依维莫司激活自噬缓解氯化亚铁诱导创伤性癫痫.pdf

6期第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University创伤后癫痫（post-traumatic epilepsy，PTE）是脑创伤（traumatic brain injury，TBI）最常见的慢性并发症。相关研究1表明，15%25%中重度 TBI 患者会发展成为 PTE，占一般人群获得性癫痫的20%。目前，临床主要治疗策略是在 TBI 早期给予抗癫痫药物，但降低 PTE 的发生率仍是一个医学难题2。细胞自噬存在于正常细胞中，是溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子的过程，对维持细胞稳态非常重要3。有研究2，4表明自噬不仅参与PTE的发生，当自噬受损时还可导致 PTE 的发展。依维莫司可有效地抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达，促进自噬的发生5，因此，推测依维莫司可能通过调节自噬在 PTE 中发挥一定的治疗作用。基于以上研究背景，本研究通过给予氯化亚铁诱导的 PTE 大鼠依维莫司治疗，探讨依维莫司对氯化亚铁皮质注射诱导的 PTE 大鼠自噬的影响。1材料与方法1.1实验动物大鼠均由宁夏医科大学实验动物中心供给，随机选取健康成年雄性 SPF 级 SD 大鼠 30 只，6耀8 周龄，体质量 200耀240 g。所有大鼠均安置在湿度适中、温度处于恒定室温（22耀24 益）的饲养房里，笼舍自然光照明及通风。按时用标准饲料喂养大鼠，保证大鼠每天可自由摄食和饮水。1.2主要试剂及仪器1.2.1试剂氯化亚铁（美国 Sigma 公司）；依维莫司（北京索莱宝科技有限公司）；异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；多聚甲醛（北京雷根生物技术有限公司）；苏木素-伊红染液（北京索莱宝生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量检测试剂盒（美国 Sigma 公司）；Trizol 试剂（美国 Sig原ma 公司）；酶标二抗（武汉艾美捷科技有限公司）；白细胞介素（IL）-1茁、Beclin-1、IL-4、肿瘤坏死因子 琢（TNF-琢）、茁-actin、P62 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。1.2.2仪器Bio-Rad 蛋白电泳及转印装置（美国 Bio-Rad 公司）；Odyssey 双色红外激光成像系统（美国 LI-COR 公司）；PVDF 膜（武汉赛维尔生物科技有限公司）；天平测量仪（上海天平仪器技术有限公司）；大鼠立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；动物麻醉机（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；台式牙科钻（深圳瑞沃德生命科技收稿日期：2023-03-08基金项目：宁夏回族自治区“十三五”重大科技项目（2016BZ07）作者简介：冯岩，男，在读硕士研究生，研究方向：创伤后癫痫的治疗。通信作者：孙涛，男，博士研究生导师。E-mail：依维莫司激活自噬缓解氯化亚铁诱导创伤性癫痫冯岩1，2，3，喻文琴1，3，孙雨2，王安妮1，3，李文超1，3，肖立飞1，3，霍显浩1，3，孙涛1，2（1.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川750004；3.宁夏医科大学总医院，银川750004）摘要：目的探讨依维莫司对氯化亚铁皮质注射诱导的创伤后癫痫（PTE）大鼠自噬的影响。方法将 30 只大鼠随机分为 Sham 组、PTE 组、依维莫司组，采用氯化亚铁注射大鼠右侧额叶皮质建立 PTE 模型，依维莫司组大鼠给予依维莫司 5 mg （kg d）-1 灌胃治疗，PTE 组和 Sham 组每日给予等体积生理盐水灌胃处理，监测各组大鼠脑电变化、Racine 评分癫痫发作，2 周后处死大鼠。HE 染色观察脑组织前额叶区和海马区病理变化，尼氏染色观察海马区神经元变化，免疫印迹检测炎性因子白细胞介素（IL）-1茁、IL-4、肿瘤坏死因子-琢（TNF-琢）、自噬相关蛋白 Beclin-1 和 P62。结果与 Sham 组相比，PTE 组脑电呈现高尖波形，脑组织病理形态及神经元损伤加重，尼氏染色见海马区神经元和尼氏体减少，炎性因子 IL-1茁、IL-4、TNF-琢 增加，组织和血清中自噬蛋白 Beclin-1 降低、P62 增加（P均0.05）。与 PTE 组相比，依维莫司组大鼠脑组织病理损伤减轻，尼氏染色见神经元、尼氏体增加，炎性因子 IL-1茁、IL-4、TNF-琢 降低，自噬蛋白 Beclin-1 增加、P62 降低（P均0.05）。结论依维莫司可显著改善 PTE 大鼠脑组织损伤，减少神经元死亡，其机制可能与促进自噬、降低炎性水平有关。关键词：创伤后癫痫；依维莫司；自噬中图分类号：R742.1文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.011文章编号：1674-6309（2023）06-605-07论著605窑窑宁夏医科大学学报4缘卷有限公司）；10 滋L 斜头微量进样器 哈美顿（上海）实验器材有限公司；石蜡切片机（德国徕卡公司）；微量移液器（德国普兰德公司）；超低温冰箱（美国赛默飞世尔科技公司）。