可击活相应的数字，即可击活相应的ChannelChannel。n每个每个Channel Channel 可以装入一个序列。将要分析的可以装入一个序列。将要分析的序列（序列（DNA DNA 序列或氨基酸序列）放入序列或氨基酸序列）放入Channel Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。中可以节约存取序列时间，加快分析速度。如何使用如何使用DNAMAN DNAMAN 分析序列分析序列 n1 1将待分析序列装入将待分析序列装入Channel Channel n通过通过File Open File Open 命令打开待分析序列文件，则命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认打开的序列自动装入默认ChannelChannel。n通过通过Sequence/Load Sequence Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入打开文件或将选定的部分序列装入Channel Channel。n通过通过Sequence/Current Sequence/Analysis Sequence/Current Sequence/Analysis Defination Defination 命令打开一个对话框，通过此对命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（话框可以设定序列的性质（DNA DNA 或蛋白质），或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。名称，要分析的片段等参数。2 2 以不同形式显示序列以不同形式显示序列 n通过通过Sequence/Display Sequence Sequence/Display Sequence 命令命令打开对话框，打开对话框，n根据不同的需要，可以选择显示不同的根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。序列转换形式。n对话框选项说明如下：对话框选项说明如下：nSequence&Composition Sequence&Composition 显示序列和成显示序列和成分分 2 2 以不同形式显示序列以不同形式显示序列nReverse Complement Sequence Reverse Complement Sequence 显示待分析序显示待分析序列的反向互补序列列的反向互补序列 nReverse Sequence Reverse Sequence 显示待分析序列的反向序显示待分析序列的反向序列列 nComplement Sequence Complement Sequence 显示待分析序列的互补显示待分析序列的互补序列序列 nDouble Stranded Sequence Double Stranded Sequence 显示待分析序列显示待分析序列的双链序列的双链序列 nRNA Sequence RNA Sequence 显示待分析序列的对应显示待分析序列的对应RNA RNA 序序列列3 3DNA DNA 序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析n将待分析的序列装入将待分析的序列装入ChannelChannel，点击要分析的，点击要分析的ChannelChannel，然后通过，然后通过Restriction/Analysis Restriction/Analysis 命令打开对话框，命令打开对话框，n参数说明如下：参数说明如下：nResults Results 分析结果显示分析结果显示n其中包括：其中包括：nShow summaryShow summary（显示概要）（显示概要）nShow sites on sequenceShow sites on sequence（在结果中显示酶切位点）（在结果中显示酶切位点）nDraw restriction mapDraw restriction map（显示限制性酶切图）（显示限制性酶切图）nDraw restriction patternDraw restriction pattern（显示限制性酶切模式图）（显示限制性酶切模式图）3 3DNA DNA 序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析nIgnore enzymes with more thanIgnore enzymes with more than（忽略大于某设定值（忽略大于某设定值的酶切位点）的酶切位点）nIgnore enzymes with less thanIgnore enzymes with less than（忽略小于某设定值（忽略小于某设定值的酶切位点）的酶切位点）nTarget DNA Target DNA（目标（目标DNA DNA 特性）特性）nCircularCircular（环型（环型DNADNA），），ndam/dcm methylationdam/dcm methylation（dam/dcm dam/dcm 甲基化）甲基化）nall DNA in Sequence Channelall DNA in Sequence Channel（选择此项，在（选择此项，在Sequence Channel Sequence Channel 中的所有序列将被分析，如果选择中的所有序列将被分析，如果选择了了Draw restriction patternDraw restriction pattern，那么当所有的，那么当所有的channel channel 中共有两条中共有两条DNA DNA 时，则只能选择两个酶分析，如果共时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上有三个以上DNA DNA 时，则只能用一个酶分析。）时，则只能用一个酶分析。）n选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下列对话框：列对话框：n参数说明如下：参数说明如下：nEnzymeEnzymen代表（代表（enzyme data fileenzyme data file），点击旁边的下拉按钮，），点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，出现两个默认选项，restrict.enz restrict.enz 和和dnamane.enzdnamane.enz，n如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。件名。n其中其中restrict.enz restrict.enz 数据文件包含数据文件包含180 180 种限制酶，种限制酶，dnamane.enz dnamane.enz 数据文件包含数据文件包含2524 2524 种限制酶。