资源描述
抗原结合片段(Fab)抗体制备技术
一、 原理
基因工程抗体技术的基本原理是，首先从杂交瘤细胞、免疫脾细胞或外周血淋巴细胞中提纯
mRNA,逆转录为cDNA,再经PCR分别扩增抗体的重链和轻链可变区编编码基因，经适当方式将
二者连接形成单链抗体可变区基因片段(singlechain variable fragments,ScFv)，在一
定的表达系统中得以表达。另外，重链和轻链可变区基因还能在同一宿主的两个载体中分别
表达，然后在胞浆内组装成单链抗体可变区片段(ScFv)，或二价抗体片段。
这种单链抗体在其N末端或C末端可进一步与毒素、葡萄球菌蛋白A、碱性磷酸酶、T细胞受体
及单链抗体片段本身融合，这些蛋白质既有抗原结合能力，又有其融合蛋白的生物活性，因
此这类蛋白被称为“双功能抗体”。
二、 材料、方法和结果
(一) 淋巴细胞的分离纯化
1从小鼠脾脏分离制备淋巴细胞
(1)将小鼠脾脏从小鼠腹腔取出，用002mol/L pH值74 PBS(Hank′s液，无血清1640液均
可)洗涤外表面，去掉周围脂肪组织，置于200目不锈钢网膜中，此网膜事先放在一个高压后
的平皿中，平皿中加入10ml PBS或Hank′s液或1640液。
(2)用5ml或10ml注射器中的针柄轻轻研磨脾脏，使淋巴细胞通过网膜流入平皿中，而取出余
下的深白色的脾包膜层。
(3)加入PBS 10~15ml轻轻冲洗网膜及平皿，取出网膜，用毛细吸管轻轻吹打均匀，置于15m
l离心管中。
(4)置离心机中，1 500~2 000r/min，室温离心10min，弃上清。
(5)用PBS 8ml重悬细胞沉淀，分装入8个Eppendorf管中，1 500~2 000r/min离心，
将细胞沉淀放置冰浴或存放-70℃以备用。
注意：此步关键是将脾脏组织捣碎，使脾细胞组织块分成单个细胞，以利于RNA提取。
2从人外周血或骨髓中分离淋巴细胞
(1)抽取抗凝血或骨髓，每毫升血加入5单位肝素，一般建库需要30~40ml血或10ml骨髓。
(2)用等量Hank′s液或PBS稀释外周血，如使用骨髓可用15倍量稀释。
(3)为了分离血中的淋巴细胞，首先在各试管中(10~15ml试管)加入3ml淋巴细胞分离液(上海
生化试剂厂)或进口分离液Ficoll Plaque(Pharmacia 10A00107)，然后于每个试管中从
管壁轻轻加入5ml稀释后的血液。
(4)置低速台式离心机，2 500r/min，离心20min。
(5)此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层(黄色)，淋巴细胞层(白色)，
分离液(无色)和红细胞层(红色)，用毛细吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一10~15ml离心
管中。
(6)用PBS或生理盐水作等量稀释，1 000r/min离心10min。
(7)小心弃上清，按步骤(6)用PBS或生理盐水洗两次。
(8)用PBS或生理盐水按每10ml血悬1ml的比例重悬沉淀，分装入Eppendorf管中，离心后将沉
淀保存于-70℃或置于冰浴中以供RNA提取备用。
3杂交瘤细胞的制备
(1)杂交瘤细胞T25方瓶中长成单层后，将杂交瘤细胞轻轻吹下，置入15ml试管中。
(2)在低速离心机上1 000r/min离心10min，用PBS或生理盐水洗涤两次。
(3)用PBS 4ml或生理盐水重悬细胞沉淀于4个Eppendorf管中。离心弃上清，将沉淀物保存
于-70℃或置于冰浴中以供RNA提取备用。
(二)总细胞RNA的提取在建库过程中，由于cDNA合成这一步将使用通用引
物oligo dT，因此在总RNA提取这一步中，提取纯化mRNA不是非常必要的。提取高纯度的总
细胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目前提取RNA的方法很多，也有不少商业化的试剂盒
