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多位点序列分型多位点序列分型 Multilocus Sequencing TypingMLST Contents两种分型方法的比较两种分型方法的比较 MLST的步骤的步骤MLST的方案设计的方案设计MLST的由来的由来实例分析实例分析多位点酶电泳（Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE）根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异 选定管家酶 淀粉胶检测 不同电泳迁移速率 电泳谱等位基因的变异性揭示微生物基因多样性MLEEMLEE的缺点的缺点不能推断特殊位点的碱基序列不能推断特殊位点的碱基序列不同实验室间的分型结果不能进行比较不同实验室间的分型结果不能进行比较MLSTMLST的首次使用的首次使用MLSTMLST是由多位点酶电泳是由多位点酶电泳(MLEE)(MLEE)衍生出来的衍生出来的 一种分型方法一种分型方法在在19981998年年,Maiden,Maiden等首次将等首次将MLSTMLST应用于脑膜炎奈瑟菌分应用于脑膜炎奈瑟菌分型型多位点序列分型多位点序列分型（MLST）一种基于核酸序列测定的细菌分型方一种基于核酸序列测定的细菌分型方法法通过通过PCRPCR扩增多个管家基因内部片段扩增多个管家基因内部片段测定其序测定其序列，列，分析菌株的变异分析菌株的变异MLSTMLST的原理的原理MLSTMLST方法一般测定方法一般测定610610个管家基因内部个管家基因内部400600bp400600bp的核的核苷酸序列苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱指定的顺序排列就是它的等位基因谱 ，也即是这株菌也即是这株菌的的序列型（序列型（sequence type,STsequence type,ST）。）。这样得到的每个这样得到的每个STST均代表一组单独的核苷酸序列信息均代表一组单独的核苷酸序列信息 。序列型（序列型（STST）序列型（序列型（Sequence-typying,STs Sequence-typying,STs）等同于）等同于MLEEMLEE得出得出的电泳型的电泳型(Electrophoretic type,ET(Electrophoretic type,ET）通过比较通过比较STST可以发现菌株的相关性可以发现菌株的相关性,即密切相关菌株具即密切相关菌株具有相同的有相同的STST或仅有极个别基因位点不同的或仅有极个别基因位点不同的ST,ST,而不相关而不相关菌株的菌株的STST至少有至少有3 3个或个或3 3个以上基因位点不同个以上基因位点不同MLSTMLST分析方法分析方法MLSTMLST技术针对看家基因设计引物对其进行技术针对看家基因设计引物对其进行PCRPCR扩增和测扩增和测序序,得出每个菌株各个位点的等位基因数值得出每个菌株各个位点的等位基因数值,然后进行等位基因图谱然后进行等位基因图谱(allelic profile)(allelic profile)或序列类型或序列类型(sequence types,STs)(sequence types,STs)鉴定，鉴定，再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrix pair-(matrix pair-wise differences)wise differences)等方法构建系统树图进行聚类分析。等方法构建系统树图进行聚类分析。MLSTMLST方案的设计方案的设计三要素：三要素：选择经过初步筛选的菌株选择经过初步筛选的菌株选择具有独特特征的基因位点选择具有独特特征的基因位点设计用于基因扩增和序列测定的引物设计用于基因扩增和序列测定的引物1.1.菌株的选择菌株的选择根据已有的分型方法和流行病学资料，选择根据已有的分型方法和流行病学资料，选择100100株左右株左右具有代表性的菌株作为分析对象。具有代表性的菌株作为分析对象。理论上，这些选定的菌株要代表所研究细菌的群体，理论上，这些选定的菌株要代表所研究细菌的群体，而不是仅仅包含那些对人致病的克隆。而不是仅仅包含那些对人致病的克隆。收集的菌株最好具有代表性，不仅仅由一个亚型组成。