胰腺癌生物模型的应用现状与展望.pdf

第 40 卷第 4 期2023 年 8 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.4August 2023综述收稿日期:2022-08-17基金项目:江苏省卫健委科技发展项目(Z2020069)作者简介:徐冬(1987),男,博士,从事胰腺癌转移机制的基础和临床研究.E-mail:werwet123 通信作者:杨飞(1989),女,学士,主管护师,从事消化道肿瘤预康复的基础及临床研究.E-mail:334117776 胰腺癌生物模型的应用现状与展望徐 冬1 杨 飞2(南京市高淳人民医院 1.普外科,2.大内科,南京211300)摘要:胰腺癌恶性程度高、早期诊断困难且易转移,患者就诊时常因病灶局部进展而失去根治性手术时机,虽然在综合治疗效果方面已取得明显提高,但患者生存率依然很低,预后差。胰腺癌的隐匿发病使研究者无法及时获取早期病灶进行深入研究,因此,构建合适的生物模型,对研究胰腺癌发生发展的分子机制并寻找新的治疗策略至关重要。目前常用于胰腺癌临床前研究的生物模型包括自发诱导模型、移植瘤模型、类器官模型等,本文对各模型的应用现状进行综述。关键词:胰腺癌;生物模型;现状;展望中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)04-0076-07DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.015Current State and Future Perspectives of Biological Models in Pancreatic CancerXU Dong1,YANG Fei2(1.Department of General Surgery,2.Department of Internal Medicine,Gaochun Peoples Hospital,Nanjing 211300,China)Abstract:Attributable to its highly malignant feature,late diagnosis and early metastasis,pancreatic cancer patients often lost the opportunity of radical surgery due to the local advanced lesion.Although significant progress has been made in the effect of comprehensive treatment,the patients were still with poor overall prognosis and low survival rate.The insidious symptoms of pancreatic cancer limited investigators to acquire early tissue timely for in-depth study,therefore,a suitable biological model should be constructed to investigate the molecular mechanisms underlying pancreatic cancer initiation and progression,and to evaluate new therapies.Spontaneous tumor animal models,transplanted tumor models and pancreatic cancer organoid were the most commonly used preclinical biological models,and we reviewed the current trends in applications of biological models in pancreatic cancer in this paper.Key words:pancreatic cancer;biological models;current state;future perspectives胰 腺 癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)将在 2030 年跃居全球癌症发病率第二位,其发病隐匿、易早期转移的特点使患者在就诊时常处于中晚病期而失去根治性手术机会,虽然包括FOLFIRINOX 等方案在内的综合治疗使 PDAC 患者的 5 年生存率由 6%升至 10%,但整体预后仍然很差1-2,研究其发生发展的分子机制对 PDAC 诊疗具有重要意义。