1.3实验方法1.3.1实验动物分组将 30 只大鼠随机分为 3组，每组 10 只。假手术组（Sham 组）：额叶立体定位注射 5 滋L 生理盐水。模型组（PTE 组）：额叶立体定位注射 5 滋L 氯化亚铁，造模成功后每日给予同体积生理盐水灌胃治疗。依维莫司组：额叶立体定位注射 5 滋L 氯化亚铁，造模成功后每日给予依维莫司 5 mg（kg d）-1 灌胃治疗，连续治疗 14 d。PTE 模型建立成功后每组随机选出3 只植入电极进行脑电检测。在剩余的大鼠中，每组随机选出 3 只用于蛋白表达实验，3 只用于病理学研究，剩余 1 只大鼠用于实验意外的补充。1.3.2PTE 模型的建立与给药大鼠在建模手术前及手术后 12 h 暂禁食水。将异氟烷倒入瑞沃德小动物麻醉机中，大鼠置于麻醉箱中诱导麻醉后置于立体定位仪中，将麻醉机氧气流量调至2 L min-1，并将麻醉剂量调至 3%。大鼠完全麻醉后，将大鼠鼻部固定于麻醉面罩内，确定麻醉气体管道密封，废气回收机运作良好。用立体定向仪固定大鼠头部。沿颅顶中线做 3耀4 cm 切口，暴露颅骨，用镊子持棉球蘸少许过氧化氢液，在颅骨上分离骨膜，找到前囟点。根据大鼠脑立体定位坐标，以前囟为原点，向右旁 3.0 mm、向前2.0 mm 为注射靶点，用小型记号笔标记。暂时移开定位针，用牙科钻（圆头钻头直径 1.2 mm）在标记处钻磨颅骨，钻透颅骨后，用 1 mL 注射器针头小心刺破硬膜，再用斜头微量注射器抽取氯化亚铁溶液 5 滋L（0.2 mmol L-1），垂直进针 2.0 mm，以 0.5 滋L min-1的速度缓慢注射，注射结束后停留 5 min，颅骨空缺部分用骨蜡填充，缝合皮肤后碘伏消毒。用相同方式将 5 滋L 的生理盐水注入Sham 组大鼠右侧额叶的相同位置。手术结束后，将大鼠放至平整笼中，防止大鼠误吸，清醒后可观察到造模大鼠前肢抬起和抽搐。根据 Racine标准评级，达到 3 级以上表示造模成功6，可以纳入实验统计。依维莫司组在造模成功后 24 h 内灌胃依维莫司 5 mg （kg d）-1，此后每天同一时间点给药，共给药 14 d。Sham 组和 PTE 组大鼠在同样时间点给予等体积生理盐水灌胃。1.3.3各组大鼠脑电图的监测使用异氟烷在麻醉箱中将大鼠诱导麻醉后，固定于立体定位注射仪上，腹部采用加热器保持体温，术中根据大鼠体质量及术中疼痛反应调整麻醉浓度。用碘伏棉球充分消毒头部，剪除头部毛发，充分暴露颅骨前囟点。以前囟点为原点，利用立体定位仪分别于前囟点左前上 1.5 mm、右后下 3 mm、左后下 3 mm 固定电极，所有开孔距中线 1.5 mm。将电极分别用螺丝刀植入颅骨，并用牙科水泥粘固剂固定于颅骨上，将裸露于牙科水泥外的伤口缝合，停止麻醉。采用生物医学信号采集与处理系统（BL-420N）进行脑电记录，于大鼠无癫痫发作时设置基线，并开始记录脑电活动。1.3.4癫痫持续状态的记录在诱导 PTE 后，使用 Racine（1972）量表7持续监测和评分癫痫发作，分为以下阶段：1）面部抽搐；2）头部抽搐；3）前肢抬起和抽搐，但大鼠仍能保持站立姿势；4）倒地、四肢抽搐；5）翻身、四肢僵直并伴有强烈的全身抽搐。1.3.5脑组织病理学检测取脑组织置于 4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋后切片，切片组织厚度为 5 滋m，切片置于二甲苯中脱蜡，下行梯度乙醇置换出二甲苯后蒸馏水冲洗 2 min，再分别进行 HE 染色和尼氏染色，中性树脂封片，置于显微镜下观察并采集图像。1.3.6Western blot 检测脑组织自噬蛋白及炎性相关蛋白的表达取各组大鼠前额叶区脑组织，以全蛋白提取试剂盒提取脑组织总蛋白，并采用BCA 法检测蛋白浓度，调整所提取的蛋白终浓度为 5 滋g 滋L-1，变性后，150 V 电泳 60 min 分离蛋白，300 mA 湿转 90 min，将蛋白转印至 PVDF膜，快速封闭液封闭 30 min，TBST 清洗后，一抗（Beclin-1、P62、IL-1茁、IL-4、TNF-琢、茁-actin 抗体）4 益过夜，TBST 洗 3 次后，室温孵育羊抗兔二抗 1 h，置于曝光仪显色拍照，Image J 软件分析并计算各组蛋白相对表达量。1.4统计学方法数据采用 SPSS 23.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数依标准差（x依s）表示，若数据符合正态分布，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验，重复测量数据采用重复测量方差分析。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1大鼠脑电监测造模后第 1 天，Sham 组大鼠脑电波形正常，无癫痫发作；PTE 组和依维莫司组呈现高频高幅波形，呈现癫痫发作状态。依维莫司治疗 14 d606窑窑6期后，Sham 组大鼠脑电波形态正常，无癫痫发作；PTE 组和依维莫司组脑电波脑电发作程度降低，表现为高幅波形减少，其中依维莫司组脑电波的波幅及波频低于 PTE 组，见图 1。