α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测.ppt

实验6 -淀粉酶的固定化及淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测淀粉水解作用的检测 酶作作为生物催化生物催化剂,具有具有专一性和高效性一性和高效性.现在被大量使用在食品、化工、医在被大量使用在食品、化工、医药等等领域。然域。然而，在而，在应用用酶的的过程中，人程中，人们也也发现了一些了一些实际问题：（1）不不稳定定：酶通常通常对强酸、酸、强碱、高温和碱、高温和有机溶有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；等条件非常敏感，容易失活；（2）不利于工不利于工业化使用化使用：溶液中的：溶液中的酶很很难回回收，提高了生收，提高了生产成本，也可能影响成本，也可能影响产品品质量。量。怎怎样解决解决这些些问题呢？呢？固定化酶技术固定化酶技术一、酶与固定化酶一、酶与固定化酶n n酶酶n n固定化酶固定化酶(固相酶固相酶)活细胞产生的具有生物催化作用的活细胞产生的具有生物催化作用的生物大分子。生物大分子。将将水溶性水溶性的酶用物理或化学的酶用物理或化学的方法的方法固定固定在某种介质上，在某种介质上，使之成为使之成为不溶于水不溶于水而又而又有酶有酶活性活性的制剂。的制剂。固定化酶的优点固定化酶的优点n n（1）使）使酶固定化后有一定的机械固定化后有一定的机械强度，度，催化反催化反应的的过程可程可管道化、管道化、连续化和自化和自动化化；n n（2）酶不溶解在催化反不溶解在催化反应的溶液中，的溶液中，产物更易物更易纯化；化；n n（3）固定化）固定化酶可可反复使用，更反复使用，更经济，更利于工，更利于工厂化生厂化生产；n n（4）固定化）固定化酶提高了提高了酶的的稳定性，可定性，可较长时间贮存和使用；存和使用；固定化酶的不足之处固定化酶的不足之处不能催化一系列反不能催化一系列反应二、酶的固定化二、酶的固定化n n机理：机理：将固定化将固定化酶装柱，当底物装柱，当底物经过该柱柱时，在在酶的作用下的作用下转变为产物。物。方法：方法：吸附法吸附法包埋法包埋法共价偶共价偶联法法交交联法法目的目的：水溶性酶不溶于水且有酶活性水溶性酶不溶于水且有酶活性物理、化学方法物理、化学方法(一一)、吸附法、吸附法 吸附法是吸附法是将酶与吸附剂接触，再经洗涤除将酶与吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单最简单的固定化技术，在的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。经济上也最具有吸引力。1、根据吸附剂的特点分为两种：、根据吸附剂的特点分为两种：物理吸附法物理吸附法离子结合法离子结合法通过氢键、疏水键等作用力通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于将酶吸附于固体吸附剂固体吸附剂的的方法方法.如有机硅胶、活性炭如有机硅胶、活性炭和石英砂等和石英砂等利用酶的两性基团和离子利用酶的两性基团和离子交换剂的相互作用（离子交换剂的相互作用（离子键）。吸附量大键）。吸附量大（二）、包埋法（二）、包埋法 将酶包埋在多孔的载体中，包埋成格子型将酶包埋在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型或包埋成微胶囊型 是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体共价结合，形成共价结合，形成共价键共价键，从而被固定化。，从而被固定化。（三）共价偶联法（三）共价偶联法是酶分子和多功能试剂之间形成是酶分子和多功能试剂之间形成共价键共价键及酶蛋及酶蛋白的白的氨基氨基相连得到三维的交联网状结构相连得到三维的交联网状结构（四）、交联法（四）、交联法氨基相连处氨基相连处 酶物理吸附法物理吸附法交联法交联法包埋法包埋法酶的固定化方法的固定化方法固定化酶的性质固定化酶的性质n n稳定性增加：稳定性增加：对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。pH活性曲线和最适活性曲线和最适pH的变化：的变化：可能向酸性或碱性方向移动可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定需实验确定底物的专一性变化：底物的专一性变化：三、三、-淀粉淀粉酶的固定化及的固定化及淀粉水解作用淀粉水解作用检测的的实验1 1、实验实验目的：目的：目的：目的：（1 1）制）制）制）制备备固定化固定化固定化固定化-淀粉淀粉淀粉淀粉酶酶；（2 2）进进行淀粉水解的行淀粉水解的行淀粉水解的行淀粉水解的测测定。定。定。定。2、实验原理：原理：用用吸附法吸附法将将-淀粉淀粉酶固定在固定在石英砂石英砂上。一定上。一定浓度度的淀粉溶液的淀粉溶液经过固定化固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示精。用淀粉指示剂溶液（溶液（KII2）测试，流出物呈，流出物呈红色色，表明水解，表明水解产物物糊精糊精生成。生成。枯草杆菌的枯草杆菌的-淀粉酶：淀粉酶：最适最适pH5.5pH5.57.57.5最适温度最适温度55557575淀粉淀粉糊精糊精麦芽糖麦芽糖葡萄糖葡萄糖-淀粉酶淀粉酶-淀粉酶淀粉酶糖化淀粉酶糖化淀粉酶遇碘遇碘显蓝色色遇碘遇碘显红色色遇碘不遇碘不显色色 3 3、设备设备及用品：及用品：及用品：及用品：5ml5ml塑料注射器、塑料注射器、塑料注射器、塑料注射器、50ml50ml烧烧杯、滴管、自行杯、滴管、自行杯、滴管、自行杯、滴管、自行车车用气用气用气用气门门芯及芯及芯及芯及夹夹子、注射器架、子、注射器架、子、注射器架、子、注射器架、试试管或微量离心管管或微量离心管管或微量离心管管或微量离心管3 3支支支支4、实验材料及其制材料及其制备（1）-淀粉淀粉酶的固定化：的固定化：（2）可溶性淀粉溶液：）可溶性淀粉溶液：（3）5mmol/L KI-I2溶液溶液5mg-淀粉淀粉酶+4ml蒸蒸馏水水+5g石英砂，石英砂，搅拌，拌，30min 装入装入层析柱析柱10倍体倍体积的蒸的蒸馏水洗水洗涤此注射器，流此注射器，流速速为1ml/min（约20滴）滴）50mg可溶性淀粉溶于可溶性淀粉溶于100ml热水中，水中，搅拌均匀。