PDAC 的生物学特点使临床医生很难在根治性手术前提下、完整获取不同分期的病灶以验证通过各种组学方法筛选的某些新靶点的生物学功能。因此,亟需一种可同时助力 PDAC 发生发展、转移、复发等机制研究,并用以探索新治疗手段的生第 4 期徐冬等:胰腺癌生物模型的应用现状与展望 物模型。理想的 PDAC 模型需具备以下特 点3:(1)具有与人源 PDAC 相似的生物发展过程且稳定可重复。(2)具备诸如免疫逃逸、侵袭、转移、神经侵犯等恶性表型。(3)模型构建效率高、成本低、周期短、可量产。而目前用于 PDAC 研究的诸如自发诱导模型、移植瘤模型、类器官模型以及大动物模型,虽然可重现 PDAC 的某些病理过程,但仍不能完整模拟 PDAC 的生物学变化,优势与弊端并存3。本文综述了上述各类生物模型的应用现状,以期为PDAC 研究的模型选择提供参考。1诱导模型诱导模型,指使用化学或基因技术诱导实验动物产生类似人源结构的特定肿瘤,且该肿瘤的研究结果与人源肿瘤高度类似。由于构建该模型监测时间长、花费高、成功率不一,且无法在短期内获得大量的肿瘤组织,限制了其应用。1.1化学诱导Wilson 等4于 1941 年首次发现,白化大鼠在长期食用添加 2-乙酰胺氟的食物后出现胰腺癌,组织学呈现腺瘤及腺泡细胞癌,而无导管样结构。在1974 年由 Pour 等成功构建首个类似人 PDAC 的啮齿类动物诱导模型,即连续接受含 2,2-二羟基-二-N-丙基亚硝胺(DIPN)喂食的叙利亚金黄仓鼠出现可侵犯神经并具有肝、肺、淋巴结转移倾向的胰腺癌,同时出现诸如体质量减轻、黄疸、腹水和血栓形成等症状,另外还合并第 12 密码子的 KRAS 点突变(G12D)以及抑癌基因 CDKN2A 的缺失和异常甲基化,但无抑癌基因 Trp53 突变5。亦有研究报道,N-亚硝基双(2-氧丙基)胺(BOP)特异性诱发仓鼠胰腺癌但机制不明,而对豚鼠、兔子等动物无致瘤作用,BOP 模型除了具有 DIPN 模型的特征之外,还可检测到糖耐量异常以及 CA125、EGFR 等血清抗原的异常表达6-7,组织分析发现 BOP 诱导的仓鼠胰腺导管损伤起源于异常增殖的导管细胞,而不是去分化的腺泡细胞8。目前,已有包括重氮丝氨酸、氯贝特等在内的 16 种化合物可以诱导鼠类胰腺癌发生,同时还发现在使用不同类型化合物诱导后,鼠类主要发生无导管结构的胰腺腺泡型肿瘤,而对豚鼠化学诱导的胰腺癌组织分析显示,PDAC 主要经由 腺 泡-导 管 化 生(acinar-to-ductal metaplasia,ADM)的病理生理学过程发展而来9。化学诱导的仓鼠 模 型,可 以 帮 助 识 别 已 知 的 和 新 出 现 的 人PDAC 危险因素并指导针对性干预措施的实施,但致癌化合物特异性差,在诱导 PDAC 的同时也可能诱发其他腹腔器官肿瘤,限制了其应用。1.2基因工程诱导正常胰腺上皮发生癌变与癌基因 KRASG12D的激活,及 其 与 抑 癌 基 因 CDKN2A、Trp53、Smad4、BRCA2 等失活之间的协同作用密切相关。有研究于 2003 年利用弹性蛋白酶启动子介导,首次成功构建并证实单独的 KRASG12D突变可诱导正常胰腺导管 发 生 非 侵 袭 性 癌 前 病 变,即 上 皮 内 瘤 变(PanINs),但不会导致侵袭性癌变的小鼠模型10。后经 Brembeck FH 通过细胞角蛋白 19(CK19)报告基因实验证实 KRASG12D突变诱导的胰腺导管样病变可能通过 ADM 发生并伴随病灶周围淋巴细胞浸润,靶 向 抑 制 KRASG12D表 达 后 小 鼠 未 出 现PanINs10。