新型2,6-二氟苯甲酰脲类化合物对草地贪夜蛾的生物活性及其几丁质合成的影响.pdf

本文通过对已报道的具有优异杀虫活性的肟醚苯甲酰脲类化合物 NK-17 进行结构改造，得到化合物(E)-N-(4-(叔丁氧亚氨基)甲基)苯基)甲氨基甲酰基)-2,6-二氟苯甲酰胺(以下简称为“HN-21”)，以改善其在有机溶剂中的溶解能力。采用叶片药膜法测定 HN-21 和对照药剂虱螨脲对草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda2 龄幼虫的生物活性，并分析其对草地贪夜蛾几丁质合成过程的影响。结果表明，HN-21 对草地贪夜蛾幼虫 72h 的致死中浓度为 0.681mg/L，显著低于虱螨脲(10.052mg/L)，受试昆虫均死于蜕皮过程中。受试昆虫用虱螨脲 10.052mg/L处理 24h时，几丁质合成通路基因(sfTRE1、sfTRE2、sfGFAT、sfUAP、sfCHS1)表达量明显下降，早于用 HN-210.681mg/L 处理组，但 48h 时两组昆虫基因表达量下调程度已无显著性差异。该研究结果可为更好地开发利用苯甲酰脲类化合物提供理论依据。关键词:苯甲酰脲类化合物；草地贪夜蛾；生物活性；几丁质合成；基因表达量中图分类号：TQ450.1文献标志码：AEffects of a novel 2,6-difluorobenzoylurea compound on the bioactivity andchitin synthesis of Spodoptera frugiperdaCHENJinpeng,XIEJia*,ZHAOKe,HUZhan,ZHANGXi,NANXiaohui,SUNRanfeng*(Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Agriculture and Forestry Biological Disasters Ministry of Education,School of Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China)Abstract:Inthispaper,structuralmodificationofbenzoylureacompoundNK-17,whichhasbeenreportedtohaveexcellentinsecticidalactivity,resultedinthecompound(E)-N-(4-(tert-butoxyimino)methyl)phenyl)(methyl)carbamoyl)-2,6-difluorobenzamide(hereinafterreferredtoasHN-21)toimproveitssolubilityinorganicsolvents.TheleaffilmmethodwasusedtodeterminethebioactivityoflufenuronandHN-21againstthesecondinstarlarvaeofSpodoptera frugiperda,andtheireffectsonthechitinsynthesisprocesswerealsoanalyzed.Theresultsshowedthatthemedianlethalconcentration(LC50)ofHN-21for72hwas0.681mg/L,significantlylowerthanthatofthepositive收稿日期：2023-02-20；录用日期：2023-05-11；网络首发日期：2023-05-31.Received:February20,2023;Accepted:May11,2023;Published online:May31,2023.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0046http:/ KYQD(ZR)-21041.Funding:SupportedbytheHainanProvincialNaturalScienceFoundationofChina(No.321QN178,321CXTD436,321QN177)andtheScientificResearchStart-upFundProjectofHainanUniversityNo.KYQD(ZR)-21041.第一作者(Firstauthor)：陈金鹏，.