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第六章 植物基因工程（下）三、改进转基因的技术三、改进转基因的技术1.转基因植物中外源基因的沉默转基因植物中外源基因的沉默2.提高外源基因表达水平的策略提高外源基因表达水平的策略四、农作物基因工程四、农作物基因工程五、生物反应器五、生物反应器六、转基因植物的安全性六、转基因植物的安全性三、改进转基因的技术三、改进转基因的技术在在转转基基因因研研究究中中经经常常碰碰到到一一种种引引起起基基因因失失活活的的现现象称为象称为基因沉默基因沉默（gene silencinggene silencing）。）。基基因因沉沉默默可可以以发发生生在在染染色色体体DNADNA、转转录录和和转转录录后后3 3种不同的层次上：种不同的层次上：1.1.发发生生在在染染色色体体DNADNA水水平平上上的的转转基基因因沉沉默默叫叫位位置置效应效应；2.2.发发生生在在RNARNA转转录录水水平平上上的的转转基基因因沉沉默默叫叫转转录录失失活活；3.3.发生在转录后水平的转基因沉默叫发生在转录后水平的转基因沉默叫共抑制共抑制。（一）转基因植物中外源基因的沉默（一）转基因植物中外源基因的沉默1.1.位置效应位置效应位位置置效效应应是是指指基基因因受受寄寄主主染染色色体体基基因因组组上上的的插插入入部位及周围核苷酸组成的影响。部位及周围核苷酸组成的影响。如如果果整整合合发发生生在在转转录录活活跃跃的的常常染染色色体体上上，毗毗邻邻寄寄主基因的调控系列将影响到外源基因的表达；主基因的调控系列将影响到外源基因的表达；如如果果插插入入到到重重复复DNADNA或或异异染染色色体体中中或或旁旁边边，外外源源基因可能会失活。基因可能会失活。2.DNA2.DNA甲基化甲基化植植物物DNA DNA 甲甲基基化化程程度度是是较较高高的的，核核基基因因组组中中几几乎乎20%-30%20%-30%的胞嘧啶处于甲基化状态。的胞嘧啶处于甲基化状态。外外源源基基因因编编码码区区域域的的甲甲基基化化对对基基因因表表达达的的作作用用不不明显，通常检测不到对转录的影响；明显，通常检测不到对转录的影响；外外源源基基因因启启动动子子区区域域或或5 5端端非非编编码码区区域域的的甲甲基基化化会会引引起起启启动动子子失失活活或或不不能能起起始始转转录录，在在转转录录水水平上诱导了外源基因的沉默。平上诱导了外源基因的沉默。3.3.重复序列诱发基因沉重复序列诱发基因沉默默通通过过电电击击法法等等将将DNADNA直直接接导导入入植植株株，外外源源基基因因往往往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内。往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内。重重复复序序列列诱诱发发的的基基因因沉沉默默（repeat repeat induced induced gene gene silencing,silencing,RIGSRIGS）与与重重复复序序列列间间的的异异位位配配对和对和DNADNA的甲基化相关。的甲基化相关。一一般般一一个个位位点点插插入入的的外外源源基基因因的的拷拷贝贝数数越越多多，失失活的程度越高。活的程度越高。3.3.重复序列诱发基因沉重复序列诱发基因沉默默解决方案有：解决方案有：1.1.对对外外源源基基因因及及启启动动子子进进行行改改造造，保保证证设设计计的的序序列列与与植植物基因组有很短的同源序列，避免异位配对的发生；物基因组有很短的同源序列，避免异位配对的发生；2.2.使使用用基基因因枪枪法法及及电电击击法法等等直直接接DNADNA导导入入法法容容易易引引起起多多拷拷贝贝基基因因的的插插入入，而而使使用用农农杆杆菌菌转转化化法法可可在在一一定定的的程程度度上避免多拷贝基因的插入；上避免多拷贝基因的插入；3.3.