RNAi和siRNA转染.ppt

RNAi和siRNA转染内 容l第一部分 RNAi实验基本概念l第二部分 RNAi实验具体设计l第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答第一部分RNAi实验基本概念主要内容l1.RNAi的概念l2.RNAi的启动途径l3.非哺乳动物系统的RNAi实验l4.哺乳动物系统的RNAi实验l5.RNAi效应表现1.RNAi的概念lRNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。l2006年度诺贝尔生理学或医学奖共同授予安德鲁菲尔和克雷格梅洛，他们发现了“RNA干扰机制双链RNA沉默基因”。2.RNAi的启动途径l(1)dsRNA途径l(2)siRNA途径l(3)shRNA表达载体途径(1)dsRNA途径ldsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi的发生。l但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素效应）降解dsRNA。(2)siRNA途径l小干扰RNA，长21-23bp，双链。l作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的沉默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。(3)shRNA表达载体途径lshRNA（short hairpin RNA）表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，导致RNAi的发生。可能具有细胞毒性。shRNA可能通过可能通过竞争竞争Exportin-5造成致命毒性造成致命毒性3.非哺乳动物系统的RNAi实验l如线虫、果蝇等不涉及抗病毒免疫应答反应，可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常200bp）介导RNAi的发生。l长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。l长链dsRNA进入细胞后可被Dicer酶水解为多个混合的siRNA，敲除效果更好。4.哺乳动物系统的RNAi实验l通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的基因表达抑制时间。l通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载体较为合适。5.RNAi效应表现lRNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。第二部分哺乳动物系统的RNAi实验设计主要内容l1.需要短期抑制还是长效抑制?l2.采用siRNA进行实验的途径l3.构建shRNA表达载体进行实验l4.siRNA设计需要注意的问题l5.脱靶效应l6.转染是RNAi实验的瓶颈1.需要短期抑制还是长效抑制?l1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。l2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长。2.采用siRNA进行实验的途径(1)化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便，成本高，适用于长期使用特定siRNAl(2)体外转录：费时，成本低，所需有效浓度低，适用于大量筛选siRNAlSilencer siRNA Construction Kit（ThermoFisher）l(3)Dicer/RNase酶解非哺乳动物系统的RNAil三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率3.构建shRNA表达载体进行实验l需要构建相关质粒l可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表达l不能做荧光标记，无法直观知道转染效率4.siRNA设计需要注意的问题l(1)siRNA序列设计l(2)阴性对照的作用l(3)阳性对照的重要性l(4)siRNA荧光标记的问题(1)siRNA的设计l理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。l可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。l如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。(2)阴性对照siRNA的作用l阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。(3)阳性对照siRNA的重要性l阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因；l用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法是否可行等；l阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因，耽误时间。(4)siRNA荧光标记的问题l采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时，如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的siRNA。5.RNAi Off-target(脱靶效应)l(1)什么是RNAi Off-target(脱靶效应)?l(2)脱靶效应如何检测？l(3)siRNA浓度是否和脱靶效应相关？l(4)转染试剂是否也会造成脱靶效应？l(5)如何避免脱靶效应？(1)RNAi Off-target(脱靶效应)是什么？lRNAi Off-target(脱靶效应)：简单地说，就是siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。目前已广泛引起研究者重视。(2)脱靶效应如何检测？l多种方法可以用于预测和检测脱靶效应，最常见的方法是基因表达谱芯片的方法。(3)siRNA浓度是否和脱靶效应相关？l以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上低浓度同样会产生脱靶效应。(4)转染试剂是否也会造成脱靶效应？