一种超薄切片枸橼酸铅染液的长期保存方法.pdf

网络出版时间：网络出版地址：技术交流一种超薄切片枸橼酸铅染液的长期保存方法冯红丽，彭宇宁，宋敬东关键词：橼酸铅染液；长期保存；真空干燥器；超薄切片；透射电子显微镜中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：接受日期：基金项目：国家重点研发计划（）、传染病预防控制国家重点实验室面上项目（）作者单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室，北京 湖南师范大学物理与电子科学学院，长沙 作者简介：冯红丽，女，硕士，助理研究员。：宋敬东，男，博士，研究员，通讯作者。：超薄切片技术是将样本切成 的切片 ，通过透射电子显微镜（，）观察其细胞器、病理变化及病原体等超微结构，是生物学、医学研究和临床诊断的重要手段 ，由于生物样本对电子的散射能力弱，难以在 下清晰成像，故需要原子序数高、散射电子能力强的重金属染液提高样本超微结构的反差从而获得清晰的图像，枸橼酸铅（，）是最常用的超薄切片染液 ，其优点在于对细胞各种成分都有亲和力，更易与核蛋白、糖原结合。染液的不足之处在于其易与空气中的 反应生成碳酸铅沉淀导致超薄切片上出现大量碳酸铅颗粒而使染色失败，故通常 染液不能长期保存，而是现用、现配。为了能够长期保存 染液，研究者们开发了多种保存方法。真空密闭分装保存法 以及改良铅染液配方的过滤密闭保存法 ，可在一定程度上避免保存过程中 污染，但这些方法操作繁琐。为探索如何简单易行的使 染液长期保存，本文在以往真空保存的基础上优化 染液保存方式，通过检测动植物组织和感染细胞的病毒样本超薄切片进行验证，获得一种简易且能较好的长期保存 染液的方法，现报道如下。材料与方法 实验材料与实验仪器真空干燥器购自北京中镜科仪公司，周龄雌性 小鼠（级）购自北京万德锐志公司；、拟南芥叶片为本实验室保存；购自美国 公司，、由 西太区脊灰参比实验室惠赠；硝酸铅、枸橼酸钠均购自美国 公司，购自美国 公司。超薄切片将小鼠肾、肝、心组织、拟南芥叶片及 、病毒感染细胞样本经 甲醛 戊二醛固定，再进行常规超薄切片制样后染色。染液采用两种方法配制 染液，第一种 配置方法（）：硝酸铅 、枸橼酸钠 加入双蒸水 混合后振荡 ，加入 的 ，定容至 （）。第二种 配置方法（）：的 加入 双蒸水中封闭混匀，再加入 柠檬酸铅混匀至清澈；染液配制后快速分装至离心管并置于干燥器内，同时放置一皿 颗粒（图 ），盖上干燥器盖子，用电动真空泵抽真空至约 （图 ），关闭干燥器阀门保持干燥器的真空状态。使用染液时，打开干燥器进气阀使空气缓慢进入，迅速取出需要的 染液后重新抽真空继续保存剩余染液。染液使用前离心（，）后取上清进行常规 染色 。图 染液保存方法：在真空干燥器中放置 染液和 颗粒；干燥器抽真空至真空状态 实验分组以小鼠肾、肝、心组织、拟南芥叶片及 、病毒感染细胞样本超薄切片染色，将现配 染色切片为对照组，经真空保存 个月 染色切片为实验组进行验证。同时，通过对室温保存 个月的 染液的切片染色检测，以确定是否有 染液污染。电镜染色后的超薄切片在 下通过 相机进行观察并拍照记录，加速电压为 。统计学分析以细胞核膜、线粒体结构、叶绿体结构、各组织整体结构及病毒颗粒结构为目标，将染色效果从差到好依次评为 、分（表 ），每种样本对照组和实验组各随机选取 张照片进行盲测 ，实验数据用 软件统计学分析，结果以珋 表示，真空保存 个月 实验组与现配 对照组间染色效果的均值采用 检验，以 临床与实验病理学杂志 ；（）为差异无统计学意义。表 超薄切片染色效果的评判标准临床参数评分标准评分（分）细胞核膜膜结构迷糊，看不清细节线粒体结构嵴膜结构及衬度差叶绿体结构叶绿体全貌和叶绿体片层结构一般整体结构细胞器整体信息丰富、结构保存良好病毒颗粒结构膜结构清晰锐利，结构显示佳 结果 不同 染液对动物组织的染色本组结果显示随着 染液真空保存时间的延长，两种方法配置的 染液均未出现颗粒污染。