1、1第十二章第十二章 基因治疗基因治疗(Gene Therapy)2 根据临床统计,根据临床统计,25%的生理缺陷、的生理缺陷、30%的的儿童死亡都是由遗传疾病引起的。随着分子生儿童死亡都是由遗传疾病引起的。随着分子生物学和分子遗传学等学科的飞速发展,人们对物学和分子遗传学等学科的飞速发展,人们对于遗传疾病的分子机理有了深入的了解,已经于遗传疾病的分子机理有了深入的了解,已经知道人体基因的缺失、重复或突变,基因的异知道人体基因的缺失、重复或突变,基因的异常表达等都会造成遗传疾病。常表达等都会造成遗传疾病。3白化病4白化病白化病5豁豁 唇唇6并指症7基因突变基因突变 镰镰刀刀型型贫贫血血症症是是一
2、一种种异异常常血血红红蛋蛋白白病病。一一旦旦缺缺氧氧,患患者者红红细细胞胞变变成成长长镰镰刀刀型型,血血液液的的粘粘性性增增加加,引引起起红红细细胞胞的的堆堆积积,导导致致各各器器官官血血流流的的阻阻塞塞。而而出出现现脾脾脏脏肿肿大大,四四肢肢的的骨骨骼骼、关关节节疼疼痛痛,血血尿尿和和肾肾功功能能衰衰竭竭等等症症状状,病病重重时时,红红细细胞胞受受机机械械损损伤伤而而破破裂裂产产生生溶溶血血现现象象,引起溶血性贫血甚至造成死亡。引起溶血性贫血甚至造成死亡。血红蛋白四聚体血红蛋白四聚体9 由于每一个基因对人的正常功能的影由于每一个基因对人的正常功能的影响都是复杂的,所以一种基因的变化可能响都是
3、复杂的,所以一种基因的变化可能会引起多种症状。例如,如果突变造成了会引起多种症状。例如,如果突变造成了某种酶活性的改变,既可能引起某种有毒某种酶活性的改变,既可能引起某种有毒底物的堆积,也可能造成某种正常细胞生底物的堆积,也可能造成某种正常细胞生活所必需的产物的缺乏。活所必需的产物的缺乏。10多基因病多基因病 多基因病也与外界环境和心理因素有关,多基因病也与外界环境和心理因素有关,遗传因素所占的程度称之为遗传度。遗传因素所占的程度称之为遗传度。如:哮喘病遗传度为如:哮喘病遗传度为80、精神分裂症为、精神分裂症为80、高血压遗传度为、高血压遗传度为62、冠心病遗传度为、冠心病遗传度为65、糖尿病
4、遗传度(幼年型)为、糖尿病遗传度(幼年型)为75、(老年型)为(老年型)为35、唇裂唇裂腭裂腭裂遗传度为遗传度为76 11第一节基因诊断12 基因诊断基因诊断 一、概念和特点一、概念和特点 概念:利用现代分子生物学和分子遗传学概念:利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法,直接探测基因结构及其表达水的技术方法,直接探测基因结构及其表达水平,从而对疾病作出诊断的方法。平,从而对疾病作出诊断的方法。分为分为DNA诊断和诊断和RNA诊断两类。诊断两类。13n 分子诊断l遗传性疾病的诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测14探针杂交分析法探针杂交分析法l用途:用于诊断已知基因突变的疾病。用途:用于诊
5、断已知基因突变的疾病。l探针:人工合成两种寡核苷酸片段,长探针:人工合成两种寡核苷酸片段,长约约 1619个单核苷酸;其中一种是正常个单核苷酸;其中一种是正常 的,另一种含有一个突变的单核苷酸。的,另一种含有一个突变的单核苷酸。探针可用同位素、生物素、地高辛等探针可用同位素、生物素、地高辛等标标 记。记。l样本:血液或羊水细胞。样本:血液或羊水细胞。15待测样品(血细胞或羊水细胞)提取分离DNA限制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳转膜,与探针杂交放射自显影或显色16特定载体上密集的大量探针与荧光标记特定载体上密集的大量探针与荧光标记的样品杂交。的样品杂交。根据杂交信号强弱判断基因表达强度。根据杂交信