*通信作者(Correspondingauthors)：谢佳，；孙然锋，.Theauthorsdeclarethattheyhavenocompetinginterests.农药学学报2023,25(4):798-807http:/Chinese Journal of Pesticide ScienceE-mail:controllufenuron(10.052mg/L),andalltheabnormallarvaediedduringmolting.Comparedtothecontrolgroup,theexpressionofchitinsynthesispathwaygenes(sfTRE1,sfTRE2,sfGFAT,sfUAP,sfCHS1)decreasedsignificantlyafter24hoflufenurontreatmentattheconcentrationof10.052mg/L,earlierthanHN-21treatmentattheconcentrationof0.681mg/L,buttherewasnosignificantdifferencebetweenthetwogroupsafter48htreatment.Theseresultscanprovideatheoreticalbasisforthedevelopmentandutilizationofbenzoylureacompounds.Keywords:benzoylureacompounds;Spodoptera frugiperda;biologicalactivity;chitinsynthesis;geneexpression草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda 属于鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属，原产于南美洲与北美洲的南部与中部，于 2019 年 1 月首次从云南省侵入我国，其寄主范围广泛，同时还具有强大的迁飞能力和繁殖能力，可致使农作物大幅度减产并造成难以估量的经济损失1。传统化学农药在对草地贪夜蛾的防治中仍占据重要地位，农业农村部推荐的用于草地贪夜蛾应急防治的化学农药单剂共有11 种，分别为：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、茚虫威、四氯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、乙酰甲胺磷、虱螨脲和虫螨腈(http:/ 1。作为几丁质合成抑制剂，苯甲酰脲类杀虫剂因具有独特的作用机制、较高的环境安全性及对鳞翅目高效的杀虫活性等特点得到了广泛关注和应用及对此类化合物的结构改造一直是农药学研究的热点2。目前对苯甲酰脲类化合物的改造主要围绕苯甲酰基部分(A 环)、脲桥(C)和苯基部分(B 环)3 部分进行3(图式 1)，通过改造各部分的取代基，使其电子效应、空间位阻发生改变，从而影响杀虫活性4-6。多数研究表明，在 A 环部分，2,6-二氟取代优于 2,6-二氯取代，如 2,6-二氟苯甲酰脲的杀虫活性是 2,6-二氯苯甲酰脲的 20 倍；而苯甲酰环被芳香杂环或环烷基取代，其杀虫活性会降低7-9；在 B 环部分，2,6 位上有大分子基团不利于杀虫活性，4 位上有吸电子基团则有利于杀虫活性3。Wang 等报道了肟醚类苯甲酰脲类化合物 NK-17(图式 2)对鳞翅目害虫具有优异的杀虫活性10。为了提高其脂溶性以便于其更好地开发利用，本研究设计合成了化合物(E)-N-(4-(叔丁氧亚氨基)甲基)苯基)甲氨基甲酰基)-2,6-二氟苯甲酰胺(HN-21)，并评价了其对草地贪叶蛾幼虫的生物活性。目标化合物的设计见图式 2，合成路线见图式 3。另外，苯甲酰脲类化合物通过抑制昆虫体内几丁质的合成和沉积影响昆虫的生长发育过程已十分确定，处理受试昆虫后使其体内几丁质含量降低，在蜕皮过程中死亡3,11-13。