l有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的细胞基因表达影响发现，某脂质体L2K可以引发1908个基因的表达变化，既包括下调，也包括上调。如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA后该基因可能会出现表达不变甚至增强的现象，从而出现假阴性现象，如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达下调，则会出现假阳性现象。(5)如何避免脱靶效应？l脱靶效应并不能绝对避免，但可以采取措施减少脱靶效应的发生，如针对同一靶基因设计2条以上抑制效率在70以上的不同siRNA序列，分别进行实验，可避免siRNA造成的脱靶效应；采用不同转染试剂进行实验可避免转染试剂造成的脱靶效应等。6.转染是RNAi实验的瓶颈l转染是siRNA实验的瓶颈，转染质量的好坏直接关系RNAi实验的成败。l(1)选择转染方法的原则l(2)siRNA转染的方法l(3)siRNA转染试剂的主要种类l(4)脂质体l(5)非脂质体聚合物类(1)选择转染方法的原则l高转染效率：较高的转染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于实验结果的观察；l低细胞毒性：因为RNAi是抑制性实验，转染试剂的毒性多导致细胞凋亡等结果，这种结果是对细胞正常生理功能严重干扰（主要表现为抑制），细胞无法进行正常转录表达而出现凋亡。转染试剂的毒性不仅干扰细胞正常的生理状态，甚至还可能影响实验结果；l方法简单、操作简单：越简单，操作越少的实验过程，自然出错的机会就少，重复性就好，工作量也少；l成本较低：由于siRNA转染需要筛选有效的siRNA，有效siRNA后续大量研究还需要不断进行siRNA转染，siRNA转染的成本尤其是转染试剂的成本在实验开始之初就需要充分考虑。(2)siRNA转染的方法l到目前为止，转染的方法主要采用化学方法，化学方法不能转染的采用电转化等物理方法。(3)siRNA转染试剂的主要种类l脂质体类l非脂质体聚合物类(4)脂质体l开发较早，主要针对转染质粒DNA等大分子开发，现在也被改良用于siRNA的转染；l适合siRNA与质粒的共转以及一些对毒性要求不高的siRNA转染；l代表产品有invitrogen公司的lipofectamineTM 2000/3000和RNAiMAX。(5)非脂质体聚合物类l为克服脂质体转染试剂的毒性，并提高转染效率，现在已从高分子聚合物类转染试剂发展到纳米聚合物类转染试剂。l代表产品有：lMerck公司的NanoJuice Transfection Kit（Caco-2）；lQiagen公司的HiperFect；lClontech公司的XfectTM；lMicropoly公司的Micropoly-transfecterTM cell reagent；lEngreen Biosystem公司的EntransterTM-R等。第三部分siRNA转染过程相关问题及解答l1.siRNA转染过程相关问题l2.siRNA转染疑问解答1.siRNA转染过程相关问题l(1)转染细胞数量的问题l(2)转染时siRNA工作浓度l(3)转染时血清的问题l(4)转染时抗生素的问题l(5)转染过程l(6)转染后换液的问题l(7)转染条件优化的问题l(8)RNAi效应检测方法(1)转染细胞数量的问题l细胞数量：以转染时，细胞的汇合度在20-40为宜，这个汇合度比通常DNA转染的汇合度要小，这是因为转染后需要培养的时间通常比DNA转染的时间要长，同时较低的细胞数量也有利于提高抑制效率。l需要注意的是：转染时细胞的汇合度（细胞数量）会对RNAi结果产生一定的影响。一些转染试剂，如脂质体，需要的汇合度会高一些，这是为了减轻转染试剂的毒性，一般来说，细胞数量较少更能提高抑制效率。(2)转染时siRNA工作浓度lsiRNA浓度：需要根据具体的实验进行相关的优化。过低的siRNA浓度达不到相应的抑制效果，过高的siRNA浓度可能会引起一些非特异的改变。需要注意的是这里siRNA浓度指siRNA在反应时的终浓度，也就是以转染时细胞的总体积来计算的。一般siRNA的有效反应浓度在10nM-200nM，选择最低有效浓度。l需要注意的是：siRNA的分子量，对21nt双链siRNA oligo来说，平均分子量约为13300g/mol，合成siRNA其OD值和nmol换算关系由于OD值受产物中其他成分影响，如荧光标记、纯度等，具体请询问合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。(3)转染时血清的问题l一些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h再更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。现在较好的转染试剂也能在血清存在下转染。(4)转染时抗生素的问题l一些转染试剂，如脂质体，需要在转染时采用无抗生素培养基，这是由于脂质体转染会同时将培养基的一些成份包括抗生素也带进细胞，造成细胞毒性。现在较好的转染试剂也不要求去除抗生素。(5)转染过程l转染过程：转染的过程其实很简单。一般是分别稀释转染试剂和siRNA，然后二者混合，滴加到细胞表面，然后细胞继续培养。这点根据不同转染试剂的Protocol操作即可。(6)转染后换液的问题l一些转染试剂要求在转染后4-6h换液，其目的就是去除在培养基中的游离转染试剂，减轻细胞毒性。(7)转染条件优化的问题l优化转染条件不仅是为得到最高的基因抑制效率，更重要的是降低转染各条件对细胞的毒性。l优化的方面主要有：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时细胞密度、转染的过程（培养基、抗生素对细胞的影响），转染后细胞多长时间换液等。(8)RNAi效应检测方法lmRNA水平：最简单和灵敏的检测方法是用qRT-PCR，一般在转染后24h-48h检测。l蛋白水平：常见的是Western Blot、免疫荧光检测和流式细胞检测。可在48h-72h检测。l生物学效应：细胞学、酶活性、芯片分析等。2.siRNA转染疑问解答lQ：siRNA转染和质粒DNA转染有什么不一样？lA：1.siRNA转染多是蛋白表达抑制性实验，DNA转染多是蛋白过量表达实验，抑制性实验需要控制其他抑制性因素，如细胞毒性等；过量表达实验一般只需要相关表达体系完整即可；l2.siRNA长21-23bp，DNA质粒通常都在5k bp以上，转染的载体的要求是不一样的，如同装沙子和装大石头需要的装卸工具不一样是一个道理；l3.siRNA更容易降解，对转染各方面的要求更严格。