在在筛筛选选作作为为育育种种材材料料的的转转基基因因植植物物时时，尽尽量量选选择择单单拷拷贝贝插插入入的的个个体体，采采用用RT-PCRRT-PCR法法可可以以筛筛选选到到单单拷拷贝贝插插入入的的个体。个体。4.4.共抑共抑制制共共抑抑制制是是一一种种基基因因间间相相互互作作用用引引起起的的沉沉默默现现象象。当当引引入入一一个个与与植植物物内内源源基基因因有有部部分分同同源源性性的的DNA DNA 时时，不不但但外外源源基基因因不不能能高高效效表表达达，反反而而抑抑制制了了内内源基因的表达。源基因的表达。二、提高外源基因表达水平的策略二、提高外源基因表达水平的策略1.1.转化方法的影转化方法的影响响基因直接转化法容易引起多拷贝转基因在寄主细基因直接转化法容易引起多拷贝转基因在寄主细胞中的整合，导致转基因沉默，而农杆菌介导的胞中的整合，导致转基因沉默，而农杆菌介导的遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少，可以在遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少，可以在一定的程度上避免这个问题。一定的程度上避免这个问题。2.2.使用信号肽使用信号肽植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。为提高转基因在植物的专门组织中的引导作用。为提高转基因在植物的专门组织中的表达，除使用专门的启动子外，使用特定的信号表达，除使用专门的启动子外，使用特定的信号肽序列是必需的。肽序列是必需的。3.3.选择强启动子和诱导型启动选择强启动子和诱导型启动子子选择合适的植物启动子选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的一个有效手是增强外源基因表达的一个有效手段。通常来源于双子叶植物的启动子，在双子叶植物中的段。通常来源于双子叶植物的启动子，在双子叶植物中的表达效率要比在单子叶植物中高得多，反之亦然。表达效率要比在单子叶植物中高得多，反之亦然。有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达，而有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达，而要求其能够在转基因植物中实现特异的时空表达。这就需要求其能够在转基因植物中实现特异的时空表达。这就需要使用诱导型启动子，其在特定的条件下诱导在某些器官要使用诱导型启动子，其在特定的条件下诱导在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达。组织中特异性地启动目的基因的表达。4.4.强终止强终止子子在在植植物物转转化化的的研研究究中中，两两个个常常用用的的终终止止子子是是CaMV CaMV 35S35S启启动动子子和和根根瘤瘤土土壤壤杆杆菌菌T-DNAT-DNA的的胭胭脂脂氨氨基基酸酸合合成酶基因的成酶基因的nosnos终止子。终止子。其其PolyAPolyA尾尾巴巴和和其其中中的的茎茎-环环结结构构，可可有有效效地地抵抵御御核酸酶的水解作用，使核酸酶的水解作用，使mRNA mRNA 分子保持稳定性。分子保持稳定性。5.5.消除甲基化的影响消除甲基化的影响已已知知用用5-5-氮氮胞胞嘧嘧啶啶处处理理植植株株具具有有很很好好的的抑抑制制甲甲基基化和脱甲基化作用。化和脱甲基化作用。人人们们还还试试图图在在载载体体上上加加上上去去甲甲基基化化功功能能的的序序列列来来防止甲基化。防止甲基化。6.6.使用植物偏爱的密码子使用植物偏爱的密码子转转基基因因的的密密码码子子和和植植物物基基因因组组DNADNA的的不不同同容容易易引引起起甲基化和表达效率低。