对其候选分子靶标之一几丁质合成酶 1(chitinsynthase1，CHS1)的影响的研究显示，除虫脲对厩螫蝇Stomoxyscalcitrans蛹的 CHS 活力几乎没有影响14；而用0.5mg/L 除虫脲处理四斑按蚊Anopheles quadrima-culatus24h 后 CHS1 的表达量显著升高15；用除虫脲、氟铃脲和氟苯脲处理鲑鱼虱LepeophtheirusNHNHNHNHOOFFOOClClOFFFFFFABC苯甲酰脲类化合物benzoylureas虱螨脲lufenuron图式 1 苯甲酰脲类化合物和虱螨脲的结构Scheme 1 Structures of benzoylurea compounds andlufenuronFFHNOHNON OFFHNONON O提高脂溶性Improve liposolubilityNK-17HN-21图式 2 化合物 HN-21 的设计Scheme 2 Design of compound HN-21No.4陈金鹏等:新型 2,6-二氟苯甲酰脲类化合物对草地贪夜蛾的生物活性及其几丁质合成的影响799salmonis若虫后 CHS1 表达量却在中期微弱下调16。表明不同化合物对不同生物几丁质合成的影响存在差异，而不同活性的化合物对昆虫几丁质合成通路的影响差异却鲜有系统研究。因此，本研究以新型苯甲酰脲类化合物 HN-21 为例，探究其对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性，并从海藻糖含量、几丁质含量和基因表达量等多个层面与推荐用药虱螨脲对几丁质合成过程的影响进行比较，旨在阐明杀虫机理与杀虫活性之间的关联，为苯甲酰脲类化合物更好地开发利用提供理论依据。1 材料与方法 1.1 昆虫饲养供试草地贪夜蛾源自于海南大学植物保护学院，饲养于海南大学植物保护学院生物测定中心。饲养环境条件为温度(271)，相对湿度(705)%，光照周期为 16L:8D。幼虫饲喂改良的人工饲料17，成虫以 10%蜂蜜水喂养。1.2 主要试剂与仪器化学试剂均为分析纯，购自西陇化工有限公司；生物试剂，均购自上海碧云天生物科技有限公司；虱螨脲(lufenuron，有效成分含量 5%，剂型：乳油)，购自欣丰农业科技有限公司。主要仪器：ABIQ5 型荧光定量 PCR 仪(美国赛默飞世尔科技公司)；InfiniteM200PRO 型全波长酶标仪(瑞士 TECAN 公司)；HC110-Pro 型金属浴(北京大龙兴创实验仪器股份公司)；X-4 型数字显示显微熔点仪(北京泰克仪器有限公司)；BrukerAvance400型核磁共振分析仪(瑞士 Bruker 公司)；质谱分析仪 Agilent6210ESI/TOFMS(美国安捷伦科技公司)。1.3 HN-21 的合成及溶解能力测定1.3.14-硝基苯甲醛肟(a)的合成参考文献 18的方法进行。在 250mL 三口烧瓶中加入 80mmol对硝基苯甲醛，加入 80mL 无水四氢呋喃使其溶解，再加入 96mmol 盐酸羟胺，用恒压滴液漏斗缓慢加入 88mmol 吡啶。滴加完毕，室温搅拌4h，薄层色谱(TLC，V(石油醚):V(乙酸乙酯)=5:1)监测至原料反应完全。加水停止反应，用乙酸乙酯萃取。有机相依次用 2%稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤液经旋转蒸发仪减压旋除溶剂后得黄色固体。用V(石油醚):V(乙酸乙酯)=(1020):1 混合溶剂重结晶得淡黄色针状晶体 a，收率为 90.5%。1.3.2(E)-O-叔丁基-4-硝基苯甲醛肟(b)的合成参考文献 18 的方法，在 250mL 三口瓶中加入19.2mmol 化合物 a，用 10mL 无水四氢呋喃溶解后加入 50mL 氯仿，升温至 5060，通入新制得的异丁烯气体，缓慢滴加 1.8mL 浓硫酸。滴加完毕，保持该温度反应，TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1)监测至原料反应完全。停止反应，冷却至室温，用水洗涤 2 次，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至中性，无水硫酸钠干燥。经柱层析(石油醚)分离出黄色固体 b，产率为 85.4%。1.3.3(E)-O-叔丁基-4-氨基苯甲醛肟(c)的合成参考文献 19 的方法，在 100mL 三口瓶中，加入 6.8mmol 化合物 b、30mL 乙醇和 5mL 水，O2NOHO2NNHOHO2NNHOH2NNHOHNNHOFFHNNNOOONH2OHHCl,PyTHF,rtFe/HClFFCONCOCH3ONaabcdHN-21Ethanol,60-70(CH2O)nCHCl3/THF,conc.H2SO4图式 3 化合物 HN-21 合成路线Scheme 3 Synthetic route of compound HN-21800农药学学报Vol.25加热使其溶解，在 6070 下加入 1mL 浓盐酸，并分 4 批加入 23.8mmol 还原铁粉，每隔 20min 补加 50L 浓盐酸，使溶液保持酸性，TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1)检测至原料反应完全。