柚果醇提物的体外抗氧化及改善肝细胞脂质堆积的研究.pdf

第 41 卷第 3 期钟瑜萍，梁梓茵，范丽萍，等柚果醇提物的体外抗氧化及改善肝细胞脂质堆积的研究53柚果醇提物的体外抗氧化及改善肝细胞脂质堆积的研究钟瑜萍1,2，梁梓茵1，范丽萍1,2，朱贤娜1，林雪仪1，刘志伟1,2（1.嘉应学院 生命科学学院，广东 梅州 514015；2.嘉应学院 广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514015）摘要：为探究柚果醇提物抗氧化及对油酸钠诱导的 HepG2 细胞内脂质堆积作用，对柚果醇提物主要成分含量进行测定，采用 1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）清除试验评价提取物的抗氧化潜力.通过 CCK-8 法检测不同浓度油酸钠和柚果醇提物对 HepG2 细胞活力的影响并选择适宜浓度进行后续试验.通过油红 O 染色法判断油酸钠诱导构建的脂质堆积模型是否成功，并采用试剂盒测定柚果醇提物对甘油三酯含量的影响.柚果醇提物的黄酮、总酚含量分别为 380.13、30.16 mg/g.其中柚皮苷、橙皮苷和野漆树苷的含量为 128.57、2.21 和 4.58mg/g.柚果醇提物 DPPH 自由基清除能力具有浓度依赖性.一定剂量（0.1250.5 mg/mL）柚果醇提物对 HepG2细胞存活无影响，可以降低油酸钠所致的肝细胞胞内甘油三酯含量.柚果醇提物具有抗氧化价值，可以改善油酸钠诱导的 HepG2 细胞脂质堆积.关键词：柚果醇提物；黄酮类物质；抗氧化活性；HepG2 细胞；脂质堆积中图分类号：TS275.4文献标识码：A文章编号：1006-642X(2023)03-0053-06非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver diseases，NAFLD）是一种非过量酒精摄入影响下形成的以肝内脂质沉积过度为主要病理特点的代谢综合征，可发展为肝硬化和肝性脑病1.有研究表明，NAFLD患病率随药物、饮食、环境、肠道菌群等方面的相互作用呈逐年升高趋势，研究预测中国 NAFLD 发病率将在 20162030 年间相对增长 22.2%2-4.目前对于 NAFLD 的发病机制尚未完全清楚，也暂无特效药物用于治疗.减少肝脏脂质蓄积和肝脏星状细胞激活、改善胰岛素敏感性等是目前常采用的治疗目的5.盐酸二甲双胍作为降血糖的代表药物不适于严重肝功能不全患者，因为存在乳酸中毒风险且常伴随不适的胃肠道反应2.因此探索具有上述治疗目的且具有抗氧化和调节肠道菌群等效果的治疗方式显得尤为重要.柚果，为芸香科植物柚（Citrus grandis(L.)Osbeck）及其变种的干燥未成熟果实.富含黄酮类、酚类、植物多糖、膳食纤维、柠檬苦素类似物和微量矿物元素等多种天然活性物质6-7，具有燥湿化痰，宽中行气，消食，预防动脉硬化、降血脂、抗氧化等生理和药用功能.黄酮类成分具有抗氧化功效，可以清除一定量 DPPH 和 OH 自由基.此外还具有抑制多种细菌、真菌等致病微生物生长及抗肿瘤作用8-9.柚皮苷作为含量最多的黄酮类成分，广泛应用于食品10和医药11行业，与其抗过敏、抗氧化、抗癌和抗炎等生理功能密不可分12.研究发现柚皮苷显著降低小鼠脂肪体重、肝重量、肝总胆固醇浓度、肝甘油三酯浓度、血浆低密度脂蛋白胆固醇水平.橙皮苷在抗炎、抗氧化、调节血脂代谢、心血管保护等方面具有积极作用.柚果中含有一定量的野漆树苷，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤和抑菌等作用13.除此之外，黄酮类成分还能与一些药物进行复配从而起到协同的效果，使其生物活性得到显著提高14.酚类成分具有抗氧化、抗炎收稿日期：2022-09-16基金项目：梅州市科技专项（2020B0205004）；嘉应学院科研项目（2021KJM03）；嘉应学院 2021 年“大学生创新创业训练计划”项目（S202110582046，S202110582031）作者简介：钟瑜萍（1991-），女，广东梅县人，讲师，博士，主要研究方向：中药药效物质基础.