血管结构异常的先天性心脏病患儿中Vav2基因突变的筛查和功能分析.pdf

基金项目：国家自然科学基金（，）；上海市自然科学基金（）通信作者：于昱，：论著血管结构异常的先天性心脏病患儿中 基因突变的筛查和功能分析陈颖慧冯奕源冯炜琦吴逸卓鲁亚南于昱（上海交通大学医学院附属新华医院心血管发育与再生医学研究所，上海 ；上海交通大学医学院附属新华医院核医学科，上海 ；上海交通大学医学院附属新华医院儿心脏中心，上海 ）【摘要】目的通过全外显子组测序筛查血管结构异常类先天性心脏病（）致病候选基因 的新发突变 ：，探究 及其新发罕见突变对内皮细胞功能的影响，探索 发生的可能分子机制。方法分析 例血管结构异常类 患儿及 例正常儿童的外周血全外显子组测序数据筛查 突变。构建 野生型及突变型表达质粒，转染人脐静脉内皮细胞（），通过 和 检测 、下游 和蛋白的表达水平；通过 、划痕试验和成管实验检测 及突变对 增殖、迁移和成管能力的影响。结果在血管结构异常类 患儿中发现的 罕见突变 ：，在对照组中未出现且从未被报道。与野生型对比，突变能降低 蛋白表达，、划痕试验和成管实验发现该突变影响 促进 增殖、迁移和成管等血管生成相关的功能，但该突变不影响下游 本底 和蛋白表达。结论 的错义突变影响 蛋白表达，进而损害 在 中促进增殖、迁移和成管等血管生成相关的功能，可能是影响下游 激活而非本底表达导致的。是血管发育过程的关键分子，可能参与调控血管结构异常类 发生，突变导致 功能受损，进一步提供了 在血管结构异常类 中可能的致病分子机制。【关键词】血管发育；血管结构异常；先天性心脏病；错义突变；人脐静脉内皮细胞【】，（，；，；，）【】：，（）（），：，【】；心血管病学进展 年 月第 卷第 期 ，先天性心脏病（，）是人类最常见的出生缺陷 ，每 例新生儿中出现 例 ，其中约 属于危重 ，需在婴儿期干预，否则易导致急性死亡 。包括胎儿发育过程中发生的心脏和大血管结构异常 ，其中新生儿血管解剖结构较为复杂，诊断难度高，易发生误诊或漏诊。血管结构异常的 常导致无法供给全身足够的氧合血液，临床表现为症状迅速进展的致命发绀型，常伴呼吸衰竭和心力衰竭，需早期手术治疗，部分疾病如不接受适当的干预，患者在出生后第一年的死亡率接近 ，例如完全性肺静脉异位连接（，）、法洛四联症中的主动脉骑跨、大动脉转位（，）以及窗型动脉导管未闭（，）。中大血管结构异常的胚胎学发生机制一直是不断探索的主题，但由于大多数 呈散发性，死亡率极高，以往的研究主要是基于散发病例进行生物信息学分析筛选致病候选基因，例如，等 通过遗传连锁分析发现人类染色体 上的位点参与 ，主要包括血管内皮生长因子受体 和血小板衍生生长因子受体 的位点；通过对 个独立 患病家庭的全外显子组测序（，）鉴定出 的新发突变 ：参与法洛四联症中血管缺陷 。但是，往往由多基因导致，病因复杂，小样本测序数据只能解释个体 发病的部分机制。大样本测序的全面基因组数据能为 的预防、诊断和机制探索提供重要的数据支持，但由于某些大血管结构异常发病率低和早期致死率高，样本收集困难，血管结构异常 相关高通量测序的研究报道非常少。在之前的研究 中，本课题组收集了 例散发 以及 例健康儿童外周血行 ，报道了 高度相关的致病基因 ；同时，在 例 患者和 例健康人外周血 数据中，筛选出 可能与 发病高度相关 ，上述基于基因拷贝数变异的分析结果提示 可能是血管发育的关键调控因子。是 家族的第二个成员，是一种鸟嘌呤 核 苷 酸 交 换 因 子，通 过 结 合 鸟 苷 三 磷 酸（，）激活 酶家族。在一些物种中，家族成员的蛋白表达随着系统发育而变化 ，提示 家族可能参与胚胎发育，其中 常表达于高度血管化的器官，例如心脏和胎盘。