甲基化和表达效率低。在在遗遗传传转转化化前前有有必必要要优优化化转转基基因因的的密密码码子子，尽尽量量使用一些植物偏爱的密码子。使用一些植物偏爱的密码子。7.7.使用使用MARMAR序列序列基基质质结结合合区区（matrix matrix attachment attachment region,region,MARMAR）也也叫叫核核骨骨架架结结合合区区（scaffold scaffold attachment attachment region,region,SARSAR）长长度度一一般般为为300-1000bp300-1000bp，它它可可以以与与核核骨骨架架结结合合，在在两两个个MAR MAR 间间的的染染色色质质区区域域可可形形成成DNA DNA 环环，环环的的大大小小为为5-200kb5-200kb，每每一一个个环环为为一一个个独独立的表达结构。立的表达结构。利利用用MAR MAR 的的这这一一特特性性，可可创创造造一一个个独独立立的的结结构构域域，减减少少了了插插入入位位点点附附近近染染色色质质的的影影响响，从从而而可可以以避避免免位位置置效效应应的的影影响响，还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。8.8.使用增强子使用增强子动动物物免免疫疫球球蛋蛋白白K K链链基基因因的的增增强强子子可可在在细细胞胞发发育育的的特特定定阶阶段段指指导导该该基基因因区区段段的的去去甲甲基基化化，启启动动基基因因的转录。的转录。在在植植物物中中分分离离相相应应的的增增强强子子，并并和和外外源源基基因因重重组组，可确保转基因按合适的调控模式表达。可确保转基因按合适的调控模式表达。9.9.外源基因的修饰和改外源基因的修饰和改造造（1 1）避免基因间的同源性；）避免基因间的同源性；（2 2）避免重复序列的出现；）避免重复序列的出现；（3 3）在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点。）在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点。（1 1）避免基因间的同源性）避免基因间的同源性重重复复或或同同源源序序列列是是基基因因沉沉默默的的诱诱因因，在在构构建建表表达达载载体体时时，应应尽尽量量降降低低所所设设计计的的序序列列与与内内源源基基因因的的同同源源性性，以以减减少少或或避免配对避免配对。应应尽尽量量使使外外源源DNADNA碱碱基基组组成成与与植植物物DNADNA碱碱基基组组成成一一致致，避避免免被植物限制修饰机制所识别。被植物限制修饰机制所识别。也也可可采采用用定定点点插插入入方方法法，将将外外源源基基因因插插入入到到具具有有与与其其相相似似碱基组成的染色体区域。碱基组成的染色体区域。（2 2）避免重复序列的出现）避免重复序列的出现在在筛筛选选作作为为育育种种材材料料的的转转基基因因植植物物时时，应应尽尽量量选选择单拷贝插入的个体，来减少重复序列的存在。择单拷贝插入的个体，来减少重复序列的存在。THANK YOUSUCCESS2024/3/12 周二21可编辑（3 3）在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点）在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点基基因因5 5端端和和3 3端端非非翻翻译译序序列列及及密密码码子子周周边边序序列列都影响到基因的高效表达。都影响到基因的高效表达。起起始始密密码码子子周周边边序序列列对对翻翻译译水水平平有有明明显显影影响响，通通常常植植物物起起始始密密码码子子周周边边序序列列有有如如下下特特征征：AACAAUGGCAACAAUGGC，起始甲硫氨酸后紧跟丙氨酸，起始甲硫氨酸后紧跟丙氨酸。