通讯作者：刘志伟（1969-），男，广东大埔人，教授，博士，主要研究方向：食品生物技术.第 41 卷第 3 期2023 年 6 月Vol.41NO.3Jun.2023嘉应学院学报（自然科学）JOURNAL OF JIAYING UNIVERSITY(Natural Science)嘉应学院学报（自然科学）54及抗癌等医疗保健功效15-16.本研究对柚果醇提物主要成分含量进行测定，采用 1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）清除试验评价提取物的抗氧化潜力.并应用油酸钠模拟高游离脂肪酸环境，诱导 HepG2 细胞形成胞内脂质堆积的肝细胞模型，研究柚果醇提物对油酸钠诱导的肝细胞脂质堆积模型的改善作用，以期为柚果作为治疗 NAFLD的药物提供理论依据.1 材料与方法1.1 材料与试剂红肉蜜柚柚果由广东李金柚有限公司提供，嘉应学院生物工程系鉴定为芸香科植物柚（Citrus grandis(L.)Osbeck）及其变种的干燥未成熟果实；柚皮苷对照品：纯度为 98.0%，中国食品药品检定研究院；芦丁对照品：纯度为 99.4%，中国食品药品检定研究院；野漆树苷对照品：纯度为 98.0%，北京索莱宝科技有限公司；橙皮苷对照品：纯度为 99.34%，四川省维克奇生物科技有限公司；没食子酸对照品：纯度为 98.0%，四川省维克奇生物科技有限公司；甲醇：色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）：上海麦克林生化科技股份有限公司.1.2 主要仪器与设备LC-2030C 岛津高效液相色谱仪：株式会社岛津制作所；T6 新世纪紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-250DB 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司.1.3 实验方法1.3.1 样品处理将柚果进行切片，95 烘干，粉碎机粉碎，过 100 目筛.柚果粉末以 120（g/mL）的料液比加入85%乙醇，超声处理（120 W，40 kHz，30 min）.然后 8 000 r/min 离心 20 min 收集上清液，残渣继续用85%乙醇提取 3 次，合并上清液，旋转蒸发浓缩至一定体积后，冻干得到柚果醇提物.1.3.2 醇提物活性成分分析以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定柚果醇提物的黄酮含量17；以没食子酸为标准品，采用福林-酚法测定柚果醇提物的总酚含量17.分别以柚皮苷、橙皮苷和野漆树苷为标准品，参考文献18方法进行改进利用高效液相色谱法测定柚果醇提物中柚皮苷、橙皮苷和野漆树苷的含量.1.3.3 色谱条件Poroshell 120 EC-C18 色谱柱（4.6 mm250 mm，4 m）；流动相乙腈（A）：水（B）=2080；检测波长分别为 283 nm（柚皮苷、橙皮苷）和 337 nm（野漆树苷）；柱温 30；体积流量 1.0 mL/min；进样量 1 L.1.3.4 DPPH 自由基清除活性称取 DPPH 0.008 0 g，无水乙醇溶解，定容至 100 mL 得 DPPH 溶液浓度为 80 g/mL.因 DPPH 溶液的特征吸收波长为 517 nm，用紫外可见分光光度法测定加柚果醇提物的 DPPH 溶液吸光值和未加柚果醇提物的 DPPH 溶液吸光值，通过公式计算柚果醇提物对 DPPH 自由基的清除能力.实验分为 3 组：2 mL样品溶液+2 mL DPPH 溶液（抗氧化组，B2）；2 mL 无水乙醇+2 mL DPPH 溶液（空白组，B1）；2 mL样品溶液+2 mL 无水乙醇（对照组，B3）.避光反应 25 min 后于 517 nm 处测量 OD 值.清除率（%）=1-（B2-B3）/B1100%.第 41 卷第 3 期钟瑜萍，梁梓茵，范丽萍，等柚果醇提物的体外抗氧化及改善肝细胞脂质堆积的研究551.3.5 细胞培养与传代HepG2 细胞培养于含 10%FBS 和青链霉素的 DMEM 培养基中，接种密度为 4104个/mL，于 37、5%CO2饱和湿度培养，每两天换液 1 次，当细胞覆盖瓶底 80%左右时，用 1PBS 洗涤，0.25%胰蛋白酶消化、洗脱、离心后按如上密度传代培养.