笫九章-植物转化载7教学教程.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,笫九章 植物转化载体的构建,这一章主要有七节,:,一,植物基因工程载体的种类和特征,二 根癌农杆,TI,质粒,三,T-DNA,的结构特点和功能,四,T-DNA,转移的机制,五 植物基因转化载体系统,六 发根家杆菌的,RI,质粒,七 无选择标记基因植物转,笫一节 植物基因工程载体的种类和特征,生物载体介导的遗传转化,非载体介导的遗传转化种 质转化系统,直接转化系统,生物载体介导的遗传化根据截体的不同可以分为病毒载体和质粒载体介导的遗传转化,.,植物转化基因的功能,:,一,它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去,并且整合到宿主细胞的基因组,DNA,上,.,二,它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的,DNA,序列,即启动子和复制子起始点位点,以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达,.,一 病毒载体,1.,单链的,RNA,植物病毒,2.,单链的,DNA,植物病毒,3.,双链的,DNA,植物病毒,以其优点如下,;,植物病毒载体能把外源基因直接导入植物细胞,并且系统地分布到整个植株,无需经过从原生质体再生植株的过程,简化了植物基因工程中外源基因的传递过程,.,病毒具有较高的自我复制能力,在转化植物中可以得到高拷贝的外源基因,有利于外源基因的表达和功能的实现,可以产生大量的外源蛋白质,.,植物病毒载体感染植物后,病毒载体的,DNA,一般不整合到植物细胞核,DNA,上,不影响植物基因组的其他功能基因的表达,.,植物基因工程病毒载体存在的缺陷,:,病毒载体不能把携带的外源基因整合到寄主染色体上,不能按孟德尔规律传递给后代,;,病毒载体仍然存在致病的可能性,可能会诱发植物产生病害,;,病毒载体本身的不稳定性,病毒载体中的外源基因很容易丢失,;,病毒基因组发生突变的频率也很高,.,二 质粒载体,格兰阴性菌,土壤杆菌属,(,特征是能够诱发植物产生肿,瘤,),根瘤菌属,在根瘤土壤杆菌中,决定冠瘿病的质粒,TI,质粒,在毛根土壤杆菌中,决定毛根症的质粒为,RI,质粒,.,它们能引起植物细胞产生病症外,还是理想的基因克隆载体,.,通过它们可以将外源的,DNA,转移到植物细胞,并再生出能够表达外源基因的转基因植物,.,笫二节 根癌农杆菌,TI,质粒,TI,质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状,DNA,分子,约有,150 200KB.,章鱼碱型,胭脂碱型,农杆碱型,农杆菌素碱型,(,琥珀碱型,),在章鱼碱和胭脂碱型,TI,质粒,DNA,分子中,都含有控制肿瘤诱发的两种基因区段,:,T,区段,在肿癌形成期间,从根瘤土壤杆菌 的,TI,质粒上导入植物细胞的,DNQ,片段,约为,23KB.,和毒性区段,在细菌中表达的数个致瘤基因,与,T,区段从细菌转移到植物细胞的遗传有关,.,一,TI,质粒的有关结构,T,DNA:,是农杆菌侵染植物细胞时,从,TI,质粒上导入植物细胞的一段,DNA.,VIR,区,:VIR,上的基因与,T-DNA,从细菌转移到植物细胞遗传过程有关,能够使农杆菌表现毒性,.,CON,区,:,冠瘿碱能激活,TRA,基因,诱导,TI,质粒转移,.,ORI,区,;,调控,TI,质粒的自我复制,故称复制起始区,从植物冠瘿瘤细胞中分别分离核,DNA,叶绿体,DNA,线粒体,DNA,进行分子杂交证实,T-DNA,仅存在于细胞核中,.,大小在,23KB,左右,都含有一段,8KB,左右的核心区,.,胭脂碱,T-DNA,是一条约,23KB,的连续,DNA,片段,两端各有一段,25BP,的重复序列,编码,13,个基因,.,章鱼碱,T-DNA,由两条分离,T-DNA,片段组成,各自带有相应的左边序列和右边界序列,.,长约,14DB,携带,8