10.10.以叶绿体作为转化受体以叶绿体作为转化受体叶叶绿绿体体的的基基因因转转录录和和翻翻译译机机制制类类似似于于原原核核生生物物，在在叶绿体内的转化有如下优点：叶绿体内的转化有如下优点：A.A.可能大量表达外源基因；可能大量表达外源基因；B.B.叶叶绿绿体体结结构构简简单单，背背景景清清楚楚，便便于于体体外外遗遗传传操操作；作；C.C.能更有效的控制外源基因，防止向环境释放。能更有效的控制外源基因，防止向环境释放。11.11.使用一些病毒编码蛋白使用一些病毒编码蛋白最最近近研研究究证证明明一一些些病病毒毒能能编编码码某某种种抑抑制制寄寄主主基基因因沉沉默默的的蛋蛋白白质质。克克隆隆这这些些蛋蛋白白的的基基因因，改改造造后后与与目目的的基基因因相相连连，转转入入植植物物时时同同时时表表达达，可可在在一一定定程度上抑制基因沉默的出现。程度上抑制基因沉默的出现。12.12.在有性生殖后代中筛选单拷贝植在有性生殖后代中筛选单拷贝植株株可可在在分分子子水水平平和和育育种种过过程程中中筛筛选选单单拷拷贝贝的的转转基基因因植植株株，通通过过PCRPCR技技术术、SouthernSouthern杂杂交交等等方方法法进进行行筛筛选。选。四、农作物基因工程四、农作物基因工程（一）利用转基因植物来生产蛋白药物（一）利用转基因植物来生产蛋白药物哺乳类动物细胞产生蛋白药物极其昂贵，而植物生长成本较哺乳类动物细胞产生蛋白药物极其昂贵，而植物生长成本较低可换得大量蛋白质药物。在实验室里进行的有：如人的脑低可换得大量蛋白质药物。在实验室里进行的有：如人的脑腓肽、人血清蛋白、及小鼠的单克隆抗体等。腓肽、人血清蛋白、及小鼠的单克隆抗体等。例例如如将将小小鼠鼠的的抗抗体体轻轻链链和和重重链链基基因因分分别别在在两两种种烟烟草草植植物物中中表表达达，转转基基因因植植物物由由根根瘤瘤农农杆杆菌菌介介导导的的基基因因转转化化方方法法构构建建。然然后后两两种种植植物物品品系系杂杂交交，产产生生的的子子代代植植物物表表达达小小鼠鼠的的重重链链轻轻链链两两种种蛋蛋白白。从从烟烟草草的的叶叶子子里里可可检检测测到到完完整整的的抗抗体体分分子子，含含量量为叶细胞蛋白总量的为叶细胞蛋白总量的1.5%1.5%。（二）抗虫转基因作物（二）抗虫转基因作物天天 然然 的的 微微 生生 物物 杀杀 虫虫 剂剂 如如 苏苏 云云 金金 芽芽 孢孢 杆杆 菌菌（Bacillus Bacillus thurigiensis,thurigiensis,BtBt），该该细细菌菌能能产产生生晶晶体体毒毒蛋蛋白白，对对许许多多昆昆虫的幼虫有毒性，但对成虫和脊髓动物无作用。虫的幼虫有毒性，但对成虫和脊髓动物无作用。BtBt合合成成的的只只是是无无活活性性的的毒毒素素原原蛋蛋白白。幼幼虫虫接接触触毒毒素素原原蛋蛋白白后后，其其消消化化道道中中的的蛋蛋白白酶酶便便将将毒毒素素原原蛋蛋白白水水解解成成毒毒性性片片段段，并并与与幼幼虫虫中中肠肠细细胞胞表表面面的的受受体体结结合合，从从而而干干扰扰细细胞胞的的正正常常功功能能。最近含修饰的最近含修饰的BtBt毒蛋白的转基因棉花已问世。毒蛋白的转基因棉花已问世。（三）抗病毒作物（三）抗病毒作物 转基因植物利用一些转基因植物利用一些病毒包衣蛋白基因病毒包衣蛋白基因构建构建了抗病毒优良品种，如：烟草花叶病毒基因组编码了抗病毒优良品种，如：烟草花叶病毒基因组编码四种多肽：两个复制酶亚基、一个包衣蛋白、一个四种多肽：两个复制酶亚基、一个包衣蛋白、一个与细胞结合有关的蛋白。与细胞结合有关的蛋白。由根瘤农杆菌介导的基因转化构建了表达。由根瘤农杆菌介导的基因转化构建了表达。