LCNMR原理和发展历程PPT课件.ppt

HPLC-NMR联用技术1 1.目录一、HPLC-NMR出现的意义二、HPLC-NMR的发展进程三、HPLC-NMR装置四、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技 术问题及解决方法五、操作模式和技术六、HPLC-NMR的应用七、HPLC-NMR的前景展望2 2.一、HPLC-NMR出现的意义高效液相色谱是分析复杂有机物、药物和生物大分子等混合物的一种重要手段,但如果使用通常的检测器如紫外、荧光、电化学等检测器只能得到非常有限的分子结构信息。NMR能够提供大量的分子结构信息，但NMR分析方法要求样品为纯品，对于复杂的混合物，因为NMR信号的互相覆盖，单纯靠NMR谱则显得无能为力。如果在核磁仪器前加上一级色谱分离设备把直接样品分离后再送人NMR中扫描，就可以大大简化分析程序，提高样品分析速度，这就是色谱分离技术与NMR波谱仪结合并且日趋普及的原因。3 3.二、HPLC-NMR的发展进程在70年代末，第一次有人将HPLC-NMR联用80年代末HPLC-NMR技术才作为一种有效的分析手段而得到了承认最近几年HPLC-NMR的分析方法迅速发展并取得了巨大的成功，已经被证明为生物化学和药物化学分析中最重要的分子结构鉴定方法之一4 4.三、HPLC-NMR的装置典型的HPLCNMR联用装置是由泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组成LC系统，通过一条22.5m长的特制毛细管连接到NMR液相探头上。可以将NMR 视为HPLC 的特殊检测器，其化学位移、积分强度和谱线分裂情况能提供丰富的定量定性信息。位于NMR探头底部的阀用来控制NMR测试是在停流状态下还是在连续流动状态下进行。5 5.NMR探头是联用装置中最关键的部分。传统的NMR探头样品管在一个与测量线圈相连的玻璃插件内旋转。HPLC-NMR探头由一个不旋转的直接固定在射频线圈上的玻璃管构成，它处于传统探头玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管内径为2，3或4 mm。玻璃壁长度至少超过质子检测线圈(18 mm)，并与之平行，同时向两端逐渐变细。由于射频线圈直接固定在检测池的玻璃管上，NMR线圈的体积与试样体积比，即所谓的填充因子(filling factor)接近最佳值，这种类型的NMR测定探头原则上是最灵敏的。6 6.（一）HPLC高浓度溶剂的NMR信号抑制首先，大多数HPLC体系采用反相柱，两元或三元体系作为流动相，这些强溶剂峰使得被分析成分的NMR信号变差，且强的溶剂峰所伴随的13C 卫星峰也会干扰有用信号的观测。其次，实验过程中流动相溶剂梯度会引起某些溶剂峰化学位移的移动。四、HPLC-NMR在实际应用中面临 的主要技术问题及解决方法7 7.常用的方法有：采用氘代溶剂，价格昂贵，但近年来由于毛细管HPLC的发展，溶剂的消耗量大为减少，实验中有可能使用氘代试剂作洗脱液，不必使用溶剂抑制。通过不同频率通道进行多重溶剂峰预饱和。脉冲梯度场的相位离散而消除溶剂干扰。使用WET-序列。8 8.（二）避免损害色谱分析的分辨率与HPLC的常规用量相比，NMR检测所需的样品量是非常大的。在HPLC-NMR操作中，较大的HPLC进样量和较长的HPLC流动时间实际上造成了色谱峰的展宽。理想的进样量应该是尽可能小地来取得好的HPLC分辨率，同时又应该尽可能大地来满足NMR检测的需要。这个问题可以通过选择最佳进样量及优化其它操作条件来部分地解决。9 9.（三）NMR高灵敏度的需要 NMR的灵敏度大大低于HPLC的其它常规检测器(如：紫外检测器等)灵敏度，如何解决这个矛盾是HPLC-NMR技术发展的主要难题之一。高场探头性能的不断改进，大大提高了NMR的检测灵敏度，除此外，目前还可采取四个个途径：(1)采取适当的操作方式。（后续讲述）例如采用驻流方式可以大大提高系统的灵敏度。(2)使用高频仪器。随着NMR技术的发展，仪器的频率在不断的提 高，现在已出现了800MHz以上的仪器，灵敏度较以往的仪器有了大幅度的提高。1010.(3)利用SPC等方法浓缩样品超临界流体是指处于临界温度、临界压力状态下的物质，这时其物理性质介于气体和液体之间。超临界流体技术能够弥补气相和液相分离存在的缺点，且能兼顾两者的优点。作为流动相的CO2具有价廉、安全和易获取等优点，对低极性或中极性物质具有较好的溶解性，适合分析热敏感组分。同时，作为流动相的CO2 没有氢信号，因而不需要考虑水峰抑制问题。可以一次性完成从样品的分离纯化到蜂的检测、结构测定和定量分析，并提供混合物的组成和结构信息，从而提高了研究效率和灵活性。1111.(4)降低探头温度 利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探头，当样品温度由温控单元维持时，采用闭环或开环制冷系统使超导线圈温度降到25K，消除了谱图的电噪声，这相对于常规5 mm探头而言，其潜在灵敏度可以提高810倍。