种限制酶。n选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对应的酶被选中，在右边空白框中列出。对应的酶被选中，在右边空白框中列出。n要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如如puc18 multiple cloning sitespuc18 multiple cloning sites），），n然后点击按钮出现下列对话框：然后点击按钮出现下列对话框：n输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切位点。以方便分析特定的酶切位点。nCutter Cutter 酶切识别序列长度；酶切识别序列长度；nEnd End 酶切产生的末端，其中包括，酶切产生的末端，其中包括，nBluntBlunt（平头末端），（平头末端），n5 5OverhangOverhang（5 5突出粘性末端）突出粘性末端）,n3 3Overhang(3Overhang(3突出粘性末端突出粘性末端)，n系统根据系统根据cutter cutter 和和end end 的设定情况的设定情况,在左边酶列表中显示符合条在左边酶列表中显示符合条件的酶。最后，点击按钮执行操作。件的酶。最后，点击按钮执行操作。4 4DNA DNA 序列比对分析序列比对分析（Dot Matrix ComparisionDot Matrix Comparision）n要比较两个序列，可以使用要比较两个序列，可以使用DNAMAN DNAMAN 提供提供的序列比对工具的序列比对工具Dot Matrix Dot Matrix Comparision Comparision（点矩阵比较）通过（点矩阵比较）通过Sequense/Dot matrix comparision Sequense/Dot matrix comparision 命命令打开比对界面，令打开比对界面，n点击对比界面左上角的按钮，出现下列点击对比界面左上角的按钮，出现下列对话框：对话框：参数说明如下：nSequence type Sequence type 序列类型序列类型 nSequence 1 Sequence 1 参加比对的第一序列选择框，框内选项说参加比对的第一序列选择框，框内选项说明如下：明如下：n如果要比对的序列在如果要比对的序列在Channel Channel 中，点击下拉箭头，选中，点击下拉箭头，选择相应的择相应的ChannelChannel，则被选中的，则被选中的Channel Channel 中的序列作为中的序列作为参加比对的第一序列；参加比对的第一序列；n也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在File File 选择选择框上点击即可。通过框上点击即可。通过Length Length 选择参加比对的序列片段。选择参加比对的序列片段。nSequence 2 Sequence 2 参加比对的第二序列选择框；选项说明同参加比对的第二序列选择框；选项说明同上上 nShow Sequence Show Sequence 选择此项，当同源性大于设定值时，选择此项，当同源性大于设定值时，将显示同源性；将显示同源性；nAnnotations Annotations 是否显示注释是否显示注释 nComparision Comparision 比对参数，比对参数，n其中其中Window Window 代表代表Window sizeWindow size（单位比对长度），（单位比对长度），nMismatch Mismatch 代表代表Mismatch sizeMismatch size（单位比对长度中许可（单位比对长度中许可的错配值）要快速比对，需将此项设为的错配值）要快速比对，需将此项设为0 0。nBoth stran Both stran 代表代表Both strandBoth strand（双链比对）选择此项，（双链比对）选择此项，是指用是指用Sequence 2 Sequence 2 中的序列的正链和负链分别和中的序列的正链和负链分别和Sequence 1 Sequence 1 比较。比较。nSequence 2 Sequence 2 正链与正链与Sequence 1 Sequence 1 比较结果用黑色点表比较结果用黑色点表示，示，Sequence 2 Sequence 2 负链比对结果用红色点表示。负链比对结果用红色点表示。nPlot box Plot box 点阵图表显示参数，点阵图表显示参数，nPositionPosition（起点坐标）（起点坐标）nWidthWidth（宽度值）（宽度值）nHeightHeight（高度值）（高度值）nFrame sizeFrame size（边框线粗度值）（边框线粗度值）nDot sizeDot size（点粗度值）（点粗度值）nGridlineGridline（虚线框数）。（虚线框数）。n参数设定好后，点击按钮执行操作。参数设定好后，点击按钮执行操作。5 5序列同源性分析序列同源性分析n（1 1）两序列同源性分析）两序列同源性分析n通过通过Sequence/Two Sequence Alignment Sequence/Two Sequence Alignment 命令打开对命令打开对话框，如下所示：话框，如下所示：n参数说明如下：参数说明如下：nAlignment method Alignment method 比对方法，比对方法，n通常可选通常可选Quick(Quick(快速比对快速比对)或或Smith&Waterman(Smith&Waterman(最佳比最佳比对对)，n当选择快速比对时，设置较小的当选择快速比对时，设置较小的k-tuple k-tuple 值，可以提值，可以提高精确度，高精确度，n当序列较长时，一般要设置较大的当序列较长时，一般要设置较大的k-tuple k-tuple 值。值。k-k-tuple tuple 值可选范围值可选范围2 26 6；n蛋白质序列：蛋白质序列：k-tuple k-tuple 值可选范围值可选范围1 13 3。（2 2）多序列同源性分析）多序列同源性分析n通过打开通过打开Sequence/Multiple Sequence Alignment Sequence/Multiple Sequence Alignment 命命令打开对话框，令打开对话框，n参数说明如下：参数说明如下：nFile File 从文件中选择参加比对的序列从文件中选择参加比对的序列nFolder Folder 从文件夹中选择参加比对的序列从文件夹中选择参加比对的序列nChannel Channel 从从channel channel 中选择参加比对的序列中选择参加比对的序列 nDbase Dbase 从数据库中选择参加比对的序列从数据库中选择参加比对的序列 nRemove Remove 清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的序清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的序列名选择）列名选择）nClear Clear 清除全部序列清除全部序列 n点击按钮，出现方法选择对话框：点击按钮，出现方法选择对话框：n选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：n如果在前一对话框选择的是如果在前一对话框选择的是Fast alignment,Fast alignment,则在此对话框中选择则在此对话框中选择Quick alignment,Quick alignment,否则选择否则选择 Dynamic alignment Dynamic alignment 即可。