，这里介绍两家公司的RNA提取试剂盒及其方法。
1TRIZOL法
(1)在上述方法中制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀
至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带有1ml无菌吸头反复吹打、研磨，
至组织细胞完全裂解，液体基本澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRIZOL溶液。
(2)将上述Eppendorf管置室温(25~27℃)静置15~20min后(也可置4℃较长时间)，每管加入0
2ml氯仿(02ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。
(3)将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4℃冰箱预冷。在4℃
12 000r/min离心10min。
(4)小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA。
(5)于管中加入05ml异丙醇，室温沉淀10min或4℃沉淀30min至1h。
(6)4℃ 12 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次。
(7)最后让沉淀的RNA在室温自然干燥，切勿抽干。
(8)每管用8~10μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃
长期保存。
2标准RNA分离试剂盒(standard RNA isolation Kit)法
(1)在变性的异硫氢酸胍(guanidinium isothiocyonate)溶液中(溶液D)加入01ml二巯基乙
醇最终至14ml变性溶液。
(2)加入1ml溶液D至Eppendorf管中沉淀细胞(约107细胞)，悬起沉淀，使细胞碎片裂解。
(3)加入01ml 2mol/L pH值40醋酸钠，混匀，分成两小管。
(4)每管中加入05ml水饱和酚，充分混匀。
(5)每管加入1ml氯仿异戊醇溶液，混匀10s。置冰浴15min，如果未形成两层，另加入05
~1ml氯仿异戊醇溶液。
(6)置4℃，12 000r/min离心至少20min。
(7)将上层水相转移至一新鲜Eppendorf管中，加等量异丙醇，置-20℃沉淀1h。
(8)12 000r/min 4℃离心20min，沉淀RNA。
(9)重悬RNA沉淀于05ml溶液D中。
(10)加05ml异丙醇混合摇匀，存放-20℃备用。
(11)临用前12 000r/min 4℃离心沉淀，用75%乙醇洗一次。
(12)室温自然干燥沉淀的RNA，切勿过于干燥。
(13)重悬于50μl无RNA酶的纯水中。
(14)检测RNA纯度和浓度：260/280nm吸收浓度比值需18。如果比值过低，表明有蛋白质或
酚污染。RNA浓度(μg/ml)=260nm吸收值×稀释度×40。
一般免疫后的鼠脾脏，可获总量30~50μg RNA，人外围血则少些，RNA总量约为20~30μg/50
ml外周血。
(三) cDNA的合成如常规方法，合成cDNA的试剂盒很多，这里推荐使用GIB
CO BRL的第一链合成试剂(Super Script Preaplification System for First Synthesis C
at NO18089011)。
1将上述从淋巴细胞或杂交瘤细胞中提取RNA 5~10μg，约44μl总量置于一个无RNAase的E
ppendorf管中。
2加入4μl(05μg/μl) oligo dT12~18，分成两个管。
3每管置于70℃ 10min。然后置冰浴至少1min。
4制备以下混合液体。
10×PCR缓冲液8 μl