,个基因,包括章鱼碱合成酶基因和致瘤基因,.,T-DNA,两个重要特性,保留,T-DNA,两端的末端序列,然后用一段外源,DNA,插入或直接取代野生型,T-DNA,的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去,从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力,.,毒性区对,T-DNA,的作用既可以以顺式作用进行,又可以以反式进行,VIR,区,VIR,区段总长度大约,35KB,由,7,个互补群组成,分别为,VIRA,VIRB,VIRC,VIRD,VIRE,VIRG,VIRH.,毒性区有两种情况,:,一种是组成性表达,即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平,.,一种是植物诱导性表达,即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时,植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达,.,下面对各,VIR,基因的性质,功能及作用机制进行阐述,VIRA:,由单一基因所组成,大小为,2.8KB,编码,1,条,92KDA,的多肽,.VIR,基因所编码的蛋白质与一些细菌中起转录调节作用的基因产物有很高的同源性,.,功能,:,是帮助植物细胞接受植物信号分子,然后启动毒性区表达,.,VIRG:,小于,VIRA,只有,1.2KB,为单拷贝基因,只能编码一条多肽,即,DNA,结合化蛋白,VIRG,的调节方式有两种形式,:,它的全诱导表达需要正常功能的完整,VIRA,和,VIRG,基因存在,.,依赖于自身编码的,VIRG,蛋白,.,在乙酰丁香酮存在时,野生型菌株的,VIRG,可以由低,PH,和磷酸饥饿诱导而低水平表达,.,VIRG,的转录方向是从左到右的,最初的翻译起始位点只能是,48-50,位的,VIRG.,VIRG,作为一种,DNA,结合蛋白,可以结合 到,VIRB,C,D,E,G,和,H,操纵的,5,端非转录区,.,VIRD:,包括,4,个开放阅读框架,分别编码分子质量约为,16.2,47.4,21.3,和,75.8KDA,的四种不同的蛋白分子,.,VIRD1,编码一个,DNA,松弛酶,这种酶与,DNA,拓扑异构酶,I,作用类似,它先在,DNA,链上切割一个缺刻,使,DNA,解旋后再封闭,降低了,DNA,超螺旋数目,.,VIRB:,有两种信号肽序列,:,一种与细菌输出信号肽序列相似,.,另一种信号序列属于脂蛋白信号序列,.,VIRC:,是毒性区各位点惟一以反针方向转录的位点,含有两个开放阅读框架,VIRC1,和,VIRC2,分别编码,1,个约,25KDA,的蛋白质和个约,22KDA,的蛋白质,.,VIRH:,对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒作用,.,TI,质粒的生物学功能,控制冠瘿碱的新陈代谢,以,TI,质粒为媒介进行接合转移,笫三节,T,DNA,的结构特点和功能,一,T-DNA,的结构特点,二,T-DNA,的编码基因及功能,T-DNA,的结构特点,TI-,质粒的,T-DNA,分子,J,单拷贝或者是多拷贝的形式随机地整合在植物核基因组,DNA,的位子,.,整合的胭脂碱,T-DNA,分子结构简单,.,单一片段形式存在,.,整合的章鱼碱,T-DNA,分子人结构比较复杂,.,有两片段形式,.,左侧区段具有控制冠瘿瘤形成的基因,右侧区段参与冠瘿瘤碱生物合成的蛋白酶的编码的基因,.,章鱼碱和胭脂碱,TI,质粒之间,边缘区序列相当保守,.,T-DNA,的结构特点,植物冠瘿瘤的诱发并非是由整个,TI,质粒的侵染所致,.,它的形成是由,T-DNA,的,3,个基因,:IAAM,IAAH,IPT.,在,T-DNA,的,5,端和,3,都有真核表达信号,如,TATA-BOX,AATAA-BOX,等,.,分为左边界,(BL,和,TL),右边界,(BR,和,TR),