研究 报道，和 在内皮细胞中共同作用，调节肝配蛋白 诱导的体内和体外血管生成；此外，被 广 泛 报 道 为 肿 瘤 中 的 促 血 管 生 成 因子 ，与血管生成高度相关。脉管系统早期发育依赖三个过程：血管发生、血管生成以及动脉生成，血管内皮细胞的迁移和增殖在这些过程中起着重要作用。既往研究 报道，内皮细胞形成的咽中部内皮链，是肺总静脉的前体，其排列错位会导致 ；此外，多能干细胞诱导的内皮细胞被报道可作为研究 的重要细胞模型 ，这些研究提示内皮细胞在此类大血管结构异常疾病发生机制中的重要作用。此前研究 报道，可作为血管内皮生长因子的下游，选择性激活 介导内皮细胞迁移和屏障功能；糖尿病条件下，激活 促进 氧化酶的全酶组装加速毛细血管细胞凋亡 ，在不同条件下的不同作用，提示 在内皮细胞中的重要功能。尽管目前尚无关于 影响心血管发育的详细分子机制报道，但关于 调控内皮细胞功能参与血管新生的研究以及本课题组的测序数据，均提示 在心血管发育中可能存在重要作用。为进一步研究 与血管发育的详细关系，本课题组汇总血管发育异常疾病的 数据，从遗传变异角度出发，通过 负 荷 分 析 和 单 核 苷 酸 多 态 性（，）关联分析等生物信息学处理，在血管结构异常的 患者中筛选得到候选基因 的高度致病突变 ：。本研究主要根据 获得的生物信息，进一步研究 新发突变在人脐静脉内皮细胞（，）中的功能，并探讨其对可能调控的下游靶基因的影响，为血管结构异常类 发病遗传分子机制提供理论依据。研究对象与方法 研究对象在上海交通大学医学院附属新华医院收集确诊的血管结构发育异常患儿血液标本 例，同时收集 例与病例组年龄和性别相匹配的健康儿童血液作为对照。该研究按照 赫尔辛基宣言 进行，已获得上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会的批准，样本采集均获得了受试者父母或监护人的书面知情同意。方法 生物信息学分析使用 鉴定 数据中 非同义突变（，），心血管病学进展 年 月第 卷第 期 ，通过参考人群基因组常见数据库 和 ，筛选最小等位基因频 率 的 罕 见 突 变，通 过 、以及 等数据库评估筛选出致病可能性高的 突变位点。测序法验证入选病例及对照样本 序列。质粒构建 过表达质粒和阴性对照购于吉凯基因生物公司；以野生型质粒为模板，设计突变引物，用 （）酶对模板进行定点突变，得到突变质粒 ，突变质粒经过 测序确认。细胞培养与转染 购于美国模式培养物研究所，使用含有 胎牛血清（）和 青霉素 链霉素混合液（）的高糖培养基（）在、培养箱中培养。接种于 孔板，待细胞融合度为 时，使用 （）转染空载、野生型质粒、突变质粒（）用于后续试验。质粒转染 后，根据说明书使用 提取 。使用 （）将 逆转录为互补 链，通过 （）体系进行 扩增。以 作为内参，法对 表达量进行相对定量。引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表 。表 引物序列 （）（）（）注：，正向引物；，反向引物；，。质粒转染 后，用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解液收集 蛋白，浓度测定后，高温变性蛋白。取 蛋白样本进行 电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜（），经过 牛血清白蛋白（）室温封闭 ，在 下与一抗 （）、（）、（）或 （）孵育过夜。第 天用过氧化物酶标记山羊抗小鼠 （）二抗（）室温孵育 后，经过化学发光试剂盒（雅酶）显影蛋白。