MgCl２ (25mmol/L)8 μl[]
dNTP混合液(10mmol/L)4 μl[]
DTT (100mmol/L)8 μl
5加14μl上述反应混合液到每个RNA引物混合管中，轻轻混合，短暂离心。
6将步骤5混合物置室温5min。
7每管加入2μl(200U)反转录酶Super script Ⅱ RT，置42℃ 60min。
8置70℃ 15min终止反应，置冰浴中。
9瞬时离心，加2μl RNAase H于每个反应管，37℃ 20min。
10置于冰浴中或存放-20℃保存。
(四) PCR扩增Fab抗体基因
1引物扩增人或鼠Fab抗体基因的引物可根据免疫球蛋白基因不同家族的可变区基因序列
设计而成。来源于美国Scripps研究所设计的引物，主要用于扩增人源抗体IgG1重链Fd部分V
H和CH1；轻链λ链及κ链的全长基因，在pCom3b系统表达Fab抗体片段。
2 PCR扩增Fd及轻链基因PCR扩增方法基本如常规方法，推荐使用美国Promega公司和Per
kin Elmergs公司的PCR扩增试剂盒。
(1) 在250μl薄壁PCR反应Eppendorf管中加入：
cDNA[]2 μl[]
5′端引物(60pm)1 μl
3′端引物(60pm)[]1 μl[]
去离子水71 μl
置94℃ 4~5min后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入：
cDNA[]2 μl[]
10×PCR缓冲液10 μl
MgCl２(25mmol/L)[]6 μl[]
dNTPs(10mmol/L)8 μl
Taq酶(5U/μl)[]05~1 μl
瞬时离心后，加入1~2滴液体石蜡。
(2) 反应条件：
PE480 PCR仪，使用以下条件：94℃，1min;52℃，1min;72℃,2min。
PE9600 PCR仪，使用以下条件：94℃,15s;52℃,50s;72℃,15s。
35个循环，72℃延伸10min，置于4℃。
(3) 每个反应管中各取5μl PCR反应物，加入适量TAE缓冲液(配方见《分子克隆》)及DNA凝
胶电泳加样缓冲液，在08%~1%琼脂糖凝胶中电泳。如果PCR反应良好，可见一条660bp左右
的条带，为Fd(VH+CH1)或轻链(VL+CL)。
(五) PCR产物的纯化这里主要推荐Costar公司生产的SpinX柱子纯化，
此方法简单，克隆效率较高，但纯度相对较差。①在 08%~1%琼脂糖凝胶中，将660bp左右
的PCR产物条带切下；②放入SpinX柱子中，置-20℃冻融一次，6 000r/min离心20min
；③于管中加入100μl TE，再次6 000r/min离心20min；④加入1/10体积的3mol/L醋酸
钠，再加入25倍无水乙醇，-70℃沉淀30min或-20℃沉淀至少1h。另一种方法为使用QIAGE
N公司的PCR纯化试剂盒(略)。
(六) Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立
1噬菌体载体pComb3 DNA的制备将pComb3载体DNA转化XLIBlu感受态菌，挑取单个菌落
接种入30~40ml SBA+培养液(30g蛋白胨、20g酵母粉、10g MOPS,加水至1 000ml,pH值
70，含有100μg/ml氨苄青霉素)，次日转种500ml SBA+培养过夜，用常规方法或商业化
DNA提取试剂盒提取质粒DNA，最后制成5μg/μl浓度左右的质粒DNA。
2载体DNA和纯化PCR产物的酶切首先将所有不同的重链PCR产物，κ链PCR产物，以及λ
链PCR产物分别按各自组群混合。建库时，可以分别建立重链+κ链库或重链+λ链库，也可
将κ链和λ链混合，建立重链+κ+λ链库，可根据各自的需要选择。在pComb3系统中，用于
重链插入的酶切位点为SpeⅠ和XhoⅠ；而用于轻链插入的酶切位点为XbaⅠ和
SacⅠ(又叫SstⅠ)。由于是双酶切，所用的缓冲液对每一种酶的消化作用有所不同