T-DNA,上的编码基因及功能,科学发现,T-DNA,的编码基因很有可能是进化中补,TI,质粒铺获的真核基因为此，和基因的启动因子，在各种不同的植物中都有功能活性,在区中引入转座子，使特定的基因发生突变，突变后的肿瘤细胞中的个或多个转录产物随之消失基因突变后不能转录出它所编码的，这时可观察到带有突变基因的的植物细胞的表型，从而确定基因转录产物的功能,用编码冠瘿碱合成酶及分解借调基因和诱发肿瘤的基因证明了编码两类转录产物的基因序列,上的编码基因及功能,基因突变将阻断肿瘤形成，细胞生长素的大量合成，使细胞分裂素与生长素的比值升高,和基因的表达，使转化植物细胞内激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自主性性，引起癌变,笫四节转移的机制,T-DNA,在植物染色体中的插入是随机的,插入位点常有以下特点,:1.T-DNA,优先整全到转录活跃的植物基因位点,;2.T-DNA,与植物,DNA,连接处富含,A,T,碱基对,;3.,植物,DNA,上的插入靶位点与,T-DNA,边界序列有一定程序的同源性,.,T-DNA,转移的模型和过程,DSBR,模型基本过程,:,首先是植物靶,DNA,产生双链断裂,解旋的靶,DNA,与双链,T-DNA,退火,;,单链部分被,3-5,外切酶或修复系统中单链特异的核酸内切酶去除,;,然后进行修复连接,并由此导致了,DNA,的整合和缺失,靶,DNA,和,T-DNA,缺失程度由靶,DNA,与,T-DNA,互补顺序位置所决定,.,SSGR,模型,:,1.,在靶,DNA,上形成一个缺刻,然后由于部分解旋或,5-3,外切酶消化形成缺口,.,2.,单链,T-DNA,靠近缺口,由于两链存在短的,DNA,互补顺序,于是退火形成异质双链,.,3.T,链未配对的,5-3,单链断部分被除去,T-DNA,末端与靶,DNA,连接,.,4.,在靶,DNA,链的互补链产生缺刻,以游离的,T-DNA,末端为引物修复合成笫二条,T-DNA,.,T-DNA,整合的机制,研究表明,:VIRB,VIRC,VIRD,和,VIRE,基因在转录水平上的表达受植物信号分子,.VIRA,和,VIRG,是属于组成型表达的基因,.,目前普遍认为,T-DNA,是以,T,链形式向植物细胞转移的,而不是,T-DNA,分子,.,它们的形成取决于,VIRD1,入,VIRD2,两种蛋白,.,DNA,非正常重组,1.,两个基本步骤,:DNA,末端的生成,.DNA,末端再连接,.,2.,特点,:,T-DNA,瞄准整合的位点没有序列特异性,.,整合部位的植物,DNA,有小段与,T-DNA,端点附近域同源的序列,.,在重组后的结合可能找到一些额外的核苷酸序列,;,称为填充,DNA.,重组结合部的靶有少量缺失或存在更大部位的重组,.,DNA,非正常重组,3.,基本过程,;,在植物靶,DNA,上出现一个缺刻,随着解链宿主细胞的,5-3,外切酶活性使缺刻扩大成裂口,.,T-DAN,侵入裂口,末端与靶,DNA,单链上的少数核苷酸配对形成异源二倍体,.,T-DNA,悬挂在外侧的末端被切割除去,T-DAN,与靶末端相连,.,靶,DNA,上链出现缺口,然后以整合后的,T-DNA,链为模板合成,T-DNA,的笫二条链,从而完成整个整合过程,.,整合时靶,DNA,所处的环境不同可能使,T-DNA,的整合过程不同,;,1.,当,T-DNA,内部与靶,DNA,同源时,截短的,T-DNA,的可能远离,T-DNA,末端,.,2.,填充,DNA,的产生可能有四种情况,:,来自植物染色体组的另一段,DNA,序列直接与断头相连,片段大小可以从一段很小的寡核苷酸到约,300BP,长的冈崎片段,.,滑动错位修复过程,.,复杂填充,DNA,生成,.,填充,DAN,是,TI,质粒左端序列的一段序列,.,笫五节 