取铺满瓶底 80%的细胞进行试验.1.3.6 柚果提取物和油酸钠对 HepG2 细胞毒性试验称取 50 mg 油酸钠在 1.8 mL 0.1 mM 的 NaOH 溶液中加热溶解，向其加入 5%BSA 溶液使其最终体积为 11 mL.用 0.22 m的微孔滤膜过滤，此时油酸钠溶液的总浓度为 15 mM.再用 DMEM 稀释至 50、100、150、200、250 M的油酸钠造模液.取对数生长期的 HepG2 细胞，按 4104个/孔接种于 96 孔板，24 h 后分组给药.不同浓度柚果醇提物组：分别给予含 0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL 的 DMEM 培养基；不同浓度油酸钠组：分别给予含 50、100、150、200 M的 DMEM 培养基；同时以仅含 DMEM 培养基为对照组.37C、5%CO2培养箱中分别继续培养 24、48 h 后弃去储备液，PBS 洗 1 次，每孔加入 110 L CCK-8 溶剂（CCK-8：DMEM=1:10），于 5%CO2培养箱中，37 饱和湿度孵育 2 h，酶标仪 37 下测定 450 nm 波长的 OD 值.每组重复 6 孔.细胞存活率（%）=样品吸光度/对照组吸光度100%.1.3.7 油红 O 染色实验确定油酸钠诱导脂质堆积细胞模型的浓度取对数生长期的 HepG2 细胞，按 4105个/孔接种于 6 孔板，培养 24 h 后，分别加入不同浓度油酸钠造模液（0、50、100、150、200、250 M）诱导细胞 24 h 后移除培养基，每个浓度复孔 3 个.参照油红 O 染液说明书处理后加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察，拍照记录.1.3.8 油红 O 染色实验HepG2 细胞培养 24 h（96 孔板，接种密度为 4104个/mL），设立空白对照组、模型组、给药组（用油酸钠造模液对 HepG2 细胞进行诱导以建立脂质堆积模型；给药组为确定药物安全浓度后，以配制好相应浓度的柚果提取物溶液对细胞进行培养），每组设立 6 个复孔，干预 24 h 后根据油红 O 试剂盒说明书进行处理.然后每孔加入 200L异丙醇室温抽提，酶标仪 37 下测定 510 nm 波长的 OD 值，考察柚果提取物对 HepG2 细胞脂质堆积的作用效果.1.3.9 造模后不同组细胞内甘油三酯变化情况HepG2 细胞培养 24 h（6 孔板，接种密度为 1106个/mL），设立空白对照组、模型组、给药组（0.125,0.25,0.5 mg/mL），每组设立 3 个复孔，干预 24 h 后收集细胞.按照甘油三酯试剂盒说明书测定细胞内甘油三酯含量.1.3.10 数据处理所有数据采用均值标准差表示.使用 GraphPad Prism 7.0 软件进行作图.2 结果与分析2.1 醇提物的成分及含量分析如表 1 所示，柚果醇提物的黄酮含量为 380.13（mg/g），总酚含量为 30.16（mg/g）.其中柚皮苷含量较多，为 128.57（mg/g），橙皮苷含量为 2.21（mg/g），野漆树苷含量为 4.58（mg/g）.嘉应学院学报（自然科学）56表 1柚果醇提物成分xs，n=3指标黄酮总酚柚皮苷橙皮苷野漆树苷含量/mgg-1380.1318.4330.161.38128.5711.052.210.124.580.092.2 DPPH 自由基清除活性柚果醇提物 DPPH 自由基清除能力如表 2 所示：在 5.4787.52 g/mL 浓度范围内，柚果醇提物 DPPH自由基清除率随浓度的增加而增大，具有一定的剂量依赖效应.表 2柚果醇提物的 DPPH 自由基清除能力xs，n=3柚果醇提物/gmL-15.4710.9421.8843.7687.52DPPH 自由基清除率/%5.540.0.720.070.0932.201.4943.032.7358.720.852.3 柚果醇提物对 HepG2 细胞活性影响以柚果醇提物为研究对象，评价在 24 h 和 48 h 内，柚果醇提物（0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL）对 HepG2 细胞活性的影响.