其它参数即可。其它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。n点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如Tree/homology tree Tree/homology tree 命令）。命令）。n显示蛋白质二级结构（显示蛋白质二级结构（Protein Secondary Structure Protein Secondary Structure 命令），命令），n绘制限制性酶切图（绘制限制性酶切图（Restriction Analysis Restriction Analysis 命令）等。命令）等。6.PCR 6.PCR 引物设计引物设计n首先，将目标首先，将目标DNA DNA 片段装入片段装入Channel,Channel,并激活并激活ChannelChannel。n点击主菜单栏中的点击主菜单栏中的Primer Primer 主菜单，出现下拉菜单，主菜单，出现下拉菜单，n点击点击Design PCR Primers for DNA Design PCR Primers for DNA 命令，出现下列对话框：命令，出现下列对话框：参数说明如下：参数说明如下：nPrimer locations on target Primer locations on target 引物定位引物定位 n其中包括下列选项：其中包括下列选项：nProduct sizeProduct size（扩增目的片段大小）（扩增目的片段大小）nSense primer(Sense primer(正向引物选择区正向引物选择区)nAntisense primer(Antisense primer(反向引物选择区反向引物选择区)nPrimer Primer 引物特性包括引物特性包括Length(Length(引物长度引物长度)，Tm Tm 值值,GC,GC 含量等参数；含量等参数；nReject primer Reject primer 引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）n包括下列选项：包括下列选项：n3 3dimer(dimer(可形成可形成3 3端自我互补的碱基数端自我互补的碱基数)nHairpin stem(Hairpin stem(可形成发卡颈环结构的碱基数可形成发卡颈环结构的碱基数)nPolyN(PolyN(多聚碱基多聚碱基)n3 3Uique(3Uique(3端严格配对碱基数端严格配对碱基数)nAll matches(All matches(引物互补配对百分数引物互补配对百分数)nConsentrations Consentrations 浓度设定浓度设定nProduct for hybridyzatProduct for hybridyzatnPCR PCR 产物用于产物用于Southern Blot Southern Blot 探针杂交探针杂交 7 7画质粒模式图画质粒模式图n我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，常常需要质粒图。常常需要质粒图。DNAMAN DNAMAN 提供强大的绘质粒图功能，能满足我们提供强大的绘质粒图功能，能满足我们的需要。的需要。n通过通过Restriction/Draw map Restriction/Draw map 命令打开质粒绘图界面：命令打开质粒绘图界面：将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成“I I”时，单击鼠标左键，出时，单击鼠标左键，出现如下菜单：现如下菜单：n菜单说明如下：菜单说明如下：nPosition Position 当前位置当前位置nAdd Site Add Site 添加酶切位点添加酶切位点nAdd Element Add Element 添加要素添加要素nAdd Text Add Text 添加文字添加文字nInsert Fragment Insert Fragment 插入片断插入片断nCopy Fragment Copy Fragment 复制片断复制片断nCut Fragment Cut Fragment 剪切片断剪切片断 nRemove Fragment Remove Fragment 清除片断清除片断nFrame Thickness Frame Thickness 边框线粗细调节边框线粗细调节 n点击点击Add Site Add Site 选项，出现对话框：选项，出现对话框：n参数说明如下：参数说明如下：nName Name 要添加的酶切位点的名称要添加的酶切位点的名称(例如例如HindIII)HindIII)nPosition Position 位置（以碱基数表示）位置（以碱基数表示）n点击点击Add Element Add Element 选项，出现如下对话框：选项，出现如下对话框：参数说明如下：参数说明如下：nType Type 要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）nColor/Pattern Color/Pattern 填充色（共有填充色（共有16 16 种颜色供选择）种颜色供选择）nName Name 要素名称要素名称nStart/End/Size Start/End/Size 要素起点要素起点/终点终点/粗细度粗细度 核酸序列的一般分析流程核酸序列的一般分析流程 n1.1 1.1 核酸序列的检索核酸序列的检索 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcghttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotidei?db=Nucleotide 1.2 1.2 核酸序列的同源性分析核酸序列的同源性分析 n1.2.1 1.2.1 基于基于NCBI/BlastNCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析软件的核酸序列同源性分析 