停止加热，趁热过滤，用乙醇洗涤固体，滤液用氢氧化钠调节 pH 至 910，有深蓝色沉淀析出；再次过滤，滤液加水后用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。经柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1)分离，得红色液体 c，产率为 78.9%。1.3.4(E)-N-甲基-O-叔丁基-4-氨基苯甲醛肟(d)的合成在 250mL 三口瓶中，加入 10.6mmol 化合物 c 和 70mL 无水甲醇，再加入 53mmol 甲醇钠，室温搅拌下加入 53mmol 多聚甲醛，加热回流 2h。冷却至室温，加入 53mmol 硼氢化钠，加热回流 2h，停止反应。冷却，旋转蒸发除去大部分甲醇，加入饱和碳酸氢钠溶液，用乙醚萃取3 次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，经柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1)分离得到化合物 d，收率为 72.8%。1.3.5目标化合物 HN-21 的合成在 50mL 三口瓶中，加入 5.4mmol 化合物 d 和 10mL 二氯甲烷，室温下用恒压滴液漏斗缓慢加入含有 5.6mmol2,6-二氟苯甲酰基异氰酸酯的二氯甲烷溶液。滴加完毕，室温搅拌 8h 至反应完全。先经柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1)分离，再用 V(石油醚):V(乙酸乙酯)=(1020):1 混合溶剂重结晶得到化合物 HN-21，收率为 73.1%。随后测定化合物 HN-21 溶解能力，并与 NK-17 的溶解能力作比较。1.4 生物活性测定采用叶片药膜法20测定化合物 HN-21 对于草地贪夜蛾 2 龄 1d 幼虫的杀虫活性。准确称量 5mgHN-21，用 1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，得到 5000mg/L 的 HN-21 母液，备用。用体积分数为 0.2的 DMF 水溶液将 HN-21母液稀释至 1.5、1.0、0.50、0.25、0.10mg/L，将合适大小的玉米叶片在药剂中浸泡 20s，取出晾干，置于培养皿中，并接入饥饿处理后的草地贪夜蛾幼虫 1 头，每处理组 20 头幼虫，每处理重复3 次。以无菌水为空白对照组，以 0.2DMF 水溶液为阴性对照组，以 10.052mg/L(经测定所得虱螨脲的致死中浓度(LC50值)的虱螨脲溶液为阳性对照组。每隔 12h 观察一次结果，用毛笔轻触试虫，试虫无反应视为死亡。所测数据用 IBMSPSSStatistics26 求得毒力回归方程，并计算LC50值。1.5 草地贪夜蛾幼虫总 RNA 的提取及 cDNA 的合成以无菌水为空白对照，以体积分数为 0.2的DMF 水溶液为阴性对照，分别以虱螨脲 0.681mg/L(化合物 HN-21LC50同等浓度)、虱螨脲 10.052mg/L作为阳性对照-1 组和阳性对照-2 组，以 HN-210.681mg/L(HN-21LC50)为待测药剂对草地贪夜蛾幼虫进行处理。分别取不同处理 0、24、48 和 72h 后的草地贪夜蛾幼虫(有表型且为存活状态)，使用 Trizol试剂盒进行 RNA 的提取，以 3 只为一组，每处理重复 3 次。提取后用 1%的琼脂糖检测 RNA 质量，使用微量核酸测定仪NanoPhotometer测定提取RNA的浓度及纯度。使用试剂 HiScriptRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)进行cDNA第一链的合成。试验进行 3 次生物学重复。