，因此在尽量使用一种缓冲液的情况，适当加大另一种酶的用量有利于双酶切的均匀消化，
表3101为Scripps研究所总结出来的酶和载体，PCR产物用量之间的关系。
表3101抗体基因克隆中的
双酶切
酶pComb3(1μg,4029bp)[]纯化PCR产物(1μg,680bp)
SpeⅠ3U17U
[BHDW]XhoⅠ10U70U
[BH]SacⅠ5U35U
[BH]XbaⅠ10U70U
[HJ]
[BG)F]
[HT]
酶缓冲液的使用：
如用保灵曼公司(Boehringer Mannheim,德国)的酶，SpeⅠ/XhoⅠ用高盐缓冲液(Bu
ffer H)，SacⅠ/XbaⅠ用A缓冲液(Buffer A)。如用GIBCO BRL的酶，SpeⅠ/
XhoⅠ用上述同样高盐缓冲液(Buffer H)，SstⅠ/XbaⅠ用同一种2号缓冲液(Buf
fer 2)。酶切反应按常规进行，一般在37℃水浴至少3~4h，也可过夜消化，载体DNA用量10
μg
左右，PCR用量每次1μg左右，酶切反应后需进行电泳以纯化所需的片段，方法如前述。
3Fd和轻链基因的克隆建库时可以先克隆轻链，也可以先克隆重链，由于重链在抗体的
功能方面起着主要的作用，故一般倾向先克隆轻链基因，然后再克隆重链基因，这样有利于
多样性抗体的特异性筛选。
(1)轻链抗体基因的克隆①取上述经XbaⅠ和SacⅠ酶切消化，并经电泳纯化后的p
Comb3载体DNA 15~2μg，轻链混合物500~700ng，加2μl高浓度连接酶，加适量连接缓冲
液，连接反应总量60μl，16℃过夜连接约12~16h；②次日加100μl纯水，加16μl 3mol/
L HAC，加25~3倍无水乙醇沉淀DNA，-70℃ 20min，离心沉淀，用75%乙醇洗一次，用20
μl纯水
重悬沉淀；③取事先制备好的电转感受态菌XLIBlu 400μl(两管)，加入上述连接产物置
冰浴中；④另取空隙为02cm电转杯一个，将上述每管混合物沿管壁轻轻加入，防止产生气
泡，置电转杯于电转化仪中(BroRed)，设置电转时的电压为25kV，电击30s~1min；
⑤电转后立即于每个电转杯中加入2ml SOC培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37℃振荡
培养1h；⑥取10μl至50μl培养液分别涂于含有氨苄青霉素的LB平皿，以检测转化效率。其
余菌液转入一个三角瓶，加入10ml SBA+,含有20μg/ml氨苄青霉素，37℃振荡培养1h；⑦
加入140ml新鲜SBA+,含有100μg/ml氨苄青霉素，37℃振荡培养过夜；⑧用常规大量制备
纯DNA方法或GIAGEN公司DNA纯化试剂盒制备上述含有轻链基因插入的pComb3质粒(pComb3L
) DNA，并测定DNA含量；⑨鉴定插入效率，随机挑取20个克隆，提取质粒DNA后，用Xba
Ⅰ和SacⅠ酶切，应有80%以上的插入率。
(2)重链抗体基因的克隆及噬菌体抗体库的建立①取上述的纯化pComb3L DNA质粒10μg,
混合的重链抗体PCR纯化产物500ng，用XhoⅠ和SpeⅠ分别进行酶切反应，37℃保温
3~4h或过
夜消化;②电泳回收相应的条带，对于pComb3L应是47kb左右的条带，而重链基因为07
kb左右的条带，纯化后测定DNA含量;③取酶切消化后回收纯化的载体DNA 2μg，重链PCR产
物600ng左右，加15个单位的高浓度连接酶，加相应的连接缓冲液，16℃连接12~16h;④重
复轻链克隆步骤中第2、3、4、5、6步;⑤加入100ml SBA+T+(含有100μg/ml氨苄青霉素
及10μg/ml四环素)，37℃振荡培养1h;⑥加入10１２pfu的辅助噬菌体VSC M13(Stra
tagene,美国)，37℃振荡培养2h;⑦加入70μg/ml卡那霉素，37℃振荡培养过夜;⑧将上述