6、号强弱判断基因表达强度。17PCR为基础的诊断技术lPCR单链构象多态性(单链构象多态性(PCRSSCP)如果如果DNA分子中发生了突变,他的单链构分子中发生了突变,他的单链构象就会发生改变,与正常的象就会发生改变,与正常的DNA单链相单链相比,电泳的迁移率不同,即使只有一个比,电泳的迁移率不同,即使只有一个核苷酸的差异,也能在电泳中区分开来。核苷酸的差异,也能在电泳中区分开来。18PCR-SSCP的应用的应用检测由于基因突变所引起的疾病如遗传检测由于基因突变所引起的疾病如遗传 病、肿瘤。病、肿瘤。19PCR变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel el
7、ectrophoresis,DGGE)双链双链DNA相差一个碱基,可引起解链温度的相差一个碱基,可引起解链温度的细微变化,在梯度变性的细微变化,在梯度变性的SDS-PAGE中,迁移率中,迁移率不同,籍此检测是否发生点突变。不同,籍此检测是否发生点突变。20Mst酶切位点酶切位点 (C CC CT GAG GAGT GAG GAG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析21+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状
8、红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析22第二节 基因治疗的历史与现状1基因治疗概念基因治疗概念 随着对遗传疾病致病机理研究的深入,人们自然就想到如果能够使变异基因和异常表达的基因变成正常基因和正常表达基因,那么就可从根本上治愈遗传疾病,这就是基因治疗的基本思路。23基因治疗的概念:向靶细胞或组织中引入外源DNA片段,以纠正或补偿基因的缺陷,关闭或抑制异常表达的基因,从而达到治疗的目的。242基因治疗的历史基因治疗的历史 20世纪世纪80年代初期,美国的安德森博士首先年代初期,美国的安德森博士首先阐明了基因治疗的前景及其发展方向。阐明了基因治疗的前景及其发展方向。1984年,美国研究者年,美国研
9、究者Kohn等将载有腺苷脱等将载有腺苷脱氨酶(氨酶(ADA)基因的病毒感染非灵长类动物,)基因的病毒感染非灵长类动物,实验表明,该基因在动物体内的表达持续了数月。实验表明,该基因在动物体内的表达持续了数月。25基因治疗方式l基因补偿:以正常基因校正或者替代缺陷基因补偿:以正常基因校正或者替代缺陷和异常的基因和异常的基因lRNA技术:封闭有害基因的表达技术:封闭有害基因的表达l自杀信号途径:引发细胞调亡,治疗癌症自杀信号途径:引发细胞调亡,治疗癌症l共刺激途径:刺激免疫系统共刺激途径:刺激免疫系统26 1990年,美国批准了第一例临床基因治疗年,美国批准了第一例临床基因治疗申请。患者为四岁女孩,
10、由于缺失腺苷脱氨酶申请。患者为四岁女孩,由于缺失腺苷脱氨酶(ADA)基因而患有严重综合性免疫缺陷症,基因而患有严重综合性免疫缺陷症,研究者(研究者(William French Anderson)将将ada基因基因导入患者的淋巴细胞,然后将经过改造的淋巴导入患者的淋巴细胞,然后将经过改造的淋巴细胞回输到患者的体内,治疗取得了成功。细胞回输到患者的体内,治疗取得了成功。2728治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能,改善病人症状29腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)l病因:l淋巴