1.6 几丁质合成通路相关基因表达量的测定利用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析了不同处理组试虫体内与几丁质合成相关基因的表达水平19，包括：海藻糖酶 1(TRE1)、海藻糖酶 2(TRE2)、己糖激酶(hexokinase，HK)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，G6PI)、6-磷酸果糖转氨酶(fructose-6-phosphate transaminase，GFAT)、氨基葡萄糖-磷酸 N-乙酰转移酶(glucosamine-phosphate N-acetyltransferase，GNPNA)、磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶(phosphoacetylglucosaminemutase，PAGM)、二磷酸尿核苷-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophos-phorylase，UAP)、几丁质合成酶 1(CHS1)、几丁质合成酶 2(CHS2)等21。以核糖体蛋白基因 L7(ribosomal protein L7,RPL7)为内参基因22，PCR引物见表 1。准备 qRT-PCR 反应体系(10L)：PrimerF(10mol/L)0.25L、PrimerR(10mol/L)0.25L、模板 cDNA 样品 1L、ddH2O3.5L、荧光定量试剂 HieffqPCRSYBRGreenMasterMix(LowRoxPlus)5L。设置 PCR 反应程序：95 预变性 5min，95No.4陈金鹏等:新型 2,6-二氟苯甲酰脲类化合物对草地贪夜蛾的生物活性及其几丁质合成的影响801变性 10s，60 退火 20s，72 延伸 32s，40 个循环。qRT-PCR 数据采用2CT法进行分析。计算公式：2CT=2(CT待测组CT待测 RPL7)(CT对照组CT对照RPL7)23。1.7 海藻糖含量的测定以无菌水为空白对照，以 0.2DMF 水溶液为阴性对照，分别以虱螨脲 0.681mg/L 和 10.052mg/L 作为阳性对照-1 组和阳性对照-2 组，以 HN-210.681mg/L 为处理组，对 2 龄草地贪夜蛾幼虫进行处理。将不同处理后的 5 只草地贪夜蛾幼虫放入1.5mL 离心管中，加入 200L 生理盐水，用研磨杵充分研磨后再加入 800L 生理盐水。在 4、5000r/min 下离心 15min，取上清液用于海藻糖含量的测定，沉淀留待备用。试验进行 3 次生物学重复。采用蒽酮法测定海藻糖含量24-25。1.8 几丁质含量的测定取 1.7 节中离心后的沉淀，测定几丁质含量15。用质量分数为 3%十二烷基硫酸钠溶液重新悬浮沉淀后用蒸馏水清洗；根据样品质量加入适量饱和氢氧化钾溶液，于 130 鼓风干燥箱中悬浮沉淀；于冰上冷却，加入 75%(体积分数)冰乙醇；加入Celite 混悬液后用 40%冰乙醇和蒸馏水清洗沉淀；加入 0.5mL 蒸馏水悬浮沉淀，并吸取混合液至新的 EP 管中；加入 50L 质量分数为 10%的NaNO2和 10%的 KHSO4，在 4、4500r/min 下离心 15min；吸取 60L 上清液至离心管中，加入新鲜的 3-甲基苯并噻唑酮腙盐酸盐溶液，100 金属浴 5min，室温冷却；加入 20L 质量分数为 0.83%的 FeCl3溶液，静置，检测 650nm的 OD 值。1.9 数据统计与分析所得数据采用IBMSPSSStatistics26 软件中单因素方差分析 turkeyHSD 分析差异显著性(P0.05)，数值用平均值标准误差表示，并使用GraphPadPrism7软件绘图。2 结果与分析 2.1 化合物 HN-21 的结构鉴定及溶解能力白色固体，产率 73%，m.p.131132。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)8.06(s,1H),7.71(d,J=8.5Hz,3H)7.38(tt,J=8.4,6.4Hz,1H),7.29(d,J=8.5Hz,2H),6.94(dd,J=8.5,7.7Hz,2H),3.26(s,3H),1.38(s,9H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)161.68,160.59,160.52,158.08,158.02,150.61,145.57,141.65,133.77,133.75,131.91,131.81,131.71,128.73,127.32,114.36,114.16,113.97,111.69,111.67,111.50,111.47,111.45,79.74,77.38,77.06,76.74,37.56,27.59;ESI-HRMS:m/z M+H+:C20H22F2N3O3,计算值：390.1551,测量值：390.1657(图 S1，图 S2，图 S3)。