细菌培养液于4℃以4000r/min离心15min;⑨将上清置另一无菌三角瓶，加入4% PEG8000和3
% NaCl，待PEG和NaCl溶化后，置三角瓶于冰浴中沉淀30min;10于4℃以9000r/min离心
20min;11用2ml PBS(pH值72)重悬噬菌体沉淀，瞬时离心，上清即为噬菌体抗体库，
将此抗体库分装小管，待用或存放于-20℃。
(七) 噬菌体抗体库的富集筛选用于噬菌体抗体库富集筛选的抗原至关重
要
，一般来说，纯化后的可溶性蛋白纯度高，含量大，可直接包被ELISA板，是筛选特异性抗
体的最佳选择。在某种情况下，需要获得针对某一特殊蛋白的单克隆抗体，也可以用抗这种
蛋白的单克隆抗体捕捉抗原的方法来进行筛选。
1将用于筛选特异性抗体的抗原用01mol/L pH值86碳酸钠碳酸氢钠溶液做一定量稀
释后包被96孔板，一般抗原浓度要求至少25μg/ml，每孔50~60μl，4℃过夜。
2次日洗去板中未吸附的抗原，用3% BSAPBS或用4%~5%脱脂奶粉PBS于37℃封闭1h
。
3弃封闭液，在每孔加入50~70μl噬菌体抗体库，37℃孵育2h。
4弃孔中未结合噬菌体，用TBS/Tween 20(pH值75的50mmol/L TrisHCl，150mmol/L氯
化钠，05% Tween 20)洗液洗每一孔，共洗10~20次，充分洗去非特异性吸附噬菌体。每一
次清洗时，可用带有吸头的移液器反复吹打每孔，但是切勿过度。
5用蒸馏水洗两次，将每孔中的液体吸干净。
6每孔加入pH值22的甘氨酸盐酸洗脱缓冲液50μl，室温孵育10min，期间用移液器吸
头反复吹打几次，但注意勿吹出过多气泡。
7加入3~5μl 2mol/L Tris，使溶液的pH值在7.0左右，以中和洗脱下来的噬菌体溶液
。
8立即加入2ml新鲜制备的OD600=1左右的Ecoli XLIBlu菌，室温孵育15~20
min。
9转入一200ml三角瓶中，加入10ml SBA+T+(SB培养基，20μg/ml氨苄青霉素，10μg/ml
四环素)立即取10μl、1μl和01μl涂LB氨苄平皿以滴定洗脱下来的噬菌体，其余部分转
入三角瓶，于37℃振荡培养1h。
10加入100ml SBA+T+(SB培养基，50~100μg/ml氨苄青霉素，10μg/ml四环素)，37℃ 1
h。
11加入1012pfu的辅助噬菌体VCSM13，37℃ 2h。
12加入卡那霉素70μg/ml，37℃振荡培养过夜。
13重复以上富积筛选步骤，至少如此重复三轮至四轮。
14经三轮富集筛选后，将洗脱下来的噬菌体感染新鲜制备的XLIBlu菌，37℃过夜培养后
，保存长有单个菌落的平皿于4℃待用。
(八) 噬菌体抗体库的菌落筛选法
1将每轮筛选洗脱的噬菌体用来感染新鲜的XLIBlu菌，以10μl、20μl等不同量菌液涂
于LB氨苄青霉素平皿，37℃ 4~5h。
2事先将硝酸纤维素膜在5mmol/L的IPTG溶液中浸泡10min，在超净台中晾干后，铺在上述
涂有细菌的平皿中，注意膜面与平皿中培养基界面应无气泡。
3置30℃过夜培养，一般约15~16h。
4作好标记，轻轻地将硝酸纤维素膜揭开，用氯仿熏蒸固定15min。
5将膜置于溶菌酶缓冲液中(50mmol/L Tris pH值80,150mmol/L NaCl,5mmol/L MgCl２
，BSA 3g，溶菌酶40mg，100U DNAase),每张膜用20~25ml缓冲液，置平皿于小型摇床中，室
温阻断1h。
6换上述新鲜阻断缓冲液，室温反应1h。
7对硝酸纤维素膜进行免疫酶染，方法如常规方法，根据实验需要可选择以下几种策略：
①辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)直接标记抗原蛋白检测；
②用HRP或AP标记的抗人或抗鼠Fab抗体检测；
③加入特异性抗原第一步，加酶标单克隆抗体或抗血清第二步；
④加入特异性抗原第一步，加单克隆抗体或抗血清第二步，加酶标二抗第三步。