植物基因转化载体统,一以,Ti,质粒为基础的遗传转化系统,二构建,Ti,质粒载体的策略,.,野生型的,Ti,质粒,它是植物病原细菌（根癌土壤杆菌）所携带的长度为,kb,的大质粒,Ti,质粒是植物基因工程的一种天然载体但野生型,Ti,质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：,Ti,质粒分子质量过大，一般为,kb,，在基因工程中难以操作大型的野生,Ti,质粒上分布着各种限制酶的多个切点,T-DNA,区内含有许多编码基因，其中,Onc,基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡,Ti,质粒不能在大肠杆菌中复制,Ti,质粒上还存在一些对于,T-DNA,转移不起任何作用的冗余基因,.Onc,卸甲载体,所谓卸甲载体就是无毒的,Ti,质粒载体在这种,Onc,载体中，已经缺失的,T-DNA,部位被大肠杆菌的一种常用的质粒,pBR322,区段所取代。这样任何适合于克隆在,pBR322,质粒中的外源,DNA,片段，都可以通过与,pBR322,质粒,DNA,的同源重组，而被共整合到,Onc-Ti,质粒载体上。,ONC,卸甲载体,常用的受体,Ti,卸甲载体有三种：,pGV3850,载体：是一个由胭脂碱型,Ti,质粒,pTiC58,衍生出来的,Onc,卸甲载体。,pG2250,载体,:,也是属于含,pBR,交换序列的卸甲载体，但它使,pBR322DNA,成为一种多用途受体质粒,pG2250,载体是章鱼碱型,Ti,质粒,pTiB6S3,的衍生质粒它也是被切除了,Onc,基因的载体,pTiB6S3,SE,载体：是由章鱼碱型,Ti,质粒衍生的卸甲载体,TR-DNA,完全缺失，,TL-DNA,仅剩,BamHI-8,的部分片段其中含有,“,左侧内部同源区,”,3,共整合载体系统,共整合载体系统包括在,T-DNA,上的激素合成区经过突变后的,TI,质粒和中间载体的两部分,.,共整合系统的特点是具有两个独立的质粒,:,农杆菌,TI,质粒和大肠杆菌中间载体,.,这两个质粒具有一同源区,在农杆菌和大肠杆菌接合后经过同源重组形成一个大的共整合质粒,.,隔端载体系统是一种较有效的共整合载体系统,它的左右边界分别位于两个独立的质粒上,.,3,共整合载体系统,常见的共整合载体质粒有以下几种,:,PGV3850,系统,PGV2260,系统,PMON200,系统,4,双元载体系统,双元系统的特点,:,两个质粒即穿梭质粒和,TI,质粒,在接合后可以自主性共存于同一农杆菌细胞中,.,双元系统中的农杆菌质料是一个经过改造的,TI,质粒,具有,VIR,基因和农杆菌复制起始子,但没有,T-DNA,边界序列,.,接合合,两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞中,.,当农杆菌感染受伤的植物时,TI,质粒上的,VIR,基因与穿梭质粒上的右边界序列发生反式相互作用,从而将,T-DNA,转移进入植物基因组,这就是双元载体系统的特点,.,4,双元载体系统,双元载体系统避免了共整合步骤,.,这种系统需要两个基本点彼此分离的质粒，一个多功能克隆载体质粒，在大肠杆菌和土壤农杆菌中都能够复制,它该具备以下三个特点；,在它末端序列内含有单一克隆位点和植物选择标记基因,区以外含有细菌选择标记基因，以便选择转化菌株,可以由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中,4,双元载体系统,无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，称三亲交配法,二构建质粒载体的策略,中间载体策略,基本原理是把区片段克隆到普通载体上，把外源基因插入到该区后再导回，受体细胞中，使外源转移到质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该外源基因导入植物体内,如这种质粒载体十分有用，它即能把转入植物细胞基因组，又不会使植物产生冠瘿瘤，而且由于在其中存在着的序列,使它成为一种通用受体质粒,.,2.,双元载体策略,在中间载体策略应用以后,发现,TI,质粒上另一簇基因,(VIR,基因,),起着重要作用,.,T-DNA,向植物基因组插入也不是依靠它的全部结构,只是,T-DNA,