溶解能力检测结果显示，化合物 NK-17 在 0.1%DMF 水溶液中的溶解能力为76.67mg/L，而结构改造后的化合物HN-21 则为 148.33mg/L，为 NK-17 的 1.93 倍(图 S4)。2.2 药剂处理后试虫死亡率及症状生物测定结果显示，虱螨脲与 HN-21 均呈现出明显杀虫效果，中毒试虫表现为头胸蜕裂线开裂，但旧表皮无法成功蜕去，导致蜕皮过程受阻表 1 实时荧光定量 PCR 检测基因引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR detection基因Gene正向引物(5-3)Forwardprimer(5-3)反向引物(5-3)Reverseprimer(5-3)基因序列号GenBanknumberSfTRE1TCAGATGAAGGTGAACTCGAAGAGGAATGATGAATCCGTGGGTAXM_035576793.2SfTRE2CTGCTGCTGTCGGAGATGATAGGAGGGGAGGCTGTGATXM_050699447.1SfCHS1ACGTTGGTCTCAGGTGATGTGCAGCCAATGACCAATAGCGXM_050696837.1SfCHS2GAGTTCACAGTGCGGTTGCGCCAAAATAGCCCACATCCXM_050696837.1SfHKTTATGACTGGTACAGGTGTCGCCATCCCCTCGTCTAGCAATCGXM_050707397.1SfG6PICAGTGGGCAGTGGAAAGGGTCAGTTGGTTGGCGTAGGGTXM_050693743.1SfGFATGTGCCCTCTGTTCCCCGTGCTGCTGCCCGAGAGAXM_035573563.1SfGNPNAATCCTCCAGAGATACTCAAGCGTATATACGGGTGTCCTCGATCACTXM_035593197.2SfPAGMTCTTGTTAGAACATGTGGTCTACCGCCTCCAGCATTTCACCGTCAXM_050698038.1SfUAPCAGTGTTCGCTTTCTAATCGCCTTCTTGAATAACTTTGCTCGTATCGXM_035601390.2SfRPL7TTCGTCATCCGTATCCGTGGATGTAGGGCTCGGCAATACGXM_035596168.2802农药学学报Vol.25而死亡(图 1，表 2)。其中，虱螨脲对草地贪夜蛾2 龄幼虫 72h 的 LC50值为 10.052mg/L，而 HN-21 的LC50值为0.681mg/L，约为虱螨脲LC50值的1/15，表明化合物 HN-21 对草地贪夜蛾具有更高的致死毒性(图 2)。2.3 药剂处理后海藻糖含量变化在 2 龄草地贪夜蛾 13d 的发育期内，CK 组体内的海藻糖含量呈现先下降后上升的趋势。虱螨脲 0.681mg/L 组、10.052mg/L 组和 HN-210.681mg/L 组试虫体内海藻糖含量与对照组相比均无显著差异(图 3)。2.4 药剂处理后几丁质含量的变化经处理 2472h 期间，CK 组的试虫体内几丁质含量逐渐上升，虱螨脲 0.681mg/L 组试虫几丁质含量与CK组相比无显著差异，而虱螨脲10.052mg/L组和 HN-210.681mg/L 组试虫体内几丁质含量分别下降至 CK 的 49.6%和 76.3%；处理 4872h 后，虱螨脲 10.052mg/L 组和 HN-210.681mg/L组之间已无显著差异，几丁质含量在 48h时分别下降至 CK 的 12.3%和 18.6%，而 72h时下降至10.5%和 8.7%(图 4)。2.5 药剂处理对几丁质合成通路相关基因表达量的影响与CK组与0.2DMF组相比，虱螨脲0.681mg/L组试虫体内几丁质合成相关基因的表达量在所测时间点均无显著差异；处理 24h 后，虱螨脲10.052mg/L 组试虫 sfTRE1、sfHK、sfG6PI、sfGFAT、sfGNPNA、sfCHS1 和 sfCHS2 的表达量显著下降。