11、细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年n第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)n治疗策略:n淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%维持免疫系统功能 改善病人症状30Ashanti de Silva,Now 13,was the first patient to be treated with gene therapy.重症联合免疫缺陷的基因治疗 腺苷脱氨酶基因治疗(1990)313233 1991年美国科学家对50位黑色素瘤患者进行了基因治疗,把外源的肿瘤坏死因子(TNF)基因导入患者体内,从而达到杀死肿瘤细胞的功能,研究也取得了成功。3
12、4 三、基因治疗实例 经过经过1111年的不懈研究,密歇根大学医学年的不懈研究,密歇根大学医学院的研究人员成功培育出了新的院的研究人员成功培育出了新的听觉毛细胞听觉毛细胞,并且恢复了聋成年天竺鼠的听力。这项研究并且恢复了聋成年天竺鼠的听力。这项研究是寻找治疗人类耳聋新方法的一个重要步骤。是寻找治疗人类耳聋新方法的一个重要步骤。35 研究人员将一种叫做研究人员将一种叫做Atoh1Atoh1的基因插入到的基因插入到非感觉的上皮细胞中,这种细胞在成年的耳聋非感觉的上皮细胞中,这种细胞在成年的耳聋天竺鼠的内耳中仍然存在。已经知道天竺鼠的内耳中仍然存在。已经知道Atoh1Atoh1基基因是听觉毛细胞发育
13、的一种关键调节因子。因是听觉毛细胞发育的一种关键调节因子。8 8周后,研究人员发现用周后,研究人员发现用Atoh1Atoh1处理过的动物内处理过的动物内耳中形成了新的听觉毛细胞。听力测试表明受耳中形成了新的听觉毛细胞。听力测试表明受试动物开始恢复听觉。试动物开始恢复听觉。lAtoh1 Directs the Formation of Sensory Mosaics and Induces Cell Proliferation in the Postnatal Mammalian Cochlea In Vivo Michael C.Kelly,Qing Chang,Alex Pan,Xi Lin
14、1,and Ping Chen3637 这项研究揭示了基因治疗方法的潜力,但是同时也表现出了基因治疗的有限性,产生的毛细胞可以像正常细胞那样产生电信号,并且与神经元联系;然而当幼年小鼠使用基因治疗后两周,Atoh1基因的效应就会减弱。相关研究成果刊登在了5月9日的国际杂志Journal of Neuroscience上。38四川大学华西医学中心研究人员采用反义核酸阻断生物钟基因表达的方法,对小鼠进行戒毒实验,发现可以阻断生物钟基因参与调控的药物成瘾途径,使药物的心理成瘾被克服。39第三节 基因治疗常用基因转移的方法一.物理方法 电穿透法:借助电流使DNA直接穿过细胞膜转入细胞中。显微注射法:直
15、接将外源基因注射入细胞中,这种方法的操作难度大,失败率较高。基因枪法:微细的金或钨等颗粒,表面吸附DNA,在高压作用下,进入细胞。40二二.化学方法:化学方法:用一定的方法将外源DNA分子包裹成大的沉淀物,然后与靶细胞混合;靶细胞通过内吞作用摄入沉淀物,外源基因就被结合进核内,与染色体整合,外源基因在靶细胞中得以表达。41三.生物学方法常用的病毒载体常用的病毒载体逆转录病毒逆转录病毒(RNA)(RNA)DNADNA病毒病毒42病毒介导基因转移(病毒介导基因转移(Viral mediated Viral mediated transfertransfer)l是通过病毒为载体(是通过病毒为载体(v