图 1各组大鼠脑电图监测结果2.2Racine 评级大鼠癫痫发作状态PTE 模型诱导成功后，评级为 35 级，Sham 组在注射后有行动迟缓、活动减少等症状，但无癫痫发作表现。随着时间的推移 PTE 组和依维莫司组癫痫评级有降低的趋势，在第 7 天和第 14 天，依维莫司组评级均低于 PTE 组（P均约0.05），见表 1。2.3HE 染色观察大鼠组织病理损伤用 HE 染色法观察大鼠脑组织右前额叶区损伤和海马区神经元。于 10 倍镜下观察脑组织前额叶区病理变化，Sham 组大鼠脑组织前额叶区皮层组织结构正常，排列整齐，未见组织坏死，海马区神经元排列紧密，形态正常；PTE 组脑组织形态结构紊乱，神经细胞减少，见大量空泡和液化坏死；通过依维莫司治疗，大鼠脑组织神经元数量部分恢复。见图 2。第 1 天第 14 天Sham 组PTE 组依维莫司组图 2各组大鼠脑组织右前额叶区和海马区病理变化Sham 组PTE 组依维莫司组右前额叶区海马区2.4尼氏染色观察各组大鼠海马区神经元细胞变化与 Sham 组相比，PTE 组大鼠海马区神经元细胞数目减少，排列疏松紊乱，部分细胞核固缩，胞质内尼氏体减少（P0.001）；与 PTE 组相比，依维莫司组神经元细胞数目密度增加（P0.05），排列胞质内尼氏体增加。见表 2、图 3。冯岩，等.依维莫司激活自噬缓解氯化亚铁诱导创伤性癫痫细胞数目117.674.7686.509.50*99.335.00#32.0890.001组别nSham 组10PTE 组10依维莫司组10F值P值表 2各组大鼠海马区神经元细胞数目比较（xs，个）与 Sham 组相比*P0.001；与 PTE 组相比#P0.05。第 0 天第 7 天第 14 天4.170.753.670.823.000.634.000.632.500.55*2.000.63*组别nPTE 组10依维莫司组10表 1大鼠癫痫发作评分比较（xs，分）与 PTE 组比较*P0.05。607窑窑宁夏医科大学学报4缘卷图 3尼乐染色各组大鼠海马区神经元变化（伊200）2.5Western blot 检测各组大鼠脑组织中炎性因子的表达Western blot 结果显示，与 Sham 组相比，PTE组脑组织中炎性因子蛋白 IL-1茁、IL-4、TNF-琢表达均升高（P 均约0.001）；依维莫司治疗后，炎性因子 IL-1茁、IL-4、TNF-琢 蛋白表达均降低（P 均约0.05）。见图4。2.6各组大鼠脑组织自噬水平的检测Western blot 检测前额叶区脑组织中自噬蛋白表达变化的结果显示，与 Sham 组相比，PTE 组自噬蛋白 P62 增加，Beclin-1 蛋白表达降低（P均约0.0缘）；与 PTE 组相比，依维莫司组自噬蛋白P62 降低，Beclin-1 蛋白表达增加（P 均约0.05）。见图 5。3讨论在全球范围内，每年约有 240 万人被诊断患有癫痫，60%的癫痫患者大脑均有不同的病理性改变，其中 TBI 是造成脑损伤的重要因素之一8-9，Sham 组PTE 组依维莫司组A.免疫印迹条带；B.蛋白相对表达量统计图；*P0.05，*P0.01，*P0.001。图 4Western blot 检测各组大鼠前额叶脑组织中炎性因子表达的变化A.P62 免疫印迹条带图；B.P62 蛋白相对表达量统计图；C：Beclin-1 免疫印迹条带图；D.Beclin-1 蛋白相对表达量统计图；*P0.05，*P0.01，*P0.001。图 5各组大鼠自噬蛋白表达变化IL-1茁IL-4TNF-琢茁-actinTNF-琢IL-1茁IL-4Sham 组PTE 组依维莫司组1.51.00.50.0*43 kDa26 kDa31 kDa18 kDaSham 组PTE 组依维莫司组Sham 组PTE 组依维莫司组*Beclin-1茁-actinABCD*P62茁-actin432101.51.00.50.062 kDa43 kDa52 kDa43 kDaAB608窑窑6期而且癫痫发生的风险随着 TBI 的严重程度增加而增加10-11。本研究采用氯化亚铁额叶立体定位注射的方式诱导 PTE 模型，因为在创伤后脑损伤的多种致病机制中，是脑创伤后血液中的含铁血黄素对于大脑的破坏导致了癫痫的发生。含铁血黄素中铁元素导致了氧、羟自由基及过氧化氢的生成，这些物质可作用于多不饱和脂肪酸及细胞膜，造成脱氢及过氧化反应，使大量细胞膜破裂和微环境变化，从而导致了癫痫的发生12原13。此外，PTE 发生发展的特征是 TBI 诱导的持续神经炎性产生的继发性损伤，创伤性脑损伤破坏血脑屏障，使炎性因子进入大脑受损区域，趋化因子进一步募集白细胞使大量炎性因子（IL-1茁、IL-4、TNF-琢）释放，进一步加重炎性反应14。本研究中在前额叶皮层注射氯化亚铁后，大鼠出现前肢抬起和抽搐，脑电监测显示高频、高幅波形，说明PTE 大鼠模型构建成功。此外，PTE 大鼠右前额叶区脑组织表现为组织形态结构紊乱，神经细胞减少、破坏，大量空泡形成和液化坏死，海马区神经元排列稀疏紊乱，部分细胞核固缩，胞质中尼氏体减少，同时，发现炎性因子 IL-1茁、IL-4、TNF-琢表达增加。自噬是细胞降解和回收自身内部成分的细胞过程。该过程涉及自噬体形成，其能够吞噬和隔离细胞物质，例如，受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和细胞内病原体。自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，其中所形成复合物被降解并回收15，自噬通过去除细胞内不需要的物质以及其他一些有害成分维持细胞内稳态。