而 HN-210.681mg/L 组则在 48h 时出现了多表 2 供试药剂对草地贪夜蛾的杀虫活性(72 h)Table 2 Toxicities of lufenuron and HN-21 against S.frugiperda(72 h)供试药剂Compound回归方程Regressionequation(y=)致死中浓度LC50/(mg/L)95%置信限95%Confidencelimit/(mg/L)相关系数Correlationcoefficient,r虱螨脲lufenuron0.0304x+0.194410.0528.288812.33110.9485HN-210.6117x+0.08350.6810.44840.81490.9788ABCDE0.5 cmFGHA:CK；B:阴性对照:0.2DMF 水溶液；C:阳性对照(虱螨脲 10.052mg/L)；D:HN-210.10mg/L；E:HN-210.25mg/L；F:HN-210.50mg/L；G:HN-211.0mg/L；H:HN-211.5mg/L。百分号代表各时间点异常表型个体占比。A:CK;B:Negativecontrol:0.2DMFinwater;C:Positivecontrol(lufenuron10.052mg/L);D:HN-210.10mg/L;E:HN-210.25mg/L;F:HN-210.50mg/L;G:HN-211.0mg/L;H:HN-211.5mg/L.Thepercentrepresentstheproportionoftheabnormalindividualsateachtimepoint.图 1 各处理组草地贪夜蛾幼虫表型(Bar=0.5 cm)Fig.1 Phenotypes of S.frugiperda larvae in eachtreatment group0020406080100122436时间 Time/h死亡率 Mortality/%48CK0.2 DMF6072虱螨脲 10.052 mg/Llufenuron 10.052 mg/LHN-21 0.25 mg/LHN-21 0.5 mg/LHN-21 1.5 mg/LHN-21 0.10 mg/LHN-21 1.0 mg/L图 2 各处理组草地贪夜蛾幼虫死亡率Fig.2 Mortality of S.frugiperda larvae in eachtreatment group000.10.2aaaa0.30.40.5244872时间 Time/h海藻糖含量CK0.2 DMF虱螨脲 0.681 mg/Llufenuron 0.681 mg/L虱螨脲 10.052 mg/Llufenuron 10.052 mg/LTrehalose content/(mmol/L)HN-21 0.681 mg/L注：小写字母代表同一时间点不同组别之间的单因素方差分析结果(TurkeyHSD 分析，P0.05)。Note：Differentlowercaselettersrepresentone-wayANOVAresultsamongdifferentgroupsatthesametimepoint(TurkeyHSDanalysis,P0.05).图 3 各处理组草地贪夜蛾幼虫体内海藻糖含量Fig.3 Trehalose content in S.frugiperda larvae in eachtreatment groupNo.4陈金鹏等:新型 2,6-二氟苯甲酰脲类化合物对草地贪夜蛾的生物活性及其几丁质合成的影响803个基因的表达量下调，大多数基因下调倍数与虱螨脲 10.052mg/L 组无显著性差异；另外，在2472h 内，与 CK 组及 0.2DMF 组相比，虱螨脲 10.052mg/L 组试虫体内 sfPAGM 的表达量无显著差异，sfUAP 的表达量显著下降；而 HN-210.681mg/L 组试虫体内 sfPAGM 表达量显著上升，sfUAP 表达量无显著差异(图 5)。3 讨论 3.1 HN-21 对草地贪夜蛾 2 龄幼虫的杀虫活性随着人们对环境安全性的重视，低毒高效的苯甲酰脲类杀虫剂脱颖而出，在近 40 年来得到了较好的应用。目前为止，已得到专利报道的此类化合物有上千种，且有 20 多个商品化学品种广泛应用于田间防治，如除虫脲、啶虫隆、氟铃脲及虱螨脲等26-28，可用于防治鳞翅目、双翅目、鞘翅目类等多种农林业害虫3,29-30。研究表明，作为苯甲酰脲类第一大产品，虱螨脲在对甜菜夜蛾 Spodopteraexigua、小菜蛾 Plutella xylostella、草地贪夜蛾、苹浅褐卷蛾 Epiphyas postvittana和梨小食心虫Grapholita molesta等鳞翅目害虫的杀虫活性尤为优越，在玉米、棉花、蔬菜、果树等作物上得到了较好的应用2,31-34。采用叶片药膜法测定虱螨脲对草地贪夜蛾幼虫的室内毒力，不同处理组的结果有一定的差异，如苏豪、吕胜兰等报道，其对草地贪夜蛾 2 或 3 龄幼虫 24h 的 LC50值分别为4.66mg/L 和 0.062mg/L21,35，本研究结果显示，虱螨脲对草地贪夜蛾 2 龄幼虫的 72hLC50值为10.052mg/L，介于前两者与 Chen等测得的 20.706mg/L 之间36，这可能与各地的草地贪夜蛾种群敏感性差异有关。