16、ectorvector),将外源基因通过),将外源基因通过重组技术与病毒重组,然后去感染受体细胞重组技术与病毒重组,然后去感染受体细胞感染细胞重组病毒431逆转录病毒(逆转录病毒(retrovirus)载体)载体能稳定地将DNA插到宿主基因组的随机位点上。能高效地感染宿主细胞,感染率可达100%。逆转录病毒可以侵染不同的细胞类型。整合的病毒在宿主基因组中比较稳定。逆转录病毒包装的外源DNA序列可以达到10kb。逆转录病毒作为基因治疗载体的缺点是:整合在宿主的染色体上,有潜在的致癌性。442腺病毒载体腺病毒载体腺病毒是线状双链DNA病毒。是目前最常用的基因治疗载体之一。它的优点在于:腺病毒比较安
17、全,无致病、致癌、致畸作用。腺病毒的宿主范围较广,能感染多种细胞,因此可用于多种细胞的基因治疗。腺病毒可以在呼吸道和肠道中繁殖,因而不仅45可以通过静脉注射的方式进行基因治疗,还可以通过口服、喷雾、气管内滴注等简单易行的方法进行基因治疗。腺病毒可插入的外源基因可达7.5kb。人们对腺病毒的基因组构造非常了解,以它作为基因治疗的载体比较容易控制。46腺病毒作为基因载体也存在某些缺点:重组的病毒DNA是以游离的形式存在于细胞中,因而基因表达的时间较短,不能满足基因长期表达的需要;如需进行长期表达,必须反复注射,这无疑会加重患者的痛苦和经济负担。重组腺病毒载体的反复使用,有可能会诱发机体的免疫反应,
18、从而影响外源基因的表达,并进而影响治疗效果。473单纯疱疹病毒(单纯疱疹病毒(HSV)载体)载体单纯疱疹病毒(HSV)属于双链DNA病毒。作为基因治疗的载体有以下特点:单纯疱疹病毒可容纳高达50kb的外源基因。单纯疱疹病毒的宿主范围广泛,可以侵染脊椎 动物的各种细胞。48单纯疱疹病毒具有嗜神经性,可以用于一些神经系统疾病的基因治疗,如帕金森氏综合症、老年痴呆症等神经系统疾病的基因治疗。单纯疱疹病毒载体是目前唯一可以将外源基因导入神经系统的载体。缺点:单纯疱疹病毒的某些蛋白对宿主细胞有毒害作用。494.腺相关病毒载体是单链线状DNA载体。目前认为是不会引起人类疾病的病毒。宿主范围广,可感染分裂或
19、非分裂细胞。可整合到宿主细胞的染色体上,且位置相对固定,减少插入突变的可能性。缺点:容量小,不能超过5Kb。包装效率低。505.嵌合病毒载体 用基因重组技术把两种或两种以上的病毒载体序列组合,取长补短515、反义核酸基因治疗反义技术反义技术:是指利用人工合成的反义是指利用人工合成的反义RNA或或DNA导入靶细胞,阻断导入靶细胞,阻断Gene的转的转录或复制,控制细胞的中间阶段使编码蛋录或复制,控制细胞的中间阶段使编码蛋白的白的Gene不能转录为不能转录为mRNA 或阻断翻译或阻断翻译相应蛋白相应蛋白.52反义基因治疗 DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达 53 有研究表明,一项
20、试验性治疗黄斑病变的方法(即运用小RNA干扰技术来延缓中心区黄斑病变程度)可能引发一些病人失明,这种退行性病变主要发生于50岁以上的人群.某公司的临床研究曾经掩盖了人们对小RNA治疗弊大于利的担忧.加利福尼亚大学的研究人员指出:“会不会治疗一种病变的同时,诱发另一种病变.”54 体内本身的小体内本身的小RNA可以通过关闭或沉默可以通过关闭或沉默某些基因的表达来调节细胞功能。来自迈阿某些基因的表达来调节细胞功能。来自迈阿密的密的 OPKO Health和加州欧文的和加州欧文的 Allergan两两家公司的研发人员检测了小家公司的研发人员检测了小RNA的确可以减的确可以减轻黄斑病变区的炎症轻黄斑病
