一种过硫酸氢钾复合物粉的消毒效果评价.pdf

2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）试验研究试验研究试验研究试验研究 11 一种过硫酸氢钾复合物粉的消毒效果评价 黄学林1，何金艳2，齐长喜3，吴秋萍1，刘建柱3*，马保臣1,2*（1.江苏中牧倍康药业有限公司，江苏 泰州 225300；2.中国牧工商集团有限公司，北京；3.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安）摘要：为了评价过硫酸氢钾复合物粉的消毒效果，本研究使用过硫酸氢钾复合物粉进行了定量杀菌和杀毒试验、定性杀菌和杀毒试验以及现场消毒试验，结果表明该过硫酸氢钾复合物粉无论是对单种细菌或病毒，还是对饲养环境均具有较好的消毒作用。关键词：消毒剂；过硫酸氢钾复合物粉；杀菌杀毒效果；现场消毒效果 中图分类号：S859.79 文献标识码：A 文章编号：1007-1733（2023）08-0011-04 我国畜禽业的防疫工作始终贯彻“预防为主”的方针。消毒是畜禽业中非常重要的一项内容，是畜禽养殖业确保实现生物安全的前提1。目前，化学消毒剂是畜禽业使用比较多的一种消毒剂，主要分为醇类、酸碱类、氧化剂类、卤素类、醛类、酚类、表面活性剂类2，这类消毒剂刺激性较大、腐蚀性较强。过硫酸氢钾复合物粉是一种具有消毒效率高、使用范围广、安全且无毒等特性的复方消毒剂，已经越来越多地被应用到畜禽养殖业3。过硫酸氢钾复合物粉的作用原理是：溶于水后由链式反应释放出活性氧进而形成羟基自由基、过氧化氢自由基等多种活性成分，使病原体蛋白质变性凝固，产生的羟基自由基可以破坏DNA、RNA的磷酸二酯键，使病原体DNA和RNA的合成受到阻碍，从而起到消毒杀菌作用4,5。本试验使用的过硫酸氢钾复合物粉为粉红色颗粒状粉末，无刺激性气味，有效氯含量不低于10%。目前过硫酸氢钾复合物粉现行的质量标准，只规定了其相关的理化指标6，却没有能对禽养殖业的合理使用提供相关的理论依据和技术指导7。因此，本研究通过试验摸索出过硫酸氢钾复合物粉对常见病原菌和病毒的杀灭效果、最低有效杀菌和杀毒浓度以及现场消毒效果，为其在畜禽养殖中的科学使用提供一定的理论依据。1 材料方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、毒株和细胞 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、摩根氏菌、沙门氏菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、禽白血病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒型以及PK15细胞，均由本实验室保存。表1 本文中用到的病毒基因的引物序列 引物 名称 引物序列（5 3）扩增长 度（bp）ALV-F ALV-R GGTACCCCTGTAGTGATTAAGACAG GAATTCCTAGGCCGCGGCTATGCCTC 750 PPV-F PPV-R ACTCTCAGCTACTGCAGCAT TGCATTATTAACCATCTACTCCAT 500 PRRSV-F PRRSV-R ACCTGAGACCATGAGGTGGG GCAAGCACAAACGGCATCTG 900 PCV2-F PCV2-R TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT 702 PRV-F PRV-R TCTGGCTCTGCGTGCTGTG GGGTCCATTCGTCACTTCCG 352 1.1.2 主要试剂 过硫酸氢钾复合物粉，有效氯含量不低于10%；营养肉汤培养基、LB琼脂培养基，购自青岛高科技工业园海博生物有限公司；无菌脱纤维绵羊血、五水硫代硫酸钠、胰蛋白酶，购自索莱宝科技有限公司；琼脂糖凝胶粉末，购自科尚生物有限公司；50TAE、DNA 共同第一作者 *通讯作者 山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 12 Marker（M116）、核酸染料，购自北京康润诚业生物科技有限公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒、Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒、ApexHFHS DNA聚 合 酶-CL、DNA Marker（AG11904），购自山东赛恩斯科技有限公司；DMEM细胞培养基，购自赛维尔科技有限公司；引物（表1）的设计与合成，均由生工生物工程上海（股份）有限公司完成。