基于 KRASG12D在 PDAC 发生中发挥的驱动作用,结合条件基因打靶技术(即 Cre-Loxp 技术)经靶向胰腺的组织特异性启动子介导将癌基因导入小鼠胚胎或体细胞后诱发胰腺癌,即为基因工程小 鼠 模 型(genetically engineered mouse models,GEMMs)11,常 见 种 类 包 括10,12-15:KC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre)模型:致瘤缓慢,可出现正常胰腺组 织-ADM-PanINs 的 病 理 过 程,具 备 发 展 为PDAC 倾向,主要用于胰腺癌早期发生和预防方面的 研 究。KPC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,LSL-Trp53R172H或 CDKN2Alox/lox)模型:致瘤迅速,可出现正常胰腺组织-PDAC-侵袭转移的病理过程,被周围基质包绕的瘤体血供丰富且对吉西他滨耐药,主要用于 PDAC 发生发展、转移、耐药等方面的研究,目前被认为是研究 PDAC 发生发展分子机制的动物模型 金 标 准。KIC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,CDKN2A/Arflox/lox)模型:亦 可出现正常胰 腺组织-PanINs-PDAC-侵袭转移的病理过程,但肿瘤进展比KPC 模 型 更 快,用 途 同 KPC 模 型。KD(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,Smad4lox/lox)模型:可缓慢形成胰腺导管内乳头状黏液肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN),用以研究 IPMN 发生发展及逐 步 癌 变 的 分 子 机 制。其 他 模 型:比 如PRF1a-Cre,LSL-KRASG12D,TGFBR2lox/lox模型的瘤体组织结构类似人 PDAC,用以研究转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF-)信 号 通 路 对PDAC 发 展 的 作 用 机 制,Nestin-Cre,LSL-KRASG12D77 实验动物科学40 卷模型,由于肿瘤侵犯神经,该模型小鼠生存期较短,用以研究胰腺炎加速 PDAC 发生发展的分子机制。另外,亦有非依赖 KRASG12D突变的 GEMMs 报道。有研究利用大鼠弹性蛋白-1 启动子介导、在小鼠体内表达致癌猿猴病毒 40T 抗原后出现胰腺腺泡发育不良,成年后发展为肿瘤,生存期约为 4 至 6 个月16。还有研究基于抑癌基因 PTEN 失活构建的Pdx1-CreERTM;PTENlox/lox模 型 在 3 周 龄 时 出 现ADM,并在 11 周龄时出现 PDAC17。GEMMs 虽可模拟人源 PDAC 发生发展、侵袭转移、耐药等病理过程,并确定治疗效果,但也有其弊端:建模时间不可控、成本高、难以量产。难以鉴定 GEMMs 与人源 PDAC 的同源程度,不能完全理想化诠释 PDAC 的发生发展机制。在建模过程中,可能会引入新的未知突变。2移植瘤模型移植瘤模型是指将 PDAC 细胞系或人源 PDAC原代细胞、组织接种于免疫缺陷鼠(裸鼠或 SCID鼠)体内所形成的荷瘤动物模型。按接种部位分为原位移植、异位移植;按移植物来源分为同种移植和异种移植,后者根据移植物种类分为人源肿瘤细胞移植模型和人源肿瘤组织移植模型(patient-derived tumor xenografts,PDX)18。有研 究 于 1963 年 构 建 了 首 例 胰 腺 癌 细 胞系19,在使用 PDAC 细胞系构建原位/异位模型之前,需充分了解拟选择的细胞系的临床背景,生长特性,黏附、侵袭、转移等表型特征以及基因突变类型3,比如:在迁移能力方面,细胞系 PANC-1 是BxPc-3 的 5 倍。在成瘤能力方面,由强到弱的细胞系为 Mia PaCa-2Capan-1PANC-1。在转移倾向 方 面,细 胞 系 CFPAC-1、Capan-1 易 肝 转 移,SW1990 易脾转移,Colo357、Hs766T 易 淋 巴 转 移,Capan-1/2 易神经侵犯。