21、变区的炎症;他们通过将小他们通过将小RNA注注入病变区来抑制血管内皮生长因子入病变区来抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达的表达,进而抑制炎症加重进而抑制炎症加重.55 张康的研究小组比较了600例视网膜萎缩和非萎缩病人之间TLR3的差异.发现TLR3某些突变可以保护病人免受进一步的炎症性萎缩。携带保护型突变TLR3的病人比正常基因型的病人罹患视网膜萎缩的危险低得多,程度取决于携带突变的比例.而相比之下,携带非保护型突变的病人则更容易被小RNA诱发出萎缩。56 这些实验结果进一步提升了对实例研究的关注.科学家担心,“这种小RNA注射可能直接激活TLR3,尤其对于非突变型病例负效应会更明显,也
22、就是说我们非但不能治疗病变,反而引发了另外一些形式的异常”.57第四节 基因治疗的靶细胞 基因治疗的靶细胞可分为两大类:体细胞和生殖细胞。将遗传物质引入人的体细胞进行基因治疗的方法为体细胞基因疗法(somatic cell gene therapy);以生殖细胞为对象的基因治疗称为生殖细胞基因疗法(germ cell gene therapy)。58 进进行行生生殖殖细细胞胞基基因因治治疗疗能能使使生生殖殖细细胞胞中中的的缺缺陷陷基基因因得得到到校校正正,使使遗遗传传疾疾病病不不但但能能在在当当代代得得到到治治疗疗,而而且且还还能能将将校校正正的的基基因传给下一代,最终根治遗传疾病。因传给下一
23、代,最终根治遗传疾病。59常用的靶细胞造血干细胞成纤维细胞肝细胞肌细胞淋巴细胞601.造血干细胞 优点 对骨髓造血干细胞的了解、应用较多 骨髓造血干细胞具有分裂、分化成各种 血细胞的潜能 基因产物在骨髓细胞成熟后,可以通过 血液循环遍布全身 缺点 骨髓造血干细胞数量少,仅占0.1。61应用举例应用举例 1.人人珠蛋白基因珠蛋白基因转入小鼠骨髓干入小鼠骨髓干细胞,再胞,再 输入小鼠体内,可在骨髓、脾入小鼠体内,可在骨髓、脾脏和血液和血液检测到到 人人珠蛋白。珠蛋白。2.将腺苷脱氨酶(将腺苷脱氨酶(ADA)基因导入小鼠造血干细基因导入小鼠造血干细胞,在小鼠体内长时间表达。胞,在小鼠体内长时间表达。
24、622.成纤维细胞成纤维细胞 优点:优点:取材容易;培养技术成熟;取材容易;培养技术成熟;外源基因易进入,稳定表达;外外源基因易进入,稳定表达;外 源蛋白可随血液供各种细胞使用。源蛋白可随血液供各种细胞使用。例:将细胞因子基因(白细胞介素例:将细胞因子基因(白细胞介素12、或白细胞介素或白细胞介素2)重组成逆转录病毒)重组成逆转录病毒 载体转入成纤维细胞,载体转入成纤维细胞,用于治疗肿瘤用于治疗肿瘤 患者。患者。63第五节 基因治疗的应用一.遗传病的基因治疗 目前限于某些单基因遗传病。将外源的野生型基因导入患者体内,表达出相应的产物,达到治疗的目的。如:严重联合免疫缺陷 腺苷脱氨酶 镰状细胞贫
25、血 珠蛋白 血友病A和B 因子和64二 恶性肿瘤的基因治疗细胞因子导入疗法自杀基因疗法肿瘤抑制基因疗法65基因治疗领域目前存在的问题 1.目前已知的有治疗价值的基因太少。基因治疗是导入外源基因以达到治疗目的的新方法。比如针对恶性肿瘤的基因治疗,能抑制肿瘤生长的基因所知不多;遗传病中多基因疾病的基因尚不清楚,因此难以达到治疗目的。662.设计定向整合的载体:目前导入基因的方法不理想。基因治疗的基因导入方法要求是高效导入,而且能定向地导入体内某种细胞。现有方法效率较低,定向性差。因此,即使导入的基因有治疗效果,但由于导入数量有限,效果也有限。67 3.如何高效持续表达外源基因如何高效持续表达外源基