TMVTMV包衣蛋白包衣蛋白CPCP的转烟草植物，该转基因植物在的转烟草植物，该转基因植物在TMVTMV存在时，能抗病毒感染存在时，能抗病毒感染3030天左右，正常植物天左右，正常植物3434天天之后使被之后使被TMVTMV感染。感染。最近的实验结果表明，最近的实验结果表明，CPCP表达抵御病毒侵表达抵御病毒侵袭也在其它谷物中成功，如马铃薯、番茄、苜蓿等。袭也在其它谷物中成功，如马铃薯、番茄、苜蓿等。（四）抗除草剂转基因作物（四）抗除草剂转基因作物 杂草的存在可使农作物减产杂草的存在可使农作物减产10%10%。（1 1）强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因：）强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因：5-5-烯烯醇醇式式丙丙酮酮莽莽草草酸酸3 3磷磷酸酸盐盐合合成成酶酶（EPSPSEPSPS），是是植植物物叶叶绿绿体体中中芳芳香香族族必必需需氨氨 基基 酸酸 生生 物物 合合 成成 中中 的的 一一 个个 酶酶，而而 除除 草草 剂剂glyphosateglyphosate通通过过抑抑制制该该酶酶而而杀杀死死植植物物的的。很很少少的的剂量就能杀灭广谱杂草。剂量就能杀灭广谱杂草。将将来来自自矮矮牵牵牛牛花花的的EPSPS EPSPS cDNAcDNA转转入入植植物物中中，转转基基因因酶酶活活比比非非转转基基因因植植物物提提高高了了2020倍倍，使得转基因植物较好地耐受使得转基因植物较好地耐受glyphosateglyphosate的存在。的存在。（2 2）表达除草剂的突变靶蛋白（酶）基因：）表达除草剂的突变靶蛋白（酶）基因：溴溴腈腈衍衍生生物物（BromoxynilBromoxynil）是是一一种种抑抑制制光光合合成成反反应应的的除除草草剂剂，Klebsiella Klebsiella ozaenaeozaenae有有一一基基因因编编码码一一种种腈腈水水解解酶酶，能能将将BromoxynilBromoxynil降降解解为为3,3,5-5-二二溴溴-4-4-羟羟-苯苯甲甲酸酸。将将该该基基因因转转入入烟烟草草中中已已获成功。获成功。（四）抗除草剂转基因作物（四）抗除草剂转基因作物 环环境境大大气气层层中中的的氧氧自自由由基基（超超氧氧化化物物负负离离子）对植物的损伤是严重的。子）对植物的损伤是严重的。在在生生理理状状况况下下，植植物物体体内内的的超超氧氧化化歧歧化化酶酶（SODSOD）将将之之转转化化为为过过氧氧化化氢氢，后后者者经经过过过过氧氧化化氢氢酶酶作作用用后后，分分解解释释放放出出水水和和氧氧气气。但但过过量量的的氧氧自自由由基基则对植物的某些组织如花卉的寿命有所影响。则对植物的某些组织如花卉的寿命有所影响。将将SODSOD基基因因转转入入花花卉卉植植物物中中，可可以以节节省省氧氧气气的的需求量，以增加鲜花的保存期。需求量，以增加鲜花的保存期。另另外外，抗抗盐盐、抗抗碱碱、抗抗寒寒、抗抗旱旱抗抗热热的的转转基基因因植物也在研究中。植物也在研究中。（五）抗环境压力的转基因作物（五）抗环境压力的转基因作物五、转基因植物的安全性五、转基因植物的安全性 从从2020世世纪纪7070年年代代重重组组DNADNA技技术术创创建建到到19831983年年第第一一株株转转基基因因烟烟草草获获得得以以来来，国国际际上上对对转转基基因因作作物物就就存存在着截然不同的观点。在着截然不同的观点。有人认为转基因作物造福于人类；有人认为转基因作物造福于人类；有有人人认认为为转转基基因因作作物物可可能能给给人人类类带带来来环环境境、健健康康与生态的危险；与生态的危险；基基因因工工程程技技术术在在整整个个世世界界引引起起极极大大的的关关注注与与争争议议，并并且且随随着着转转基基因因作作物物的的成成功功获获得得、商商品品化化、负负面面现现象象频频繁繁出出现现等等，甚甚至至有有完完全全拒拒绝绝转转基基因因食食品品进进入市场的举措入市场的举措.