McMahon 等16在小鼠实验中发现，通过敲除神经元基因中的Tsc1 或 Pten 基因会导致 mTOR 基因表达下降，导致细胞自噬活性降低，使其癫痫发作的可能性增高。此外，对人的结节性硬化症伴有癫痫发作患者的研究中，发现患者脑组织中自噬系统活性明显降低。Beclin-1、P62 是参与调节自噬的蛋白。Beclin-1 是一种编码蛋白质，它参与调控自噬系统的活性，是自噬发生的起始蛋白之一17。而 P62 蛋白是一种与磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）信号通路相关的蛋白质，它参与调控细胞内废弃物的降解，同样是一种自噬蛋白，当自噬活性增高时，P62 蛋白不断参与自噬，其在组织中的含量会降低18。P62 能够与 Beclin-1 结合并促进 Beclin-1 复合物的形成，促进自噬体形成，自噬体与溶酶体结合降解废弃物，同时 P62 也被降解19-20。本研究发现，在氯化亚铁诱导 PTE 大鼠脑组织中自噬蛋白 Beclin-1 降低、P62 表达增加，说明PTE 大鼠脑组织中自噬降低。目前，抗癫痫药物的治病机制通常是通过与跨膜离子通道相互作用使神经元兴奋性降低，从而抑制并减少癫痫的发作21，根据前面的阐述，PTE 的发病机制之一是自噬失活，因此，增加自噬可能是治疗 PTE 的方法。依维莫司不仅是一种免疫抑制剂，它还可以通过抑制 mTOR 蛋白活性促进自噬22。已有研究23表明其可以用于辅助治疗结节硬化症相关癫痫发作。本项研究中发现，依维莫司治疗 PTE 大鼠后，缓解了脑组织海马区和前额叶区组织病理损伤，减少了神经元细胞死亡，脑组织自噬蛋白 Beclin-1 增加、P62 蛋白降低，并降低了炎性因子 IL-1茁、IL-4、TNF-琢 的表达。综上所述，依维莫司可以减轻 PTE 大鼠脑组织损伤，减少神经元死亡，降低脑组织炎性因子水平，提升脑组织自噬蛋白表达，从而改善 PTE大鼠癫痫状态，提示依维莫司具有治疗 PTE 的潜在作用，其机制可能与促进自噬、降低炎性因子水平有关。参考文献：1 Fordington S，Manford M.A review of seizures andepilepsy following traumatic brain injury J.Journal ofNeurology，2020，267（10）：3105-3111.2 Wang J，Chai XY，Zhang F.The role of decreased levelsof neuronal autophagy in increased susceptibility topost-traumatic epilepsy J.Neurochemical Research，2022，48（3）：909-919.猿 Barranco C.Osteoarthritis：Activate autophagy to preventcartilage degeneration？J.Nature Reviews 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d）-1and was administered by intragastric administration，and the PTE group and the Sham group610窑窑6期Progesterone Affects Oocyte Development Through cAMP/PKA SignalingPathway in Granulosa CellsSHEN Ya nan1，JI Guiyi1，WANG Jinfang2，HU Rong3（1.College of Clinical Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；2.Department ofObstetric，the General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；3.ReproductiveMedicine Center，the General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo explore the molecular mechanism of progesterone affecting oocyte development ingranulosa cells.MethodsHuman ovarian granulosa cell line（KGN）were treated with different concentrations ofP4（0，1 000，2 000，3 000 ngmL-1）expression of follicle stimulating hormone receptor（FSHR）and stemcell factor（SCF）was detected by RT-PCR and Western blot.KGN cells were treated with rFSH，H-89，forskolin，forskolin+H-89，P4+H-89 and P4，respectively.The