两端,25,bp,的反向重复序列作用的结果,2.,双元载体策略,双元,TI,质粒系统的基本特点,:,它由两个彼此相容的,TI,质粒组成,其中之一是含有,T-DNA,转移所必须的,VIR,区段的广寄主范围的,DNA,转移载体质粒,后者含有,T-DNA,的质粒,由于分子质量小,又能够在大肠杆菌细胞中复制,因而易于进行操作,但不具备诱发肿瘤的功能,.,2.,双元载体策略,双元载体法是由,Hoekema,等于,1983,年首次提出,优点在于它不需要构建质粒共合体,.,TI,质粒的寄住范围主要是双子叶植物,在单子植物基因转化中的应用受到了限制,.,嵌合基因的构建,原核生物的基因在植物中表达必须首先具备能在植物细胞中正确,稳定表达的基因调控序列,(5,和,3,端的调控序列,),然后再将调控序列生物基因的结构基因部分按原来方向插入到调控序列之间,.,这种调控序列和结构基因来自两种或两种以上的生物的基因称为嵌合基因,.,有以下几类,;nos_DHFR,nos_CAT,CAMV35S,启动引子和,CaMV35S,启动子,-GUS,等,.,笫六节 发根农杆菌的,RI,质粒,发根农杆菌和根癌农杆菌同属菌科,均为革兰阴性菌,.,根癌农杆菌感染植物细胞后诱导冠瘿瘤及合成冠瘿碱,故称为瘤诱导,TI,质粒,.,发根农杆菌侵染后植物产生许多不定根,这种不定根生长迅速,不断分支成毛状,故称毛状根,也称发状根,.RI,质粒为根诱导质粒,.,与,TI,质粒相比,RI,质粒可以不经”解除武装”进行转化,并且转化产生的发根能够再生植株,;,每条发状根是一个单细胞克隆,可以避免嵌合体,;RI,质粒可直接作为中间载体,;RI,质粒和,TI,质粒可以配合使用建立双元载体系统,拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围,;,发根适于进行离休培养,而且很多植物的发根在离体培养条件下都表现出原植物株次生代谢产物的合成能力,.,可以应用于次生代谢物生产,.,一 发根农杆菌的生物学特性,发根农杆菌是一种寄主非常广泛的土壤细菌,能够侵染几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物,.,RI,质粒具有多种形式,可以归属两种生物型菌株,:,生物型,1;,黄瓜碱型菌株,生物型,2;,农杆碱型和甘露碱型菌株,它们像,TI,质粒一样能够在细菌之间进行质粒转移,.,二,.,发根农杆菌的冠瘿碱合成,在带有完整,T-DNA,质粒或,RI,质粒的转化植物细胞中,都能检测到一类特殊的非蛋白态的氨基酸,这一类氨基酸总称为冠瘿碱,.,1.RI,质粒的基因结构,RI,质粒与,TI,质粒一样是属于巨大质粒,RI,质粒的大小在,200-800kb,之间,并且在一种菌体之中可能存在着多种质粒,.,T,区与,TI,质粒的,T-DNA,十分相似,有以下几个部分,:1.T,区的左右边界序列,2.TL-DNA,区,3.TR-DNA,区,笫七节 无选择标记基因植物转化系统,两种遗传基因,:,标记基因 选择基因,报告基因,目的基因,一 位点特异性重组系统,它是利用重组酶催化两个短的,特定,DNA,序列的重组,来除掉选择标记基因,以获得无标记基因的转基因植物的转化系统,.,包括酵母,FLPFRTS,位点特异性重组系统,Zygosaccharomyces rouxii,的,RSR,位点特异性重组系统,噬菌体,PI,的,CRELOX,位点特异性重组系统以及噬菌体,MU,的,GIN,重组酶系统,.,1.,酵母,FLPFRTS,位点特异性重组系统,FLP,系统 可用于转基因果蝇,喃乳动物细胞,玉米和稻的原生质体,.,2.RRS,系统 它是从环形质粒,pSR1,中分离而来的,.,可用于木本或无性繁殖植物,使之产生,MFTP,也使对某种植物进行多次转化,.,3.Crelox,这个系统是目前植物研究中较先进的方法,.,可以不需要有性杂交而获得了完全选择标记基因的转基因植物,.,二,.,通过转座子使转入的基因在基因组内重新定位,三,.,共转化,四,.,选择标记基因的组织特异性表达,五,.,靶基因替换,