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgihttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi 1.2.2 1.2.2 核酸序列的两两比较核酸序列的两两比较 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlhttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html n1.2.3 1.2.3 核酸序列的批量联网同源性分析核酸序列的批量联网同源性分析(方案方案)n1.3 1.3 核酸序列的电子延伸核酸序列的电子延伸 1.3.1 1.3.1 利用利用UniGeneUniGene数据库进行电子延伸数据库进行电子延伸(方案方案)n1.3.2 1.3.2 利用利用TigemTigem的的EST MachineEST Machine进行电子延伸进行电子延伸 EST Extractor:EST Extractor:http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.htmhttp:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html l|EST Assembly:EST Assembly:http:/www.tigem/ESTmachine.htmlhttp:/www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 1.3.3 利用利用THCTHC数据库对核酸序列进行电子延伸数据库对核酸序列进行电子延伸 http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.htmlhttp:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.htmln1.4 1.4 核酸序列的开放阅读框架分析核酸序列的开放阅读框架分析 1.4.11.4.1基于基于NCBI/ORF finderNCBI/ORF finder的的ORFORF分析分析 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmlhttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html n1.5 1.5 基因的电子表达谱分析基因的电子表达谱分析 n1.5.1 1.5.1 利用利用UniGeneUniGene数据库进行电子表达谱分析（方案）数据库进行电子表达谱分析（方案）n1.5.21.5.2利用利用TigemTigem的电子原位杂交服务器进行电子表达的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析谱分析 http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.htmlhttp:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.htmln1.6 1.6 核酸序列的电子基因定位分析核酸序列的电子基因定位分析 1.6.1 1.6.1 利用利用STSSTS数据库进行电子基因定位数据库进行电子基因定位 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sthttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/epcr.cgis/epcr.cgi 1.6.2 1.6.2 利用利用UniGeneUniGene数据库进行电子基因定数据库进行电子基因定位（方案）位（方案）THANK YOUSUCCESS2024/3/9 周六27可编辑n1.7 cDNA1.7 cDNA的基因组序列分析的基因组序列分析 1.7.1 1.7.1 通过从通过从NCBINCBI查询部分基因组数据库进行基因组查询部分基因组数据库进行基因组序列的分析序列的分析(方案方案)1.7.2 1.7.2 通过从通过从NCBINCBI查询全部基因组数据库进行基因组查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析序列的分析 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgihttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs?F=HsBlast.html&ORG=Hs 1.7.3 1.7.3 通过从通过从Sanger CentreSanger Centre查询基因组数据库进行基查询基因组数据库进行基因组序列的分析因组序列的分析 http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtmlhttp:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml n1.8 1.8 基因组序列的初步分析基因组序列的初步分析 1.8.1 1.8.1 基因组序列的内含子基因组序列的内含子/外显子分析外显子分析 http:/www.bioscience.org/urllists/gehttp:/www.bioscience.org/urllists/genefind.htmnefind.htm 1.8.2 1.8.2 基因组序列的启动子分析基因组序列的启动子分析 http:/www-http:/www-hgc.lbl.gov/projects/promoter.htmlhgc.lbl.gov/projects/promoter.html n1.9核酸序列的注册 1.9.1 EST序列的注册(方案)1.9.2 较长或全长cDNA序列的注册(方案)n1.10待分析序列所对应的已知克隆的获取 http:/image.llnl.gov 引 物 设 计n引物n引物的重要性n引物设计的原则n引物与PCRn引物设计软件n如何使用Primer Premier 5.0n引物同源性分析引物（primers)n引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。3355Sense primerAntisense primer引物的重要性n在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计原则n引物长度 n碱基分布的均衡性nTm值n引物二级结构n引物3端n引物5端n引物的内部稳定性n引物的保守性与特异性n扩增区域的二级结构引物长度 n一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。