根据实验需求而决定，策略②比较简单，但仅是针对Fab抗体的检测，挑到表达Fab抗体的
阳性克隆后需进一步鉴定是否有某种抗原特异性。
8对照硝酸纤维膜与相应平皿，挑取单个阳性克隆，置4ml SBA+培养基中，37℃振荡培
养过夜，菌液留作菌种，以备后用。
(九) 可溶性Fab抗体在原核细胞中的表达
1选择经上述富集筛选后的阳性克隆，经37℃过夜培养后，提取质粒DNA并测定DNA浓度。
2取1μg质粒DNA，经SpeⅠ和NheⅠ酶切消化，电泳纯化消化后的单一条带，分子
量在54kb左右。
3重悬DNA于蒸馏水中，加2U连接酶及相应连接缓冲液，总量20μl，室温连接2h，16℃连
接过夜。
4将上述连接物转化钙化菌或电感受态菌，XLIBlu或DH52IQ(GIBCOBRL)均可使用。
5挑取单个菌落，培养扩增或提取质粒DNA，检测基因Ⅲ是否被切除，可用XbaⅠ与X
hoⅠ酶切，应切出约1 600kb的片断，如基因Ⅲ仍然存在，则切出2 300bp左右的
条带。
6取上述阳性菌种10μl接种4ml SBA+培养液(含50μg~100μg/ml氨苄青霉素)，37℃过
夜培养后，1∶50稀释转种50ml SBA+培养液，37℃振荡培养至OD600=02。
7加入1mmol/L IPTG,置30℃振荡培养约10~12h，4 000r/min 4℃离心15min。
8弃上清，用1/10体积PBS(pH值74)重悬细菌沉淀，置干冰或-70℃反复冻融三次。10
000r/min 4℃离心20min。
9上清即含有表达的可溶性的Fab抗体。
(十) 电转感受态菌XILBlu的制备
1在LB四环素(40μg/ml)平皿上挑选一个单一的XILBlu菌落，接种入40ml SBT+培养
液(40μg/ml四环素)，37℃振荡培养过夜。
2取上述过夜菌液作1∶50稀释，接种入500ml SB培养液，其中含有10ml 20%葡萄糖和5ml
1mol/L氯化镁，37℃振荡培养至OD600=07~08，约3~4h。
3将上述细菌培养液体置于冰浴15min,4 000r/min 4℃离心20min。
4弃上清，加入半量(250ml)预冷的10%甘油，4 000r/min 4℃离心20min。
5弃上清重复第4步。
6弃上清，用总量为20ml预冷的10%甘油，重悬细胞沉淀，置于一个50ml离心管中，3 50
0r/min 4℃离心15min。
7弃上清，应该有2~25ml细菌沉淀在管底，由于弃上清时，将会含有一点10%甘油残留，
因此不必再加入10%甘油，轻轻重悬细胞沉淀即可。如无明显10%甘油残留，则加入1ml 10%
甘油重悬细胞。
8分装小管，每管200μl，置于冰浴以备使用，如不立即使用，则立即置于干冰之中，快
速冰冻，存放于-70℃~-80℃冰箱。
9为检测电转感受态菌的状态，可先用001μg PUC19质粒，1μl DNA加入40μl感受态菌
，其转化效率应达到2×109pfu/μg，此电转感受态菌可用于抗体库的建立。
(十一) 电转感受态菌TG1的制备
1从微量培养基平皿中挑取单个菌落，接种于5ml 2×YT培养基(17g蛋白胨，10g Bactoy
east,5g NaCl，加水至1 000ml)中，37℃振荡培养过夜。
2取上述过夜菌1∶100稀释接种入500ml新鲜的2×YT培养液中，37℃振荡培养至OD=05~0
7，约25~3h。
3将上述带有菌液的三角瓶置冰浴15~30min。4 000r/min 4℃离心20min。
4去上清，用500ml预冷的无菌的1mmol/L Hepes(pH值70)溶液重悬细胞沉淀。4 000
r/min 4℃离心20min。
5 4℃离心20min，用10ml含有10%甘油的1mol/L Hepes(pH70)溶液重悬细胞。
6 4 000r/min 4℃离心，最后用1ml 10%甘油重悬细胞沉淀，总量约2ml左右。
7分装小管，每管100μl，置于冰浴待用，或立即冻于干冰中，存放于-70℃。