1.2 方法 1.2.1 消毒液和中和剂的配制 细菌灭活试验借鉴兽用消毒剂鉴定技术规范（1992年试行）8以及GB15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准9。在超净台内，使用灭菌水将过硫酸氢钾复合物粉按1:200的浓度配制消毒液；用灭菌生理盐水配制1%的硫代硫酸钠溶液作为中和剂10。将PK15细胞在含有10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素）的DMEM培养基中培养，并置于37 含有5%CO2的培养箱中生长。1.2.2 定量杀菌试验 将细菌悬液稀释至1.5106 CFU/mL。吸取0.5 mL细菌悬液加入到无菌离心管中，再吸取4.5 mL消毒液加入，混匀并计时，分别作用10、15、20、30 min，等达到反应时间，向离心管加入1%硫代硫酸钠进行中和。阳性对照组：用灭菌水代替消毒液，其它同试验组。中和10 min后，吸取样品100 uL，分别接种至琼脂培养基平皿和血琼脂培养基平皿中，用无菌玻璃涂布棒将样品均匀地涂布在平皿上，在37 培养箱中倒置培养24 h后，进行菌落计数。杀菌率=（初始菌落数-消毒后菌落数）/初始菌落数100%。1.2.3 定性杀菌试验 采用二倍稀释法。在超净台内，取5支无菌离心管并编号，每管加入营养肉汤培养基4.5 mL，再在第1管中加入按要求配制的消毒液4.5 mL，涡旋混匀，然后吸取4.5 mL加入第2号管，如此倍比稀释至第5号管，第5号管中吸取4.5 mL弃掉。消毒液浓度梯度为1:400到1:6 400，然后按照1.2.2中的方法将消毒液与细菌悬液处理后进行菌落计数。以无菌落生长的平板所对应的最小稀释度的浓度为该消毒剂的最低杀菌有效浓度。1.2.4 现场消毒试验 分别选择墙壁、食槽、水槽、地面4个位置，每个部位取3个点作为取样点，用蘸有无菌1%硫代硫酸钠溶液的棉签在各个取样点上涂擦几下，并将棉签分别放入含10 mL灭菌生理盐水的离心管中，室温浸泡30 min，作为对照。然后使用按要求配制的消毒液对墙壁、食槽、水槽、地面的取样点进行消毒。在消毒10、15、20、30 min后，再分别对墙壁、食槽、水槽、地面4个部位，每个部位取3个点取样，然后将棉签分别放入含10 mL灭菌含有1%硫代硫酸钠生理盐水的离心管中，室温浸泡30 min，作为待测样品。然后按照1.2.2中的方法对样品做接菌培养后进行菌落计数。现场消毒杀菌率=（消毒前菌落数-消毒后菌落数）/消毒前菌落数100%。1.2.5 定量杀毒试验 在超净台中，向无菌试管中加入消毒液4.5 mL，置于20 恒温水浴5 min后，加入0.5 mL病毒悬液，立即混匀并计时，分别作用10、15、20、30 min。向各离心管加入中和剂（1%硫代硫酸钠），中和10 min。阳性（病毒）对照组：用灭菌水代替消毒液，其它同试验组相同。将试验组和阳性（病毒）对照组的待测样品分别接种于PK15细胞，病毒液孵育2 h，然后使用PBS对细胞进行3次清洗，加入含2%胎牛血清的DMEM培养基，最后将细胞培养板置于培养箱中（37，5%CO2）进行培养48 h。48 h后将细胞反复冻融3次，4000 r/min，离心10 min，取上清待测。按病毒DNA/RNA提取试剂说明书提取上清液中的病毒核酸，进行常规PCR检测，使用Image J软件分析电泳条带灰度。杀毒率=（阳性对照组电泳条带灰度-试验组电泳条带灰度）阳性对照组电泳条带灰度100%。1.2.6 定性杀毒试验 按照1.2.3中的方法对消毒液进行二倍稀释，然后将消毒液与病毒悬液处理后进行常规PCR检测。以琼脂糖凝胶中没有电泳条带对应的最小稀释度的浓度为该消毒剂的最低杀毒有效浓度。2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）试验研究试验研究试验研究试验研究 13 2 结果 2.1 定量杀菌结果 结果表明，过硫酸氢钾复合物粉在作用10 min后，能够完全杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、摩根氏菌和沙门氏菌；对链球菌和枯草芽孢杆菌也有较好的杀伤效果，30 min杀菌率分别为99.9%和99.1%，结果见表2。