碱基分布的均衡性n同一碱基连续出现不应超过5个nGC含量一般40-60%nGC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性nGC含量太高也易于引发非特异扩增。引物Tm值n一般要求：55-65。n计算：n对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算n对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。nTm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6 log(K+/(1+0.7 K+)-273.15引物二级结构n引物二聚体n尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基互补n发夹结构n尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。引物3端n引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物5端n引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。n5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。n5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。n5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。引物的内部稳定性n过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。n现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。n仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。n如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。引物的保守性与特异性n保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别n特异性：避免非特异性扩增扩增区域的二级结构n模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。n扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/moln引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30nTm product=81.5+16.6 log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length引物与PCRn引物浓度：一般为0.1-0.5umol/Ln引物浓度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O(单位：L)n退火温度n最适退火温度（Ta Opt）=0.3(Tm of primer)+0.7 (Tm of product)25n一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。引物设计软件nPrimer Premier 5.0 n生物软件网下载n安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。nOligonprimer 3nThe Primer GeneratornDNAMAN如何使用Primer Premier 5.0n引物设计n一般引物设计n5带酶切位点引物设计n巢式PCR引物设计n多重PCR引物设计n探针设计n引物评析引物同源性分析n用Blastn软件进行同源性比较n尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物n选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物n选择两个引物3端与同一非目的基因不同源的序列作为引物设计题目一设计题目一 xxxx微生物微生物xxxx酶基因的克隆及其在酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达n目的基因目的基因n编码如耐高温编码如耐高温-淀粉酶、生淀粉酶、普鲁兰淀粉酶、生淀粉酶、普鲁兰酶、植酸酶、碱性甘露聚糖酶、脂肪酶、碱性酶、植酸酶、碱性甘露聚糖酶、脂肪酶、碱性蛋白酶、谷氨酰胺转移酶、木聚糖酶、纤维素蛋白酶、谷氨酰胺转移酶、木聚糖酶、纤维素降解酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、荧光素酶、降解酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、荧光素酶、葡萄糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、已糖葡萄糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、已糖激酶、葡萄激酶、葡萄-6-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、吡喃葡果酸脱氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、吡喃葡萄糖激酶、单宁酶萄糖激酶、单宁酶n表达载体：表达载体：pET28apET28a（+）-E.coliE.colin要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序列，利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶列，利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶切分析及切分析及5 5和和3 3末端引物的设计末端引物的设计n提交具体的实验方案（从提取全基因组提交具体的实验方案（从提取全基因组DNADNA到目的基因到目的基因克隆克隆,与表达载体的重组、表达及活性分析）与表达载体的重组、表达及活性分析）n讨论，优化实验方案讨论，优化实验方案好的设计方案好的设计方案成功的一半成功的一半n要求提交打印稿和相应电子版n下学期第2周内完成（约3月15日左右）n鼓励提前完成n各个小组派一个代表报告其实验方案，全班同学对其进行讨论，找出不足和欠缺之处，并加以改正。方案设计报告方案设计报告按照研究论文格式n标题n作者n摘要n前言n材料和方法n结果与讨论n参考文献Thanks！THANK YOUSUCCESS2024/3/9 周六54可编辑