检测发现：对照组和实验组的两种 染液对动物组织超薄切片样本染色效果均良好，肾曲小管上皮细胞核膜、线粒体、基板等结构完好（图 ）；肝细胞结构完整，细胞核、线粒体、糖原等清楚可见（图 ）；心肌细胞可见细胞核、细丝状肌原纤维及丰富的线粒体，肌节分带明显（图 ）。同时，室温保存 个月的 染液对心肌组织染色出现大量呈黑色致密的圆形或不定形碳酸铅颗粒污染（图 ），在其它样本染色中也出现同样的颗粒污染。统计分析显示实验组与对照组现配染色效果相比，差异无统计学意义（，图 ）。图 不同 染液对动物组织的染色：对照组 对肾组织的染色；实验组 对肾组织的染色；实验组 对肾组织的染色；对照组 对肝组织的染色；实验组 对肝组织的染色；实验组 对肝组织的染色；对照组 对心组织的染色；实验组 对心组织的染色；实验组 对心组织的染色；室温保存 个月 染液对心组织染色，不定形黑色颗粒为碳酸铅沉淀污染；不同组 染液对动物组织超薄切片样本的染色效果比较临床与实验病理学杂志 ；（）不同 染液对植物组织的染色将对照组 和实验组两种 染液用于拟南芥叶片的超薄切片染色，检测显示其组织成像效果均良好，各种细胞器整体信息丰富、结构清晰，可见叶绿体全貌和叶绿体片层结构（图 ）。统计分析显示：实验组与对照组染色效果相比，差异无统计学意义（，图 ）。图 不同 染液对拟南芥叶片的染色：对照组 对拟南芥叶片的染色；实验组 对拟南芥叶片的染色；实验组 对拟南芥叶片的染色；不同组 染液对拟南芥叶片超薄切片的染色效果比较 不同 染液对病毒感染细胞样本的染色以实验组 染液对 、病毒感染细胞超薄切片染色，结果发现 在细胞内可见包膜、病毒衣壳（最大径约 ）、核心等病毒结构（图 ）；病毒颗粒（最大径约 ）呈正六边形轮廓，大量病毒颗粒在细胞内呈晶格状排列（图 ）；在细胞膜表面出芽，呈长短不一的丝状，刺突结构明显（图 ）；呈球形（最大径约 ），在细胞质内聚集形成晶格状排列（图 ）。四种不同类型病毒的染色效果良好，病毒核衣壳、包膜、刺突等结构清晰可辨，形态特征明显，未见碳酸铅颗粒污染，与常规染色效果相比差异无统计学意义（）。以 染液对四种病毒感染细胞超薄切片染色，检测发现染色效果亦良好。讨论由于 染液保存过程中易与空气中 反应产生碳酸铅沉淀而造成染液失效，染液最好现用现配，但易造成染液及人力的浪费。传统方法用注射器、小口高颈容量瓶等图 染液对病毒的染色：实验组 对 感染 细胞超薄切片的染色；实验组 对 感染 细胞超薄切片的染色；实验组 对 感染 超薄切片的染色；实验组 对 感染 细胞超薄切片的染色保存 染液，数月后在瓶壁上布满白色沉淀导致染液变质失效，以往研究通过改变 染液配方及由注射器和过滤器组成的密闭环路防污染装置以减少碳酸铅沉淀污染，但操作复杂。本实验将两种配方配置的 染液置于干燥器内，并抽真空以减少 的含量，同时放置的 颗粒可与残余 进行反应，进一步降低干燥器内 含量，从而减少碳酸铅形成。结果显示用此方法保存 个月的两种 染液管壁上未见肉眼可见的碳酸铅白色沉淀，显微镜下染液内亦未见晶体状碳酸铅微小颗粒。真空保存 个月的两种 染液对动植物组织超薄切片染色良好，各组织结构清晰且未见显著的碳酸铅颗粒污染。室温保存 个月的 对超薄切片染色出现碳酸铅沉淀污染，在 下呈黑色不定形颗粒。为探讨该方法保存的 染液在病毒上的染色效果，本实验选取 种病毒感染细胞样本：、，用此法保存 个月的 染液进行染色，检测显示病毒形态结构清楚，整体染色效果良好，提示其可应用于病毒样本的染色。保存 染液的注意事项：（）保存时将配制好的 染液根据每次染色用量的需求进行分装，避免使用不当造成染液污染。