随着不同 PDAC 细胞系广泛用于建立移植瘤模型,研究者发现其优势包括易获取、增殖周期短、可重复性高、成瘤迅速,同时发现随着传代次数增加出现的遗传漂变,移植瘤周围缺少典型的人源肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)以及无法代表人源 PDAC 的初期状态和病变特征亦是其弊端20。2.1异位移植模型异位移植是指将体外培养的 PDAC 细胞系或人源 PDAC 原代细胞接种于免疫缺陷鼠的腹背或腹股沟皮下(subcutaneous,SC)产生的移植瘤模型,具有操作方便、高效、可重复性高,并可直观的监测移植瘤的生长情况的优势,但该移植瘤仅限于皮下生长,无远处转移及内脏器官侵犯能力,无法真实反映PDAC 的肿瘤微环境,因此仅用以评估肿瘤对抗体或细胞药物等特定药物的反应情况,尚不适合分子机制研究21-22。PDAC 细胞悬液的异位移植还能构建转移性模型用以研究 PDAC 的转移机制3,比如:脾静 脉或肝包膜 下注射构建 肝转移模型。尾静脉注射构建肺转移模型。鼠爪注射构建淋巴转移模型。将人体腹腔干或肠系膜上动脉表面神经组织移植在皮下,4 周后在紧贴移植部位皮下注射癌细胞悬液的方法构建神经侵犯模型。2.2原位移植模型又名同位移植(orthotopic transplantation,OT),是指将体外培养的 PDAC 细胞接种于裸鼠胰腺后成瘤,自 1980 年开始被广泛应用,目前常用的接种方式包括3:裸鼠胰腺包膜下注射细胞悬液,但可能因注射部位癌细胞渗漏导致腹腔种植转移。裸鼠皮下注射 PDAC 细胞悬液培养 4 周成瘤后,切除瘤体切割成 1 2 mm3组织块再接种于裸鼠胰尾包膜下。将 PDAC 细胞悬液注射入热敏生物凝胶,待其成瘤后再接种于裸鼠胰尾包膜下,胶体的黏附特性可防止癌细胞脱落。与 SC 模型相比,OT 模型移植瘤的 TME 类似人源 PDAC,并且瘤体在裸鼠体内自然生长,据此可进行生存率的模型研究23。但构建 OT 模型需严格的无菌操作和精细的外科切开缝合技术,术后也可能因切口感染、裂开,缝合胰腺胞膜所用缝线引起的局部炎性反应等并发症导致建模失败24。2.3PDX 移植模型是指将人源 PDAC 组织植入免疫缺陷鼠的胰腺,保留的人源 TME 能在移植初始(10 代以内)模拟人体内的药物传递状态,并真实反应人源 PDAC的组织学和遗传学特征,鉴于能在普通 SPF 级动物实验 室 制 备 的 优 势,被 应 用 于 PDAC 临 床 前 研究25。在 PDAC 肿瘤标志物鉴定方面,有研究于2006 年首次利用 PDX 模型发现高表达脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,DCK)的 PDCA 对吉西他滨(gemcitabine,GEM)化疗敏感性较高,后续还发现低表达 Smad4 且 PDX 建模成功的 PDAC 原宿主(患者)的生存期较短26-27。有研究通过放射性标记发87第 4 期徐冬等:胰腺癌生物模型的应用现状与展望 现,丙酮酸向乳酸转化增加的 PDAC 增殖较快28。在临床前药物评估方面,还有研究首次利用 PDX 模型发现与 GEM 单药化疗相比,球状激酶 1(Polo-like kinase 1,PLK-1)抑制剂利戈塞替布与 GEM 的联合用药可降低 PDAC 对 GEM 的耐药性并进一步促进PDAC 退缩,说明利戈塞替布可作为潜在的 GEM 增敏剂29。研究发现,PLK-4 抑制剂 CFI-400945 能降低 PDAC 增殖标志物 Ki-67 的表达,抑制增殖并延长 PDX 模型的生存时间30,说明 CFI-400945 具有潜在应用价值。在精准医学和临床相关性研究方面,研究表明入组了包括 4 例 PDAC 在内的 14 例实体肿瘤患者,利用 63 种具有抗癌活性的化合物、搭配成 232 种组合后给药于构建的 14 例 PDX 模型,除了 1 例患者在研究结果明确前死亡之外,其余 13例患者均接受了 PDX 模型预测的最有效的药物治疗,其中有 11 例患者接受了 17 种药物组合后发现15 种组 合 可 出 现 肿 瘤 负 荷 持 续 缓 解;而 且 针 对PDAC 患者,筛选了 15 种单药和 7 种组合药用于后续的临床实验31。