由图 1 可知，HepG2 细胞经柚果醇提物处理 24 h 和 48 h 后，细胞存活率随浓度增加而降低，与正常组细胞相比，当干预浓度小于等于 0.5 mg/mL 时，细胞均保持良好的生长活性（柚果醇提物处理 48 h 后存活率在 91.95%以上）；但当干预浓度为 1 mg/mL 时，HepG2 细胞存活率为 83.88%（柚果醇提物处理 48 h 后）.为避免柚果醇提物本身对细胞造成抑制作用，后续药物干预实验采用的梯度浓度为 0.125、0.25 和 0.5 mg/mL.2.4 油酸钠造模液对 HepG2 细胞活力的影响由图 2 可知，随着油酸钠溶液浓度的增大，HepG2 细胞存活率呈现下降趋势.与空白组相比，当油酸钠溶液浓度小于等于 150 M 时细胞存活率达到 77.12%，高于 70%；而当大于等于 200 M 时，细胞存活率大大降低，已经小于 30%.为避免脂肪堆积程度过小，所以初步以油酸钠造模液浓度 100、150 M处理 24 h.图1柚果提取物对HepG2细胞活性影响图2油酸钠造模液对HepG2细胞活力的影响2.5 不同浓度油酸钠干预 HepG2 细胞后脂滴形成情况由图 3 可知，正常组 HepG2 细胞大多呈短梭形或菱形，结构完整，形态规则，分布均匀，生长状态良好，胞浆内无明显脂滴，边界清晰.油酸钠诱导的各组细胞，随着浓度的增加，有不同程度的脂变性，在显微镜下可观察到各组细胞形成了不同程度的红色脂滴.当浓度为 100 M 时，脂滴呈环状连续排列，第 41 卷第 3 期钟瑜萍，梁梓茵，范丽萍，等柚果醇提物的体外抗氧化及改善肝细胞脂质堆积的研究57围绕在细胞核周围；而油酸钠浓度达到 150 M 时，出现了脂滴融合，界限不清，乃至出现细胞破损现象.结合油酸钠对细胞存活率的影响，所以以油酸钠造模液浓度 100 M 处理 HepG2 细胞 24 h 构建脂质堆积模型.图 3不同浓度油酸钠干预 HepG2 细胞后脂滴的形成情况（40 倍镜下）2.6 柚果醇提物对 HepG2 细胞脂质堆积模型的影响由图 4 可知，以 100 M 油酸钠处理 HepG2 细胞 24 h 后，模型组细胞脂质堆积情况较正常组严重，说明脂质堆积模型构建成功.随柚果醇提物浓度的增加，HepG2 细胞脂质堆积模型中的脂肪细胞形成受到抑制.说明柚果醇提物对脂质堆积有改善作用.2.7 柚果醇提物对 HepG2 细胞脂质堆积模型内甘油三酯的影响从图 5 可以看出，以 100 M 油酸钠处理 HepG2 细胞 24 h 后，模型组细胞内甘油三酯含量较正常组高，随柚果醇提物浓度的增加，HepG2 细胞脂质堆积模型内甘油三酯含量逐渐降低.由此说明柚果醇提物能够降低肝细胞脂质堆积模型中的甘油三酯.图 4柚果醇提物对细胞脂质图 5柚果醇提物对细胞脂质堆积模型堆积模型的影响内甘油三酯的影响3 结论本研究结果表明，柚果醇提物的主要成分为黄酮（380.13 mg/g）和总酚（30.16 mg/g）.其中黄酮类成分为柚皮苷、橙皮苷和野漆树苷.柚果醇提物 DPPH 自由基清除率随柚果醇提物浓度的增加而增大.同时本实验以 HepG2 细胞为研究对象，利用安全剂量下的油酸钠（100 M）诱导细胞脂质沉积.结果表明，柚果醇提物（0.5 mg/mL）可缓解油酸钠带来的细胞损伤，降低细胞脂质堆积模型内甘油三酯的含量且不会对细胞造成伤害，柚果醇提物对脂质堆积具有缓解作用.为深入研究柚果醇提物降脂机制等奠定了基础，也为实现柚果的高值化利用提供方向.嘉应学院学报（自然科学）58参考文献：1 尚玮璇,刘璐,雷素珍,等.功能性碳水化合物通过调节肠道菌群和代谢物改善非酒精性脂肪肝的作用机制J.