26、因 外外源源基基因因现现有有的的表表达达量量还还太太低低,如如血血友友病病B的的基基因因治治疗疗,凝凝血血因因子子9的的表表达达量量只只有有正正常常人人的的5,若若能能达达到到10,则则治治疗疗效果会大大提高。效果会大大提高。68 4.导入的基因缺乏可控性导入的基因缺乏可控性 如如要要导导入入一一个个胰胰岛岛素素基基因因并并在在体体内内分分泌泌胰胰岛岛素素依依目目前前的的技技术术是是可可以以做做到到的的,但但是是若若导导入入的的胰胰岛岛素素基基因因表表达达分分泌泌胰胰岛岛素素而而不不受受机机体体内内血血糖糖浓浓度度的的调调控控,将将会会造造成成严严重重后后果果。因因此此,需需解决如何对导入基因
27、的表达实现可控调节。解决如何对导入基因的表达实现可控调节。69基因治疗的风险36岁的乔妮岁的乔妮莫尔患有风湿性关节炎,莫尔患有风湿性关节炎,2007年年2月月26日第一次接受基因治疗,日第一次接受基因治疗,7月月2日,日,接受了第二次基因治疗,第二天乔妮感觉周身接受了第二次基因治疗,第二天乔妮感觉周身不适,体温上升到不适,体温上升到38.50,后上升到,后上升到400,出现严重感染症状,虽经全力抢救,但最终未出现严重感染症状,虽经全力抢救,但最终未能挽回乔妮的生命,能挽回乔妮的生命,7月月24日,乔妮因全身广日,乔妮因全身广泛性出血和肝衰竭而死亡。泛性出血和肝衰竭而死亡。707172进行基因治
28、疗使用的是西雅图的目标进行基因治疗使用的是西雅图的目标遗传公司(遗传公司(Targeted Genetics Corp)研发的研发的一种制剂,称为一种制剂,称为tgAAC94,载体为腺相关病载体为腺相关病毒,携带一种编码毒,携带一种编码TNF抑制蛋白的基因。抑制蛋白的基因。迄今尚未确定导致死亡的原因。迄今尚未确定导致死亡的原因。73乔妮不是第一位死于基因疗法的病人。乔妮不是第一位死于基因疗法的病人。1999年年9月,美国亚利桑那州高中学生盖辛月,美国亚利桑那州高中学生盖辛格因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶格因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)部分缺部分缺陷症到宾夕法尼亚大学接受基因治疗而死陷症到宾夕法尼
29、亚大学接受基因治疗而死亡。亡。FDA的调查称,患者因免疫系统对介的调查称,患者因免疫系统对介导外源性基因的病毒载体起严重反应而死导外源性基因的病毒载体起严重反应而死亡。也许盖辛格之死与乔妮之死有很大的亡。也许盖辛格之死与乔妮之死有很大的相似性。相似性。74乔妮之死涉及基因疗法的基本伦理乔妮之死涉及基因疗法的基本伦理最后安全原则。基因疗法现在还不成熟,最后安全原则。基因疗法现在还不成熟,因此不是无法治疗的疾病,如癌症、艾滋因此不是无法治疗的疾病,如癌症、艾滋病等,是不宜用基因疗法来试验的。但是,病等,是不宜用基因疗法来试验的。但是,对风湿性关节炎的基因疗法试验却违背了对风湿性关节炎的基因疗法试验
30、却违背了这个原则。也许,研究人员的步子迈得大这个原则。也许,研究人员的步子迈得大了些,心情急迫了些。这是第一次在并非了些,心情急迫了些。这是第一次在并非威胁生命的疾病中出现病人死亡。威胁生命的疾病中出现病人死亡。75但是,乔妮的死亡背后还有不可低估但是,乔妮的死亡背后还有不可低估的商业因素。风湿性关节炎是一种慢性病,的商业因素。风湿性关节炎是一种慢性病,也是常见病,有着广泛的市场。仅在美国也是常见病,有着广泛的市场。仅在美国每年就有每年就有30亿美元用于该病的治疗,于是亿美元用于该病的治疗,于是TGC瞄准这个市场开发出瞄准这个市场开发出tgAAC94,并希,并希望及早推向市场。望及早推向市场。76另一方面,尽管有大量研究证明,用腺相关病毒作基因疗法的载体是安全的,但早在2000年,NIH前主任瓦姆斯(Vamus)就透露,在美国共发生691例利用腺相关病毒进行基因治疗试验的严重事件,但向NIH报告的只有39例。