有研究在一例已确诊对 GEM 耐药患者的 PDX 模型中发现肿瘤对丝裂霉素 C 和顺铂敏感,给予该患者丝裂霉素 C 单药治疗后其无进展生存期(progression-free survival,PFS)达到 22 个月,由于肾毒性影响,将丝裂霉素 C 更换为顺铂后,患者 PFS 又延长了 36 个月32。以上两项代表性研究说明,PDX 模型可助力肿瘤精准治疗的发展。另外,PDX 模型亦有其弊端33-34:该模型是已确定的人源 PDAC 衍生物,不适合研究在正常组织稳态和疾病起始中的基因突变和分子机制。该模型建立在免疫缺陷鼠体内,不能反应人源免疫系统对 PDAC 发生发展的影响。随着 PDX 传代次数增加,PDAC 组织可能会出现遗传漂变,导致无法与人 源 PDAC 基 因 组 同 质 化 分 析,并 且 移 植 的PDAC 组织内的人源 TME 逐渐被宿主 TME 取代,无法反应人源 TME 对 PDAC 进展的影响。人-鼠之间的分子受体、配体不相容,致使移植的 PDAC 组织在宿主体内无法重现其在人体内的某些分子生物学过程。成瘤缓慢且移植成功率高低不一。3类器官模型体外培养胰腺器官可追溯至 1938 年,有研究通过冲淋法体外培养鼠源胰腺 组织达 4 周35。自1980 年开始,探索如何体外培养 3D 结构胰腺组织的研究者渐多36,其中利用琼脂糖培养基将切取的人源 PDAC 组织在体外培养长达 6 d 并用于评估基因治疗效果开启了 PDAC 类器官研究的浪潮37。直至 2015 年,有研究首次利用基质胶成功构建了人源 PDAC 细胞的类器官(patient-derived organoids,PDO),并将其原位移植于免疫缺陷鼠体内,产生类似癌前病变并进展为侵袭性癌变伴转移的效果38。目前,PDO 是指将手术切除的 PDAC 标本或活检组织,在细胞类型、基质胶、生长因子及信号传导四方面条件均具备情况下,培养出的保留 PDAC 组织学和遗传学特征的 3D 培养物39,且已有研究证实处于各个病期的 PDAC 均可培养出相应的 PDO40。由于 PDO 在精准捕获不同患者的 PDAC 异质性、培养的个体化迷你模型可以高效的移植入免疫缺陷鼠、精准反馈患者对药物的敏感性以及该敏感性评估结果可在 PDX 模型中复现这四方面的优势,使其已用于 PDAC 发生发展机制及 TME 特征研究,以及作为“试验台”对某些治疗方案进行临床前效果评估,并为精准的个体化治疗提供数据指导,缩短临床前研究与临床实验的时间窗38,41。虽然 PDO 具有显著优势,但也不可忽视其弊端:PDO 缺乏 TME中的神经、血管、免疫细胞等成分,限制了该模型的应用广度。培养 PDO 使用的基质胶并不能完全复制体内的 TME,且会影响药效评估时的药物渗透。PDO 培养所使用的生长因子等试剂可能诱发细胞基因组变异,影响研究结果。PDO 花费高,培养周期长,培养成功率低。4大动物模型虽然 PDO 的发展提高了 PDAC 临床前研究结果的可靠性,但绝大多数的模型研究还是以啮齿鼠类为主,由于鼠类体型偏小导致某些针对介入或外科技术无法按照设想落实研究。因此,为了研究某种具备治疗潜力但无法在鼠类模型验证其功效的技术或方法,以及为了获得一种高效的在临床实验之前用于评估某新型抗癌药的临床前研究平台,诸如灵长类、犬类或猪等动物模型便进入研究视野42。非人灵长类最“像人类”,但涉及的社会和伦理问题极大限制了其应用43。虽然犬类在研究诸如乳腺癌、淋巴瘤等年龄相关性肿瘤方面发挥了重要作用,但它作为人类的动物伴侣以及涉及的伦理问题,亦限制了应用44。97 实验动物科学40 卷目前,猪模型已用于创伤、伤口愈合、动脉粥样硬化、囊性纤维化、杜氏肌营养不良、共济失调性毛细血管扩张症、脏器移植、肿瘤等方面的研究45-48,与其他动物模型相比,猪模型具有以下优势:与小鼠-人类的同源率(60%70%)相比,猪在基因组、表观遗传学、生理学、代谢组学和免疫学特征方面与人类具有更大的相似性(80%90%),可用以研究肿瘤早期发病时的相关分子机制49。猪的体型大小与人类相似,可用以研究某些在鼠类模型上无法使用的新诊断仪器(如影像定位、荧光监测)、治疗设备(如手术器械)和技术(如导管介入、放化疗)50-51。