细胞增殖检测质粒转染 后，按照 个 孔将 接种于 孔板，于培养后的 、和 去除培养基，加入 溶液（碧云天），在 ，孵育 后测定 评价细胞活力。划痕试验质粒转染 后，待 密度接近 ，用 无菌枪头垂直于孔板制造细胞划痕，磷酸盐缓冲液清洗后，加入培养基，镜下观察并拍照记录（），放回培养箱继续培养，于 和 后分别镜下观察并拍照记录，以划痕愈合率（）评价迁移能力。成管实验预 冷 孔 板，每 孔 加 入 的 基 质 胶（）凝固后，每孔加入 细胞悬液，细胞总数为 个，后镜下拍照记录，以成管交点和形成小管直径评价成管能力。统计学方法所有数值均以平均值 平均值的标准误差表示，每组实验至少独立地重复三次。使用 进行统计学检验，组间单一协变量间比较采用单因素方差分析，为差异有统计学意义。结果 测序结果和突变保守性分析 测序结果显示入选病例的第 外显子区 导致第 位氨基酸从脯氨酸变成亮氨酸，该杂合突变位点在正常对照组中未发现（图 ），且入选病例父母否认家族性 病史。跨物种蛋白序列比对显示，该突变位点在脊椎动物中高度保守（图 ），提 示 该 突 变 可 能 导 致 的 功 能 改 变。网站预测该突变位点具有高度致病性；评分为 ，数值越小，提示引起蛋白质功能改变的可能性越大；其中，评分为 ，进一步提示该突变可能影响 蛋白功能，该突变具体信息详见表 。突变对 和蛋白表达的影响质粒转染 后，野生型 、突变 转染组间 表达量无明显差异（图 ）。但与野生型相比，该突变的蛋白表达量降低（图 、图 ），表明这个错义突变影响 蛋白表达。野生型 和 突变对 增殖能力的影响通过 检测野生型 及突变 对心血管病学进展 年 月第 卷第 期 ，增殖能力的影响，与空载组相比，野生型 转染组 在 、和 增殖率明显升高（）；突变 转染组在 、及 不影响 增殖（图 ）。?注：图 为对照组和病例组的 测序峰图，黑色箭头指示突变位点；图 为 突变在不同物种中的蛋白序列保守性分析；表示该氨基酸在不同物种间高度保守。图 对照组和病例组 测序峰图及 突变位点保守性分析表 突变的具体信息性别年龄疾病类型突变位置核苷酸变化氨基酸变化致病性预测 女性岁 致病 ；?注：图 为 质粒转染后 的 表达，作为内参；图 为 质粒转染后标签蛋白表达，作为内参；图 为 质粒转染后 蛋白表达。表示和空载组相比，；表示和空载组相比，；表示和野生型 组相比，；表示和野生型 组相比，；表示无显著性差异。图 质粒转染 后 的 和蛋白表达心血管病学进展 年 月第 卷第 期 ，?注：表示和空载组相比，；表示和野生型 组相比，；表示和野生型 组相比，；表示无显著性差异。图 质粒转染后 活力检测结果 野生型 和 突变对 迁移和成管能力的影响质粒转染 后，划痕试验结果提示，野生型 转染后能促进 在 内的划痕愈合（上调约 ，），而 突变转染组不影响 迁移能力（图 ）。一致的是，与空载组相比，野生型 转染 后，可促进 成管能力（上调约 ，）；与野生型 转染组相比，突变转染 减弱了 诱导的 成管能力（图 ）。?注：图 为 划痕试验 、和 代表性图片；图 为 成管实验 代表性图片。表示和空载组相比，；表示和野生型 组相比，；表示无显著性差异。刻度尺 ；。图 质粒转染后划痕愈合和成管实验心血管病学进展 年 月第 卷第 期 ，过表达对下游 和蛋白表达的影响 和 结果提示野生型 、突变 转染 后并不影响 本底表达（图 、图 ），与文献报道一致，提示 可能调控下游 结合 激活而非本底表达。通过对 蛋白结构进一步分析，突变位于 催化 结构域，这决定了 催化下游 酶家族激活（图 ），提示 突变可能是通过影响 催化下游 激活进而影响 在 发挥功能，需进一步检测 活性形式揭示该突变对下游的影响。?