(十二) 辅助噬菌体毒种制备
1从平皿上挑取单个XLIBlu菌落(或TG1菌落)接种入40ml SBT溶液(含有四环素10μg/m
l)(或2×YT培养液)中，37℃振荡培养过夜。
2将上述过夜培养菌1∶500稀释后加到10ml SBＴ或2×ＹＴ培养液中，37℃振荡培养1h
。
3从噬菌体培养皿中挑取单个噬菌体(VCSM13或M13KO7)空斑，接种入上述10ml菌液中，37
℃振荡培养2h。
4加入SB培养液，含有10μg/ml四环素和70μg/ml卡那霉素，或2×YT培养液，含有70μg/
ml卡那霉素，总量至500ml，37℃振荡培养过夜。3 500~4 000r/min 4℃离心15min
。
5取上清，于70℃裂解20min,再次离心(此步可省略)。
6取上清，无菌分装小管中，每管10~20ml,存放4℃至少可使用半年。
(十三) 噬菌体毒种的滴定
1准备不含任何抗生素的LB培养平皿5~6个。
2用普通LB培养基配制07%琼脂糖，即为表层琼脂糖(Top Agar)，冷至42℃并在42℃保存
。
3将上述噬菌体溶液作10-6、10-7、10-8、10-9、10-10
稀释。
4取稀释的XLIBlu,OD６００=1左右，分装小试管，100μl/小试管，标明10
-6至10-10稀释度。
5加入步骤3中依次稀释的噬菌体到每个相应的标准稀释度的试管中，37℃缓慢振荡反应20
min。
6加入Top Agar 3ml至每个试管中，立即转入事先准备好的平皿置37℃培养过夜。
7计算平皿上的空斑数，一般浓度可达10１２pfu/ml。
注意：①作空斑滴定时，对噬菌体的稀释是重要的，每个稀释度都
必须换用新的吸管或吸头。②Top Agar容易凝固，同时操作步骤6时需迅速。
(十四) Fab片段抗体表达产物的纯化和鉴定
1抗Fab片段抗体亲和层析纯化法
(1)偶联抗人或抗鼠Fab片段抗体到Protein G Sepharose,将纯化的抗人或鼠Fab片段抗体以2
mg/ml的比例与Protein G Sepharose凝胶珠溶液混合，室温旋转孵育1h。用10倍量的02mo
l/L硼酸钠(pH值90)洗两次，4 000r/min离心5min，用10倍量的02mol/L pH值90
硼酸钠溶液，
重悬凝胶珠子，加入足够量的DMP(dimethylpimelimide,Sigma公司)至终浓度为20mmol/L左
右，室温旋转混合孵育30min后，离心去上清，加入02mol/L乙醇胺终止反应。继续在乙醇
胺溶液中封闭2h，用PBS清洗数次，用PBS悬起来后制备2ml亲和凝胶柱。
(2)100ml IPTG诱导表达的Fab片段菌液，4℃ 4 000r/min离心15min。用pH值72的PBS
10ml悬起沉淀物，反复冻融三次，12 000r/min 4℃离心20min,取上清，过045μm滤
膜，收集滤过溶液。
(3)用50mmol/L pH值70 PBS结合缓冲液平衡上述亲和层析柱。
(4)加入步骤2中滤过的Fab片段抗体粗制品于柱中，反复循环30min至1h。
(5)加5~10ml 10mmol/L pH值68的PBS预洗缓冲液，洗去非特异性吸附蛋白。
(6)加入8ml 100mmol/L pH值27的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合的Fab片段蛋白，每管收集
1ml。
(7)于收集管中加入50~80μl 1mol/L pH值90的TrisHCl缓冲液中和洗脱下来的溶液，置
于4℃待测定蛋白含量。
(8)将含有蛋白高峰管合并，加入Amicon浓缩柱，根据商家手册离心浓缩。
(9)对纯化浓缩后的Fab片段蛋白10~20μg进行SDSPAGE电泳，用125%聚丙酰胺凝胶，常
规
SDSPAGE电泳条件。对于鼠Fab片段抗体，由于轻链和重链分子量类似，故在25kD左右获得
一条带。对于人Fab片段抗体，如果λ链和Fd链的组合，可能获两条链，25kD左右的为Fd链