收集的菌株最好具有代表性，不仅仅由一个亚型组成。2.2.管家基因的确定管家基因的确定全基因组序列的测定大大方便全基因组序列的测定大大方便MLST位点的选择一般位点的选择一般选择选择10到到20株菌评价株菌评价10至至15个备选位点。个备选位点。最终最终采用采用 7个位点进行后续实验和分析。个位点进行后续实验和分析。如果需要提如果需要提高分辨力，可以加入高分辨力，可以加入个别个别非保守的基因，例如表面抗非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，这样比增加管家基因的个数将原基因或者毒力基因，这样比增加管家基因的个数将更有效更有效3.3.引物的设计引物的设计目的片段长度：目的片段长度：400600bp400600bp所有引物调整为同一退火温度，所有引物调整为同一退火温度，以适用于大范围流行以适用于大范围流行病学监测和群体研究病学监测和群体研究为了发现引物结合位点可能存在的变异，为了发现引物结合位点可能存在的变异，每个位点都每个位点都应该设计一对以上引物应该设计一对以上引物http:/pubmlst.org/实际运用中，对于已有的成熟MLST方案的细菌，可直接从MLST数据库中获取方案。http:/pubmlst.org/MLSTMLST的步骤（二）的步骤（二）核酸序列信息的获取核酸序列信息的获取收集收集病原病原微生微生物物标本本基因基因组DNA的的获取取PCR扩增增目的目的基因基因片段片段目的目的片段片段的核的核酸序酸序列列测定定整合整合核酸核酸序列序列信息信息MLSTMLST的步骤（三）的步骤（三）结果分析结果分析结果分析结果分析根据分析的细菌群体组成根据分析的细菌群体组成1.以等位基因编号和以等位基因编号和ST编号为基本分析单位编号为基本分析单位 提交到提交到MLST分析网络服务器分析网络服务器（）START和和eBURST 2.直接分析核苷酸序列直接分析核苷酸序列 上传到上传到GenBank比对服务器进行比对服务器进行BLAST比对验证比对验证数据分析得到数据分析得到等位基因图谱等位基因图谱新的新的STs则找出则找出对应的对应的clonal complex在数据库中在数据库中找出相应的找出相应的STs群体进化研究群体进化研究分子流行病学分子流行病学研究研究菌群结构菌群结构调查调查菌群遗传菌群遗传学分析学分析疾病的全疾病的全球性监控球性监控鉴定暴发鉴定暴发性疾病的性疾病的病原体病原体MLST结果分析流程图ST和克隆型和克隆型遗传学上具有相关性但并不相同的细菌的集合遗传学上具有相关性但并不相同的细菌的集合,被称为被称为是同源复合体是同源复合体(The clonal complex),(The clonal complex),也叫克隆型。也叫克隆型。以其核心的基因型来命名以其核心的基因型来命名。MLSTMLST和和PFGEPFGE的比较的比较两种不同的分子分型技术两种不同的分子分型技术不同分子分型方法比较不同分子分型方法比较分型方法分型方法分型力分型力可分辨率可分辨率可重复性可重复性结果易解结果易解释性释性易操作性易操作性费用费用RAPD较好较好较高较高一般一般一般一般简便简便低低PCR-RFLP好好一般一般一般一般一般一般简便简便低低AFLP较好较好高高一般一般好好简便简便中中MLST较好较好较高较高好好好好简便简便较高较高PFGE好好高高好好好好复杂复杂较高较高MLVA很好很好高高好好好好简便简便高高MLSTMLST和和PFGEPFGE的比较的比较两种不同的分子分型技术两种不同的分子分型技术脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE）比较所确定的高度变异片段高分辨力不适于进行全面的流行病学调查及生物进化分析不同实验间重复性较差标准化技术数据库多位点序列分型（多位点序列分型（MLST）比较进化较慢的位点标准化技术数据库不同实验室间重复性好不适用于同血清型菌株间比较MLSTMLST实例分析实例分析1.MLST方案（同MLST Database）2.核酸序列信息的获取2.1样本来源54株结肠弯曲菌(C.coli)分离于2002年零售禽肉中，均为不重复菌株2.2PCR扩增2.3测序3.结果分析3.1.MLST数据提交 将测序序列在线递交至弯曲菌MLST数据库()进行分析,得出等位基因型、序列型以及序列型克隆系。3.2UPGMA分析ST序列型的发育树 谢谢！