表2 定量杀菌结果 消毒后不同时间的杀菌率 常见病原菌 阳性对照组（CFU/mL）10 min 15 min 20 min 30 min 金黄色葡萄菌 1.5106 100%100%100%100%大肠杆菌 1.5106 100%100%100%100%摩根氏菌 1.5106 100%100%100%100%沙门氏菌 1.5106 100%100%100%100%链球菌 1.5106 99.9%99.9%99.9%99.9%枯草芽孢杆菌 1.5106 99.1%98.8%98.5%99.1%2.2 最低杀菌有效浓度测定结果 根据2.1中的结果，在最大消毒剂配制浓度（1:200）条件下，过硫酸氢钾复合物粉也不能完全杀灭链球菌和枯草芽孢杆菌，因此本试验对其他几种常见病原菌进行了最低杀菌有效浓度测定。结果表明，过硫酸氢钾复合物粉对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、摩根氏菌和沙门氏菌的最低杀菌有效浓度分别为1:3 200、1:3 200、1:800、1:1 600，结果见表3。表3 最低杀菌有效浓度测定结果 消毒液稀释浓度 常见病原菌 阳性 对照组 1:400 1:800 1:1 600 1:3 200 1:6 400 金黄色葡萄菌+-+大肠杆菌+-+摩根氏菌+-+沙门氏菌+-+注：“+”代表有菌生长，“-”代表无菌生长 2.3 现场消毒结果 结果表明，过硫酸氢钾复合物粉用于现场消毒10 min后，对食槽、水槽、地面、墙面的细菌杀灭率在94%以上；消毒30 min后，对食槽、水槽、地面、墙面等表面的细菌杀灭率达到99.9%以上，结果见表4。表4 现场消毒结果 消毒后不同时间的杀菌率 不同表面 阳性对照组（CFU/mL）10 min 15 min 20 min 30 min 食槽 2.4106 100%75%100%100%水槽 3.6106 99.9%99.9%99.9%99.9%地面 6.6106 95%100%97%100%墙面 2.1106 94.8%99.1%98.1%100%2.4 定量杀毒结果 由表5可知，过硫酸氢钾复合物粉在作用10 min后，对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和禽白血病病毒均能起到完全杀灭作用；对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒型杀灭效果较差。表5 定量杀毒结果 消毒后不同时间的杀毒率 常见病毒 阳性 对照组 10 min 15 min 20 min 30 min 猪伪狂犬病病毒+100%100%100%100%猪细小病毒+100%100%100%100%禽白血病病毒+100%100%100%100%猪圆环病毒型+51%51%56%27%猪繁殖与呼吸综合征病毒+54%36%54%49%注：“+”代表电泳条带。表6 最低杀毒有效浓度测定结果 消毒液稀释浓度 常见病毒 阳性 对照组 1:400 1:800 1:1 600 1:3 200 1:6 400 猪伪狂犬病病毒+-+猪细小病毒+-+禽白血病病毒+-+注：“+”代表有电泳条带，“-”代表无电泳条带 2.5 最低杀毒有效浓度测定结果 根据2.4的结果，在最大消毒剂配制浓度（1:200）下，过硫酸氢钾复合物粉也不能完全消杀猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒型，因此对其他几种病毒进行了最低杀毒有效浓度测定。结果表明，过硫酸氢钾复合物粉对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、禽白血病病毒最低杀菌有效浓度分别为1:1 600、1:3 200、1:3 200，结果见表6。山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 14 3 讨论与结论 由于过硫酸氢钾复合物粉在配比上的差异，其消毒效果也存在差异11-12。因此，本文以某公司生产的过硫酸氢钾复合物粉为研究对象，评估了其对常见病原菌和病毒的杀灭效果，还对其现场消毒效果进行了评价。结果表明，该过硫酸氢钾复合物粉对常见病原菌和病毒有很好的消毒效果，且对革兰氏阴性菌的杀灭效果比革兰氏阳性菌好，这与刘元元等11的结果相似。