，28kD左右的为λ链。
2Protein ASepharose柱层析纯化法Protein ASepharose可用于纯化来源于VH3免疫
球蛋白家族的重组抗体。
(1)用PBS浸泡Protein ASepharose。
(2)用50ml PBS将Protein ASepharose装成2ml柱子。
(3)将制备好的抗体溶液上样。
(4)用下列5倍体积量的溶液依次洗柱子：PBS、PBS05mol/L NaCl、02mol/L甘氨酸(pH
值60)、02mol/L甘氨酸(pH值50)。
(5)用3倍柱床体积的02mol/L甘氨酸(pH值30)洗脱液洗脱，每管收集1ml，加200ml 1mol
/L TrisHCl(pH值74)中和。
(6)将洗脱下来的抗体对PBS透析过夜。
3金属离子亲和层析柱纯化法此方法可用于带有6个组氨酸的重组抗体。
(1)抗体溶液制备，如从上清中收获抗体片断，10 000r/min离心15min,用PEG浓缩或用
超滤膜浓缩(SterivexHV 045μm,Minipore公司，美国)。如从膜间隙收获抗体片断，则
将菌液10 000r/min离心15min，用原菌量1/20体积的TE葡萄糖缓冲液(30mmol/L Tris
pH值70，20%葡萄糖，1mmol EDTA)重悬沉淀，置冰浴20min，12 000r/min离心15min
，重悬沉淀于1/20量的5mmol MgSO４中，冰浴20min,12 000r/min离心15min。
(2)将抗体溶液对上样缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值75，500mmol/L NaCl,20mmol/L
咪唑)以4mol/L浓度透析过夜。
(3)用5ml NiNTA悬液(Qiagen,德国)填充层析柱。
(4)用50ml上样缓冲液平衡柱子。
(5)将抗体溶液加入柱中。
(6)用清洗缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值75，500mmol/L NaCl,35mmol/L咪唑)洗去非
特异性吸附蛋白。
(7)用洗脱液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值75，500mmol/L NaCl,100mmol/L咪唑)洗脱，每
管收集1ml组分，共4~10ml。
(8)将抗体组分对PBS透析以去除咪唑和高浓度氯化钠。
(9)用复原缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值75，500mmol/L NaCl,250mmol/L咪唑)清洗
柱
子后，用上样缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值75，500mmol/L NaCl,20mmol/L咪唑)平
衡柱子。
4Fab抗体的特异性鉴定对于所获的Fab片段抗体，对某种特异性抗原的特异性鉴定，根
据其所针对的抗原不同，则采用的方法也不同。主要方法有：
(1)Fab片段抗体对同位素S３５标记抗原的特异性放射免疫沉淀，适用于构象依赖或
非构象依赖的抗原。在此试验中，所用Sepharose 4B珠子需偶联相应的抗人或抗鼠Fab抗体
，除了特异性的蛋白带外，结果通常还会出现一条70kD左右的非特异性条带。
(2)对特异性抗原的Westernblot鉴定，适用于一些非构象依赖的线性抗原。
另外，还有免疫斑点试验，酶联免疫吸附试验(ELISA)，包括直接ELISA、间接ELISA和竞争E
LISA等，对抗体的亲和力测定(ELISA方法)。对抗体功能的测定(如中和试验、细胞融合试验
、血凝抑制试验等)，免疫荧光试验和动物保护试验等。
相关帮助
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