expression of SCF mRNA and protein was detect-ed by RT-PCR and Western blot.The cell viability treated with different concentrations of P4 was detected byCCK8 assay.Western blot was used to detect the expression of Caspase3，Bcl-2，and Bax-related apoptotic pro-teins after different concentrations of P4 treatment.ResultsThe relative expression levels of FSHR and SCFgenes and proteins decreased after treatment with different concentrations of P4（0，1 000，2 000，3 000 ng mL-1）（P all0.05）.After KGN cells were treated with rFSH，H-89，forskolin，forskolin+H-89，P4+H-89 and P4，re-spectively，P4 down-regulated forskolin-induced SCF expression.P4 inhibited the cell viability of KGN cells andpromoted the expression of Caspase3，Bcl-2，and Bax-related apoptotic proteins.ConclusionP4 affects the ex-pression of SCF in granulosa cells through cAMP/PKA pathway，inhibits cell survival and promotes apoptosis.Key words：progesterone；follicle stimulating hormone receptor；oocytewere given intragastric administration of equal volume of normal saline every day.The changes in EEG of rats ineach group were monitored，and the seizures were scored by Racine.The rats were sacrificed 2 weeks later.Hematoxylin（HE）staining was used to detect pathological changes in the prefrontal cortex and hippocampus ofbrain tissue，Nissl staining was used to detect changes in neurons in the hippocampus，and Western blot wasused to detect inflammation（IL-1，IL-4，TNF-）and autophagy related proteins（Beclin-1，P62）.ResultsCompared with the sham group，the EEG in the PTE group showed a high-point waveform，and the pathologicalmorphology of the brain tissue and neuron damage were aggravated.Nissl staining showed that the neurons andNissl bodies in the hippocampus area decreased，and the inflammatory factors IL-1，IL-4 and TNF-in-creased.And serum autophagy protein Beclin-1 decreased，P62 increased（P all0.05）.Compared with the PTEgroup，the pathological damage of brain tissue in the everolimus group was alleviated，Nissl staining showed in-creased neurons and Nissl bodies，inflammatory factors IL-1，IL-4，TNF-decreased，autophagy proteinBeclin-1 increased，P62 decreased（P all0.05）.ConclusionEverolimus can significantly improve brain tis-sue damage and restore neurons in PTE rats，and the mechanism may be related to promoting autophagy and re-ducing inflamm