本研究发现该过硫酸氢钾复合物粉对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒型的消毒效果较差，可能与这两种病毒对含氯消毒剂不敏感导致。纪知刚13和Shirai等14研究表明，大部分消毒剂灭不了猪圆环病毒型，而猪繁殖与呼吸综合征病毒更耐含氯消毒剂，这与本试验的研究结果一致。本研究检测出的过硫酸氢钾复合物粉最低有效杀菌和杀毒浓度都比较低，并且该过硫酸氢钾复合物粉对食槽、水槽、地面、墙面表面的细菌有很好的消毒效果，这与刘元元等10的结果相似。较低的杀菌和杀毒浓度和较好的表面消毒效果有利于生产实践中成本的控制和大规模应用。综上所述，该过硫酸氢钾复合物粉无刺鼻气味，具有良好的溶解性和稳定性，无论是对单种细菌或病毒，还是对饲养环境均具有较好的消毒作用。参考文献 1 罗冠群,白哲永,宋永臣,等.6种消毒剂消毒效果的比较J.养殖与饲料,2012,13（12）:15-16.2 桂永.畜禽养殖场消毒的误区及解决方案J.今日畜牧兽医,2021,37（12）:45-53.3 杨俊芸,黄恩龙,胡军,等.一种过硫酸氢钾复合物粉的消毒性能评价J.四川畜牧兽医,2019,46（10）:27-30.4 Anipsitakis GP,Tufano TP,Dionysiou DD.Chemical and microbial decontamination of pool water using activated potassium peroxymonosulfateJ.Water Res,2008,42（12）:2899-2910.5 周德刚,李朋朋,师梦超,等.过硫酸氢钾复合物粉的制备及其相关性能研究J.中国动物保健,2020,22（8）:68-71.6 农业部兽药评审中心.兽药质量标准汇编（2006-2011年）M.北京：中国农业出版社，2012.7 黎健业,梁劲康,吴志玲,等.过硫酸氢钾复合物粉质量研究J.中国兽药杂志,2021,55（5）:28-36.8 农（牧药）字第101号,兽用消毒剂鉴定技术规范（试行）S,1992.9 GB15981-1995,消毒与灭菌效果的评价方法与标准S,1996.10 刘元元,蒋天泽,陈玲,等.过硫酸氢钾复合盐颗粒现场消毒效果试验J.黑龙江畜牧兽医,2019,583（19）:133-134.11 刘元元,蒋天泽,陈玲,等.过硫酸氢钾复合盐颗粒对特定细菌的表面消毒效果现场评价试验J.黑龙江畜牧兽医,2019,587（23）:111-113.12 刘伯承,王慧,刘俊琦,等.不同条件对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响研究J.湖南畜牧兽医,2021,226（6）:34-36.13 纪知刚.合理使用消毒剂是控制猪传染病的关键J.农村养殖技术,2008,241（4）:23.14 Shirai J,Kanno T,Tsuchiya Y,et al.Effects of chlorine,iodine,and quaternary ammonium compound disinfectants on several exotic disease virusesJ.J Vet Med Sci.2000,62（1）:85-92.（收稿日期：2022-10-18）（上接10页）视频图像哺乳母猪姿态J.农业工程学报,2018,34（9）:189-196.5 李丹,张凯锋,李行健,等.基于Mask R-CNN的猪只爬跨行为识别J.农业机械学报,2019,50（S1）:261-266,275.6 李菊霞,李艳文,牛帆,等.基于YOLOv4的猪只饮食行为检测方法J.农业机械学报,2021,52（3）:251-256.7 Li S,Kang X,Feng Y,et al.Detection method for individual pig based on improved YOLOv4 Convolutional Neural NetworkC.New York:ACM,2021:231-235.8 季照潼,李东明,王娟,等.基于深度学习YOLO v4的舍养育肥猪行为识别J.黑龙江畜牧兽医,2021（14）:39-42,151.9 丁奇安,刘龙申,陈佳,等.基于Jetson Nano+YOLO v5的哺乳期仔猪目标检测J.农业机械学报,2022,53（3）:277-284.10 WOO S,PARK J,LEE J 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