食品与发酵工业,2022,48(14):311-318.2 MUNDI M S,VELAPATI S,PATEL J,et al.Evolution of NAFLD and Its Management J.Nutr Clin Pract.2020,35(1):72-84.3 LI J,ZOU B,YEO Y H,et 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Zhi-wei1,2(1.School of Life Sciencs,Jiaying University,Meizhou 514015,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory ofConservation and Precision Utilization of Characteristic Agricultural Resourcesin Mountainous Areas,Jiaying University,Meizhou 514015,China)Abstract:Abstract:To investigate the effect of alcohol extract of pomelo fruit on HepG2 intracellular lipid accumulation inducedby sodium oleate.Determined the contents of main components in alcohol extract of pomelo fruit,and 1,1-diphenyl-2-hydrazyl(DPPH)scavenging test was adopted to evaluate the antioxidant potential of alcohol extract ofpomelo fruit.CCK-8 method was used to detect the effects of different concentrations of sodium oleate and alcoholextract of pomelo fruit on the viability of HepG2 cells and to select appropriate concentrations for subsequent tests.OilRed O staining was used to determine whether the lipid accumulation model induced by sodium oleate was successful,and the effect of alcohol extract of pomelo fruit on triglyceride content was measured by kit.The contents of flavonoidsand total phenols in alcohol extract of pomelo fruit were 380.13 and 30.16 mg/g,respectively.The contents of naringin,hesperidin and rhoifolin were 128.57,2.21 and 4.58 mg/g.DPPH radical scavenging activity of alcohol extract of pomelofruit was concentration dependent.A certain dose(0.125-0.5 mg/mL)of alcohol extract of pomelo fruit had no effect onthe survival of HepG2 cells,but could reduce the intracellular triglyceride content of hepatocytes induced by sodiumoleate.The alcohol extract of pomelo fruit has antioxidant value and can improve lipid accumulation in HepG2 cellsinduced by sodium oleate.KeyKey words:words:alcohol extract of pomelo fruit;flavonoids;antioxidant activity;HepG2 cells;lipid accumulation