猪的血容量丰富,可在肿瘤进展的不同阶段多次采血研究肿瘤标志物的动态变化,甚至可将外周血中的免疫细胞功能化处理(如 CAR-T 治疗)后 再 回 输 入 猪 体 内 验 证 细 胞 免 疫 治 疗 的 疗效52。基于以上优势,猪模型目前已成为大动物模型的首选。受 GEMMs 的启发,Hingorani 等于 2012年 构 建 了 首 例 类 似 KPC 小 鼠 的 KRASG12D;Trp53R167H双突变转基因迷你猪模型(oncopig cancer model,OCM),且 OCM 体内的任何细胞经重组酶(Cre)诱导后均可产生 KRASG12D;Trp53R167H双突变15。有研究于 2015 年利用 Cre 腺病毒(AdCre)体外 诱 导 OCM 的 成 纤 维 细 胞 产 生 KRASG12D;Trp53R167H双突变后,发现其增殖周期缩短并具备了促进肿瘤细胞迁移及菌落形成的致瘤倾向,将该细胞注射入免疫缺陷鼠后可局部促瘤形成;同时,该促瘤特性在 OCM 的皮下和肌肉注射时也得到了复现。研究发现53:将 OCM 来源的胰腺导管上皮细胞经 AdCre 体外诱导后,出现转化表型及 KRASG12D;Trp53R167H双突变,再将这些细胞皮下移植到 SCID鼠后 形 成 组 织 学 类 似 人 源 PDAC 的 瘤 体。将AdCre 注射入 OCM 主胰管约 12 个月后,逐渐出现组织形态(致密的癌周围基质成分)类似人源 PDAC的胰腺癌结节。但注射过程需严格无菌操作,避免因局部感染导致多形性肿瘤而降低了 OCM-临床相关性。OCM 具有完整的免疫系统,能够产生类似于人类的抗肿瘤免疫反应方便免疫治疗研究。该研究也暴露了 OCM 的弊端:OCM 是否具有普适性;如何质控 AdCre 的操作流程和生物安全性;GEMMs 操作所用的试剂和分子工具是否适合 OCM;成瘤周期长、体型大、饲养成本高。5其他斑马鱼与人类祖先的差异进化已超过 3 亿年,但两者在某些肿瘤信号通路和调控分子方面高度同源,转基因斑马鱼已广泛用于 PDAC 基础研究54。有研究于 2008 年构建的 PTF1a-eGFP-hKRASG12V单突变斑马鱼在 9 个月时约 70%的鱼群产生了具有侵袭和转移倾向的类似人源的 PDAC,组织学呈现腺泡细胞癌、导管腺癌、黏液腺癌的多类型分化55。该团队在 2011 年构建的 PTF1a-Gal4-VP16,UAS-eGFP-hKRASG12V双突变斑马鱼在 5 个月时约 50%的鱼群产生了类似人源的 PDAC,组织学表现同前56。研究表明,将 Mia Paca-2 细胞注射入幼年和成年 斑 马 鱼 体 内 后 均 可 散 在 成 瘤,该 现 象 可 被KRAS 抑制剂 U0126 抑制57。亦有学者将荧光标记的 PDAC 细胞注射入斑马鱼主静脉并动态影像监测细胞转移进程,该模型已用于研究转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷 酸 化 在 上 皮-间 质 转 化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及 转 移 中 的 作 用机制58-59。6结语生物模型对揭示 PDAC 发生发展的分子机制及临床前综合治疗效果的评估具有重要意义,但每种模型均有其优缺点,目前尚无能够满足所有研究需求的生物模型。我们需结合研究目的、条件、动物福利等因素选择合适的模型,以期最大程度的降低实验误差,减少资源浪费;同时需改善各模型的弊端,为 PDAC 基础研究构建最符合人体实际的模型工具。只有这样,才能更精确的认识 PDAC,为后续的转化研究提供理论支持。参 考 文 献 1 KLEIN A P.Pancreatic cancer epidemiology:understanding the role of lifestyle and inherited risk factors J.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2021,18(7):493-502.2 RYAN D 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