注：图 为质粒转染 后 的 表达；图 为质粒转染 后 的蛋白表达；图 为 蛋白结构域。表示突变位点，表示无显著性差异。图 质粒转染后下游 和蛋白表达 讨论 作为一类严重的先天畸形，妊娠期会导致流产、死产和新生儿死亡等，对于存活患儿，身高、体重及智力发育会滞后于同龄健康儿童，是影响儿童身心健康的重大公共卫生事件。大血管结构异常的 进展快速、临床症状严重，例如，和 缺乏足够的氧合血液的供应，患儿出生后如不给予及时治疗将无法存活。但新生儿血管解剖结构复杂，不易辨认，误诊或漏诊率高，延误治疗时机。由于此类疾病低发病率和高致死率，样本收集困难，动物模型少，目前关于大血管结构异常 发生的分子机制仍不清楚。是由环境和遗传因素共同作用，具有不完全外显率和可变的表达特性，遗传学相关研究能帮助探究此类 发病的分子机制且有助于临床对此类疾病的产前诊断和早期发现。前期研究中 例血管结构发育异常患者的 结果提示 与此类血管结构异常的 高度相关 。在本研究中，通过生物信息学手段处理前述 的数据，筛选出 未曾被报道的新发罕见突变 ：，拟从遗传变异角度进一步厘清 在血管发育中的重要功能。在线预测提示这个突变位点为高度“致病性”位点，且该位点在人类、猕猴、褐家鼠等脊椎动物上高度保守，提示这个突变可能引起重要的功能改变。和 实验结果表明，突变不影响 表达，但蛋白的表达量较野生型有下调，转录和翻译的差异提示这个位点引起的单个氨基酸改变可能会影响 蛋白结构的稳定性。在哺乳动物胚胎发育过程中，内皮细胞在构建组织化的血管网络中起着至关重要的作用。因此，笔者在 中进一步探究 罕见新发突变 的功能。实验结果提示，能促进 增殖、迁移以及成管，具有促进血管生成的作用；而 突变能改变 在内皮细胞中促进 增殖、迁移和成管的积极功能，笔者的研究结果提示 可能是胚胎发育过程中参与血管发育的重要分子，该突变可能是血管结构异常的 发病的分子机制之一。作为一类鸟嘌呤核苷酸交换因子，通过结合 激活 酶家族（主要包括 、和 ），这些成员在 结合的活性形式下能参与调节细胞内重要生物学功能，包括细胞生长和蛋白激酶激活等 。作为 广泛报道的下游，往往与 相互作用后，通过促进 结合 形成 活性形式发挥功能，进而调控内皮细胞、肿瘤细胞的迁移 。但是，是否通过激活 影响内皮细胞功能进而调节 发生尚不清楚。以及 实验结果提示，野生型 以及突变 过表达均不会影响 的本底表达，结合之前的研究结果，更可能是通过催化 与 结合发挥作用。通过对 蛋白结构进一步分心血管病学进展 年 月第 卷第 期 ，析，突变位于 催化下游 酶家族与 结合的 结构域，突变极有可能是通过影响 催化下游 激活进而影响 在 发挥功能，需进一步检测下游 活性形式来研究该突变对下游的影响。综上所述，本研究发现 错义突变 ：能改变 蛋白序列，影响 蛋白表达，改变 促进 增殖、迁移和成管的能力，此突变可能是通过改变 蛋白结构进而影响下游 激活而非本底表达导致 的功能改变。在 中的功能提示 对血管发育可能至关重要，突变对 功能的影响可能会导致心血管发育的异常，进而导致血管结构异常的 发生，但其具体机制有待进一步研究。本研究为血管结构异常的 发生机制以及临床早期诊断提供进一步理论依据。参 考 文 献 ，：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：收稿日期：檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾 欢迎投稿欢迎订阅心血管病学进展 年 月第 卷第 期 ，