拌均匀。0.127g碘碘+0.83g碘化碘化钾+蒸蒸馏水水100ml,完全溶解后完全溶解后装入滴瓶中。装入滴瓶中。5 5、实验实验步步步步骤骤：将注射器固定在注射器架上将注射器固定在注射器架上用滴管滴加淀粉溶液，流速用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（尽量慢），（尽量慢）流出流出5ml后接收后接收0.5ml（约10滴）流出液滴）流出液加入加入12滴滴KI-I2溶液，溶液，观察察颜色色用水稀用水稀释1倍后再倍后再观察察颜色（与色（与对照照组比比较）实验后，后，10倍柱体倍柱体积蒸蒸馏水洗水洗涤此柱，放置在此柱，放置在4冰箱中冰箱中几天后重复几天后重复实验，观察察结果果n n淀粉溶液淀粉溶液+指示指示剂：n n亲和和层析洗脱液析洗脱液+指指示示剂：n n贮于冰箱几天后重复于冰箱几天后重复实验：6、实验结果：果：呈呈蓝色色呈呈红色色呈呈红色色 固定化固定化酶的用途的用途在在工工业上的上的应用：用：柚苷柚苷酶固定化固定化酶用于果汁脱苦；用于果汁脱苦；木瓜蛋白木瓜蛋白酶固定化固定化酶用于啤酒澄清；用于啤酒澄清；葡萄糖异构葡萄糖异构酶固定化固定化酶用于制造果糖，提高甜度。用于制造果糖，提高甜度。在在化学分析化学分析和和临床床诊断断上的上的应用：用：用用脲酶固定化固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。定血液或尿中的尿素含量。在在医医药上的上的应用：用：将苯丙氨酸将苯丙氨酸羟化化酶及其及其辅酶制成不溶制成不溶酶，注射到，注射到患者体内，可有效治患者体内，可有效治疗苯丙苯丙酮尿症。尿症。缺少乳糖缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹泻，可用乳糖腹泻，可用乳糖酶固相固相酶在体内或体外水解乳糖。在体内或体外水解乳糖。1 1、试验试验中中中中为为什么要待固定化什么要待固定化什么要待固定化什么要待固定化酶酶柱中流出柱中流出柱中流出柱中流出5ml5ml液体后液体后液体后液体后再接收流出液用于再接收流出液用于再接收流出液用于再接收流出液用于鉴鉴定？定？定？定？讨论讨论 答案：因答案：因为固定化固定化酶柱中的柱中的酶与流与流经柱子的淀粉柱子的淀粉反反应需要一定的需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于开始流出的液体中由于反反应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的以不利于后面的颜色色鉴定。定。2 2、如何、如何、如何、如何证证明洗明洗明洗明洗涤涤固定化淀粉固定化淀粉固定化淀粉固定化淀粉酶酶柱的流出液中没有淀柱的流出液中没有淀柱的流出液中没有淀柱的流出液中没有淀粉粉粉粉酶酶？答案：可在答案：可在试管中加入管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加可溶性淀粉溶液，再加入几滴淀粉入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住柱的流出液，混合后用手握住试管管增加温度，几分增加温度，几分钟后加入后加入1滴滴KI-I2指示指示剂，如，如仍仍显蓝色色，即流出液中没有淀粉，即流出液中没有淀粉酶了。了。用固定在石英砂的淀粉用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶柱再作用于淀粉溶液，使其自柱中流出，作用的液，使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀果才能表明是淀粉粉酶的固相的固相酶作用的作用的结果。果。3 3、耐高温的淀粉、耐高温的淀粉、耐高温的淀粉、耐高温的淀粉酶酶有哪些可能的用途？有哪些可能的用途？有哪些可能的用途？有哪些可能的用途？答案：在答案：在实际生生产中，中，总希望反希望反应的的时间越短越越短越好，好，这就要提高反就要提高反应温度。通常生温度。通常生产上淀粉上淀粉酶是是一次性使用的，加温一次性使用的，加温虽在短在短时间内会使内会使酶变性失性失活，但只要使淀粉在短活，但只要使淀粉在短时间内水解即可。内水解即可。寻找耐高温的淀粉找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀的目的是在高温下使淀粉水解快，而且粉水解快，而且酶不会因高温而在短不会因高温而在短时间内内变性。性。在在发酵生酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素中使用的往往是植物淀粉，如青霉素发酵、乙醇酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀粉粉酶用途广泛。用途广泛。1 1、pHpH：影响载体和酶的电荷变化：影响载体和酶的电荷变化：影响载体和酶的电荷变化：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。从而影响酶吸附。从而影响酶吸附。从而影响酶吸附。2 2、离子强度离子强度离子强度离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。3.3.蛋白质浓度蛋白质浓度蛋白质浓度蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。增加，吸附量也增加，直至饱和。增加，吸附量也增加，直至饱和。增加，吸附量也增加，直至饱和。4.4.温度温度温度温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。5.5.吸附速度吸附速度吸附速度吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。小分子慢得多。小分子慢得多。小分子慢得多。6.6.载体载体载体载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小积的大小积的大小积的大小。2.影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度的因素的因素: