肿瘤基因突变检测标本要求.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,P,o,w,e,r,B,a,r,中国专业,PPT,设计交流论坛,肿瘤基因突变检测标本,病理评估合格的,标本适用于,EGFR,基因突变检测,建议采用灵敏度,高的,ARMS,检测,方法,手术,标本,肺叶切除,肺段切除,活检,标本,支气管镜活检,细针穿刺活检,血液学,标本,血浆,血清,细胞学,标本,支气管刷片,胸水,痰,用于突变检测的标本,1.Dacic S.Adv Anat Pathol 2008;15(4):241-247.,2.Sequist LV,et al.Clin Cancer Res 2006;12(14S):4403s-4406s.,3.Bai H,et al.J Clin Oncol 2009;27(16):2653-2659.,肿瘤基因,突变检测,标本类型,冰冻组织,外科手术标本：最好标本，可得高质量肿瘤,DNA,支气管镜、穿刺活检测标本：量少，但肿瘤,DNA质量仍好,固定包埋组织,外科手术标本：可得足量肿瘤,DNA，但DNA,片段化,支气管镜、穿刺活检测标本：可得肿瘤,DNA量少且片段化,细胞学标本,胸水、肺泡冲洗液和痰液标本：肿瘤细胞含量不确定，通常很少,血液标本,血清、血浆标本：含肿瘤,DNA,，但含量不稳定，,DNA,片段化,循环血肿瘤细胞：可得较高质量肿瘤,DNA,，但量很少,不同类型标本处理方式,新鲜组织标本,：,1,、迅速低温放置，如有条件可放置,-80,或者液氮保存,，如果没有条件可使用,-20,保 存，但是保存时间不宜太久；,2,、放入,组织保存液,中保存，组织保存液的能渗透,0.5cm,厚度的组织，因此用组织保存液保存时，建议组织不宜过大。核酸在组织保存液中,37,稳定存放,1,天，,25,稳定存放一周，,4 1,个月或,20,长期存放,石蜡组织标本,1,、手术、穿刺、活检标本等放入,10%,中性福尔马林,中固定后制作成蜡块，可保存数年之久。,(,病理科常规处理样本方式,),细胞学标本,1,、胸水样本、心包积液、脑脊液等，建议在收到标本后两个小时内离心收集沉淀细胞进行检测，如来不及操作可离心后将沉淀冻存至,-20,保存，等使用时取出；亦可将沉淀包埋成蜡块后再切片检测；,2,、或者将样本直接放置,4,保存过夜再离心收集沉淀，可能会一定程度影响,DNA,的完整性，但一般不影响实验结果。,细胞学标本建议涂片后经病理诊断含有肿瘤后在进行检测。,血液标本,1,、血液标本收集后使用,EDTA,抗凝,，由于血浆、血清中游离核酸以及循环肿瘤细胞量极少，建议尽可能在收集标本后,2,小时内进行核酸提取，以避免核酸更深降解。,标本通常较大，能提供,足够,的肿瘤组织用于检测,标本可以是冰冻或福尔马林固定组织,手术标本,标本接收、固定,组织处理、石蜡包埋,切片及,H&E,染色,组织学观察,支气管镜活检,标本较小,通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理,建议采用灵敏度高的,ARMS,检测方法,细针穿刺活检,标本较小,通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理,建议采用灵敏度高的,ARMS,检测方法,细胞学标本,细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的,ARMS,检测方法,建议有条件的病理科制备细胞蜡块：,处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋即可,制备细胞蜡块的好处：（,1,）便于长期保存；（,2,）方便用于,EGFR,基因突变的检测及其他分子生物学标记物的检测,胸水或支气管刷片或痰液,涂片、染色,病理诊断,液基细胞学,病理诊断,细胞蜡块，切片染色,病理诊断,四、胸水标本处理流程,收集胸水,50-500mL,室温静置,30,分钟，吸去上清，剩余,5-50mL,沉淀物室温,250g,离心,10,分钟，吸去上清,低温保存,酒精固定涂片,福尔马林固定切片,福尔马林固定的标本,固定要及时，离体后即时处理,1h,固定液：,10%,中性,缓冲福尔马林（,新鲜配制,）,固定液的量：应为组织体积的,10,倍以上,固定时间：小组织,6-12h,，大标本,6-48h,冰冻标本,组织离体后立即速冻,1h,标本的质量控制,肺转移性肝细胞性肝癌,未检测到肿瘤组织,病理评估不达标样本导致,EGFR,突变检测呈阴性结果,小细胞性肺癌,肿瘤细胞太少,4,例肺肿块切除标本,EGFR,突变检测呈阴性,Rubbish In;Rubbish Out,选择正确、合适的肺癌组织，是保证突变检测成功第一步及重要的步骤,诊断,：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌,肿瘤量：,确保有足够的肿瘤组织用于突变检测,尽量保证,200-400,个肿瘤细胞,对于技术成熟的实验室，可以尝试进行,200,个肿瘤细胞的标本检测,5-10uM,10,张切片能满足突变检测需求,当细胞数较少时,可以适当增加切片数,以满足检测需求,肿瘤比例：,标识肿瘤丰富的区域,，提高肿瘤细胞比例用于检测,尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性,不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样,测序法：,10%,ARMS,法：,1%,标本的病理评估内容,