（一）转基因植物的安全性评价（一）转基因植物的安全性评价转基因植物技术相关事件转基因植物技术相关事件转基因植物技术相关事件转基因植物技术相关事件纽纽约约大大学学研研究究人人员员发发现现，在在室室内内种种植植的的转转基基因因B2B2玉玉米米植植株株中中的的杀杀虫虫毒毒素素可可以以渗渗入入到到土土壤壤中中，在在玉玉米米根根系系周周围围土土壤壤提提取取物物中中仍仍含含有有BtBt毒毒素素，可可以以杀杀死死幼幼虫虫，其其活活性性可可持持续续2525天天。研研究究人人员员认为此毒素普遍地影响土壤生态学。认为此毒素普遍地影响土壤生态学。(1999(1999年年)孟孟山山都都公公司司培培育育的的抗抗虫虫转转基基因因棉棉花花在在19961996年年进进行行大大规规模模种种植植，部部分分地地区区出出现现大大量量存存活活的的棉棉铃铃虫虫，导导致致棉棉花花不不同同程程度度地地受受害害，需要追喷杀虫剂。需要追喷杀虫剂。孟孟山山都都公公司司开开发发的的抗抗除除草草剂剂草草甘甘膦膦转转基基因因棉棉花花于于19971997年年大大规规模种植，棉花主产区模种植，棉花主产区DettaDetta收获的棉花多大量落铃或棉桃畸形。收获的棉花多大量落铃或棉桃畸形。19941994年年美美国国第第一一个个批批准准商商品品化化的的延延迟迟成成熟熟期期的的转转基基因因番番茄茄也也因种种原因停止了生产。因种种原因停止了生产。转基因植物技术相关事件转基因植物技术相关事件转基因植物技术相关事件转基因植物技术相关事件 苏苏格格兰兰P Powettowett研研究究所所用用转转凝凝集集素素基基因因的的马马铃铃薯薯喂喂饲饲大大鼠鼠，在在电电视视上上宣宣传传大大鼠鼠食食用用后后引引起起器器官官生生长长异异常常，体体重重和和器器官官重重量量减轻，破坏免疫系统，引起国际轰动。减轻，破坏免疫系统，引起国际轰动。(1998(1998年年)印印度度于于19981998年年1111月月焚焚烧烧了了美美国国孟孟山山都都公公司司的的两两块块实实验验地地，反反对对该该公公司司的的“终终止止技技术术”，即即转转基基因因作作物物雄雄性性不不育育，农农民民不不能能自己留种。这实际上涉及到的是垄断问题。自己留种。这实际上涉及到的是垄断问题。种种植植抗抗虫虫转转基基因因玉玉米米的的地地区区(1999(1999年年)，发发现现马马利利筋筋峡峡蝶蝶大大量量减少，是蛱蝶因吮食花粉过度而死。减少，是蛱蝶因吮食花粉过度而死。丹丹麦麦国国立立利利索索研研究究所所把把耐耐除除草草剂剂的的转转基基因因油油菜菜籽籽和和杂杂草草一一起起培培育育，产产生生耐耐除除草草剂剂的的杂杂草草，转转基基因因技技术术产产生生的的基基因因可可扩扩散散到到自然界中去。自然界中去。(1996(1996年年)欧欧盟盟国国家家决决定定，在在新新的的法法规规制制定定出出来来之之前前，暂暂停停转转基基因因农农作作物的种植和流通。物的种植和流通。(2000(2000年年)转基因植物释放后可能导致的生态学潜在风险转基因植物释放后可能导致的生态学潜在风险转基因植物释放后可能导致的生态学潜在风险转基因植物释放后可能导致的生态学潜在风险转基因入侵的风险；转基因入侵的风险；转转基基因因通通过过与与野野生生亲亲缘缘种种间间的的基基因因交交流流而而发发生生逃逃逸逸的的风风险险群群，使使遗遗传传性性状状改改变变，破破坏坏生生态态平平衡衡，给给农农作作物物带带来来严严重重威威胁；胁；抗病毒作物产生新病毒的风险；抗病毒作物产生新病毒的风险；转转基基因因植植物物释释放放后后对对土土壤壤生生态态系系统统及及生生物物地地球球化化学学循循环环的的影响风险；同时鱼类与其他动物也会受到不良影响；影响风险；同时鱼类与其他动物也会受到不良影响；THANK YOUSUCCESS2024/3/12 周二41可编辑