（）取用 染液后迅速抽真空，并保持较好真空度，本科室真空干燥器长期保持真空度约 ，此条件下可保存染液 个月。（）若 潮湿结块，应及时更换新的 颗粒，以确保降低 浓度的效能。另外，本组用普通家用真空保鲜盒代替干燥器，也能得到与真空干燥器同样的染色效果。综上所述，真空保存 染液的方法具有以下优点：（）操作简单，真空干燥器及家用真空保鲜盒均可用于 染液的保存；（）染液稳定持久，不易造成污染，节约人力，减临床与实验病理学杂志 ；（）少浪费；（）染液可应用于多种动植物组织及病毒感染细胞的超薄切片样本染色。参考文献：杨勇骥实用生物医学电子显微镜技术 上海：第二军医大学出版社，：，：，（）：，（）：张丽芳，姚梅宏，曲利娟，等透射电镜超薄切片染色铅污染的补救方法 临床与实验病理学杂志，（）：刘连璞，朴英杰铅染色液的一种新的保存法 第一军医大学学报，（）：杨传红，赖晃文 铅染液的改良及长期贮存法 电子显微学报，（）：洪涛，王健伟，宋敬东医学病毒图谱 北京：科学出版社，：，（）：冯红丽，肖浩，于海斌微波辅助超薄切片快速染色技术的优化与应用 中华实验和临床病毒学杂志，（）：网络出版时间：网络出版地址：两种脱钙液对骨髓穿刺组织 质量的影响比较李三恩，石晨曦，程丽丽，朱卫东关键词：骨髓穿刺组织；脱钙；混合酸；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：骨髓穿刺组织是病理科常见的标本，随着精准医学的发展和个体化治疗需求的增加，除了进行常规 染色和免疫组化检测外，还需辅助分子生物学检测。良好的 质量是分子生物学检测的前提，脱钙液的选择对 质量有重要影响 ，因此进行分子生物学检测前需要评估脱钙后骨髓穿刺组织 质量。混合酸脱钙液和 脱钙液是本科室两种常用的骨髓穿刺组织脱钙液，在常规组织学染色方面已经取得良好的效果，但其对 质量的影响尚不清楚。本实验通过提取两种脱钙液脱钙骨髓穿刺组织的 ，从浓度、纯度、片段长度及 检测 值比较两种脱钙液对 质量的影响，取得较好效果，现报道如下。材料与方法 材料收集苏州大学附属第一医院存档的骨髓穿刺组织标本 例，所有标本病理诊断均可见淋巴造血系统肿瘤累及。其中，年 月混合酸脱钙液脱钙标本 例，年 月 年 月 脱钙液脱钙标本 例。标本均经 中性福尔马林固定，石蜡包埋组织。接受日期：作者单位：苏州大学附属第一医院病理科，苏州 作者简介：李三恩，女，硕士，主管技师。：朱卫东，男，副主任技师，通讯作者。：脱钙液的配制混合酸脱钙液：甲酸 盐酸（蒸馏水配制）；脱钙液：骨髓穿刺组织脱钙液，购自宁波同盛生物公司。脱钙方法骨髓穿刺组织置于混合酸脱钙液中 或 脱钙液中 ，脱钙液用量为标本体积的 倍以上，用镊子轻弯骨髓组织，当骨髓组织变得柔韧有弹性时，表示脱钙完成。提取连续切 张厚 的蜡卷，置于 的 管中。使用 提取基因组 ，最后用 缓冲液溶解 ；用 检测 浓度和纯度；用 核酸蛋白分析仪评估 片段长度。法按照人 基因突变检测试剂盒说明书，使用两对引物在不同 管分别扩增 个管家基因：内参基因和内控基因，在 荧光 仪上分别选择 和 通道收集内参基因和内控基因的荧光信号，样本上机浓度均为 。评价标准 纯度评价标准 的 的正常范围 ，若比值 时，提示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染；的 的正常值 ，若比值 时，提示样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染 。值评价标准（）内参基因 值正常范围 ，值 时，表明 样品浓度过低、发生降解或可能含有 抑制剂；（）内控基因 值正常值 ，若 值 时，表明 样品发生降解、含有 抑制剂或未加样。统计学分析所有数据采用 软件进行统计学分析，计量资料采用珋 表示，组间比较采用非配对 检验，以 为差异有统计学意义。临床与实验病理学杂志 ；（）