1212.总的来看，目前HPLC-NMR主要有两种可供选择的操作方式，分别是连续流方式和驻流方式。其中驻流方式又主要分为时间分割驻流方式、脱机驻流方式和uv检测自动控制NMR取样。下面对其进行一一详细讨论。五、操作模式和技术1313.（1）连续流动模式HPLC的流动是连续的，不受NMR取样的影响，当每一组分由HPLC流经NMR检测池时仪器时就会扫描出这个组分的谱图。使用这种方法可以在很短的时间内完成样品分析并得到各组分分子结构方面的信息。因此连续流操作方式在一些要求较快得出检测结果的分析中得到了应用。但是这种模式一般只适用于 1H和 19F测试。1414.（2）驻流模式：驻流模式：让溶液停留于检测池中进行测试，当所需要组分的保留时间已知，或者HPLCNMR采用灵敏的在线检测器时，可以采用这种方法。时间分割驻流方式。这是最早使用的一种驻流操作方式。具体方法是：通过紫外检测器确定了色谱峰位置之后，在适当的时间停止色谱流动，使色谱峰准确地停留在NMR检测池中，同时使用NMR进行较长时间的扫描(可达数小时)，并且根据需要可以作COSY、TOCSY等二维NMR谱图。一个谱峰扫描完毕后，可以继续色谱流动。这样就相当于将整个色谱流动过程分为若干段，一段段地进行NMR分析。就目前来看，这种操作方式的主要缺点是：由于色谱流动相阶段性停止，大大增加了分离时间，从而可能会使色谱峰展宽，分辨率下降。1515.脱机驻流方式 脱机驻流操作方法是在色谱分离的过程中，将各个色谱峰的一部分转移到不同毛细管(capillary loops)中然后再分别进人NMR检测池进行扫描分析。在整个过程中，色谱峰并没有任何停顿，所以就解决了使用“时间分割”驻流方式所带来的色谱峰展宽问题。1616.UV检测器控制NMR取样 使用这种方式进行操作必须有相应的软件支持。在这种操作方式中，可以选择手动和自动两种模式。当选用自动方式时，系统会通过UV检测器监测HPLC流出的较大色谱峰，并自动取样进人NMR中进行扫描。如果选用手动方式，仪器可按用户设置的峰位置、大小等参数有选择地对各组分进行取样、扫描。这种操作方法自动化程度高，使用简便，目前正处于发展之中。1717.六、HPLC-NMR的应用HPLC-NMR在药物研究中的应用主要是新药杂质(副反应产物与降解产物)结构测定、植物提取物中具生理活性化合物的结构测定、药物构型研究、药物代谢产物的结构与构型研究、药物在体液中的毒性与药代动力学研究以及微生物代谢物研究。1818.（一）在药物代谢研究中的应用PFoxall等用HPLCNMR研究了异环磷酰胺的毒性和代谢物。用1HNMR观察尿液中各种指标的变化，包括尿糖、甘氨酸、丙氨酸、组胺酸、乳酸、乙酸盐、三甲胺丁二酸盐的上升和马尿酸盐、柠檬酸盐的下降。结合 31PNMR谱，鉴定出3种代谢物。用Bruker DKX 500 NMR仪，NMR探头体积120 L，测1H谱时用门控预饱和技术来达到水和乙腈双溶剂抑制。1919.（二）在天然产物化学中的应用在线或收集分析鉴定混合物结构JDKoning 等以在线痕量富集HPLCNMR鉴定了蛇麻草提取物中蛇麻草苦昧酸。YZhao等用停流HPLCNMR研究了紫杉科植物提取物的成分，分离并鉴定出7种木酚素。2020.（三）在食品化学中的应用采用HPLCNMR技术鉴别食品中有关成分，作为质量控制、品质评定应用于食品中糖类(酒、果汁)、水质、保健食品等分析。IDuarte等 应用LCNMRMS技术测定了啤酒中糖类物质，糖类物质的结构由NMR单独来确定时，会产生严重的峰重叠，而采用LCNMRMS则能够快速测定糊精单体的聚合程度。A1mmen等 驯利用HPLCNMRMS技术确认苹果皮中槲皮素糖苷、根皮素糖苷的含量。2121.（四）在杂质研究中的应用Mistry等 j用HPLC-NMR确定了氟替卡松丙酸盐4个已知的二聚体杂质，杂质存在水平为006 一09。HPLC条件为Bruker LC22泵，可变波长紫外检测器(239 nm检测)，Inertsil ODS-2色谱柱、柱温40，NMR条件为Broker AMX-6OO NMR仪、NMR探头内径mm、体积20L和用脉冲序列抑制溶剂峰信号。2222.此外，HPLC-NMR联用技术在生物分析、环境监测、微生物代谢物研究等方面也有应用。2323.HPLCNMR联用技术解决了医药、聚合物和生物医学不同领域的实际问题。其关键在于巧妙而完美的联用技术,这种联用技术包括适当的接口技术，其要兼顾HPLC和NMR各组成部分的性能和参数的最佳化，从而使整个系统更为实用更为完美。通过优化连续流动探头的设计，可进一步降低NMR的检测限；通过脉冲梯度场相关的溶剂抑制技术，可获得更好的抑制效果；通过设计更合理的螺线式检测线圈的流动腔，NMR信号的分辨率可望达到0.5Hz的水平。随着各种功能的日趋完善，其应用范围将不断扩大，从而进一步发挥其潜在能力和应用价值 可以预计在不久的将来，在线HPLC-NMR联用系统将成为中等大小分子的各种有机化合物分离和分析的最有效手段之一。七、HPLC-NMR的前景展望2424.2525.