在本研究中，通过以 2,6-二氟取代模式以及经过生物电子等排和亚结构连接法3设计的含有肟醚结构的苯甲酰脲类化合物 HN-21，不仅溶解能力相比较 NK-17 有了显著的提升，其对草地贪夜蛾的 LC50值也仅为 0.681mg/L，杀虫活性显著优于商品推荐用药虱螨脲。化合物 HN-21含有的肟醚结构为亲脂基团，在其与作用靶标结合时可能具有双作用位点，从而使毒力增加3。受试昆虫表现出明显的昆虫生长调节剂中毒症状，无法正常完成蜕皮过程，最终死亡。3.2 药剂处理对海藻糖及几丁质含量的影响几丁质合成通路始于海藻糖酶(TRE)，终于几丁质合成酶(CHS)。海藻糖代谢与几丁质代谢息息相关，直接影响着昆虫的生长发育过程。多种化学药剂会引起海藻糖含量与几丁质含量失调，进而产生高比例的昆虫个体死亡。如黄地老虎 Agrotis segetum 在经氯虫苯甲酰胺处理后，海藻糖含量减少37，受井冈霉素处理后，斜纹夜蛾Spodoptera litura 体内海藻糖含量显著上升，几丁质含量下降19，均使昆虫无法完成正常的生长发育过程。作为几丁质合成抑制剂，苯甲酰脲类化合物处理后，受试昆虫体内的几丁质含量通常会减少，进而抑制昆虫正常的表皮形成和生长发育，导致试虫蜕皮困难而死亡：氟苯脲的摄入可显著降低马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata整体(无中肠)和表皮中的几丁质含量，且呈现浓度依赖效应38；绿盲蝽 Apolygus lucorum经氟铃脲处理1272h 后，几丁质含量下降，海藻糖含量增加39，此现象在氟铃脲处理斜纹夜蛾幼虫 96h 也有发现40。在本研究中，在经 HN-21 和高剂量虱螨脲处理后，幼虫体内几丁质含量从 24h 开始出现下降，且随着时间的延长，HN-21 对几丁质含量降低的影响更加显著，到 72h 时其对受试昆虫几丁质含量的影响程度甚至大于高剂量的虱螨脲。这可能与不同药剂在叶片的渗透或虫体的传递速率有关。药剂对几丁质含量的影响程度和受试昆虫的表型表现出一致：HN-21 和高剂量的虱螨脲均会导致受试昆虫在蜕皮时死亡，但表型出现时间有一定差异。高剂量虱螨脲处理的受试昆虫在24h时生长发育便受到抑制，HN-21 则在 48h时使多数受试昆虫生长明显受到阻滞，到 72h时两002aabccbaaba468244872时间 Time/h几丁质含量Chitin content/(mg/L)CK0.2 DMF虱螨脲 0.681 mg/Llufenuron 0.681 mg/L虱螨脲 10.052 mg/Llufenuron 10.052 mg/LHN-21 0.681 mg/L注：小写字母代表同一时间点不同组别之间的单因素方差分析结果(TurkeyHSD 分析，P0.05)。Note:Differentlowercaselettersrepresentone-wayANOVAresultsamongdifferentgroupsatthesametimepoint(TurkeyHSDanalysis,P0.05).图 4 各处理组草地贪夜蛾幼虫体内几丁质含量Fig.4 Chitin content of S.frugiperda larvae in eachtreatment group804农药学学报Vol.25者已无明显差异。另外，在本研究中，HN-21 和高剂量虱螨脲处理后，受试昆虫体内的海藻糖含量未出现变化，可能与不同昆虫不同的响应机制有关，具体原因还有待进一步实验验证和分析。3.3 药剂处理对几丁质合成通路相关基因表达量的影响昆虫体内几丁质合成由 8 个基因参与调控，始于海藻糖酶 TRE，经过糖酵解途径的 2 种酶、己糖胺通路的 4 种酶，最后终止于几丁质合成酶CHS。其中某一过程代谢异常即会影响昆虫正常的生长发育。研究表明，TRE 基因表达量下降会使豌豆蚜Acyrthosiphon pisum 畸形41；在棉蚜Aphis gossypiiGlover、赤拟谷盗Triboliumcastaneum等多种昆虫中，RNA 干扰介导的CHS1 基因使受试昆虫发育停滞而死亡42-44。同样，HK、G6PI、GFAT、GNPNA、PAGM 和 UAP001a aaa aa aaaa a aa aabbbcbTRE1基因表达量Amount of gene expression23244872001