SN∕T 5406-2021 进口食用植物油中转基因成分检测方法(出入境检验检疫).pdf

I C S6 7.0 5 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 0 62 0 2 1进口食用植物油中转基因成分检测方法D e t e c t i o no fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dc o m p o n e n t s i ne d i b l ev e g e t a b l eo i l f o r i m p o r t( 报批稿)2 0 2 1 - 1 1 - 2 2发布2 0 2 2 - 0 6 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T1.12 0 2 0和G B/T2 0 0 0 1.42 0 1 5给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位: 中华人民共和国广州海关、 中华人民共和国南京海关、 中华人民共和国天津海关、中华人民共和国青岛海关、 中华人民共和国上海海关、 中华人民共和国深圳海关。本文件主要起草人: 董洁、 刘津、 王毅谦、 梁颖婕、 王仲敏、 孙敏、 李想、 潘广、 龙云凤、 贺艳、 高宏伟、尹璐、 高东微、 李荀、 陈文锐。S N/T5 4 0 62 0 2 1进口食用植物油中转基因成分检测方法1 范围本文件规定了进口食用植物油中转基因成分的定性检测方法。本文件适用于初榨大豆油、 菜籽油、 玉米油和棉籽油中转基因成分实时荧光P C R定性检测。其他类型的食用植物油可以参照执行。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。G B/T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T1 9 4 9 5.2 转基因产品检测 实验室技术要求G B/T2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检验3 术语、 定义和缩略语3.1 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。a d h C: 乙醇脱氢酶C基因(a l c o h o ld e h y d r o g e n a s eCg e n e)b a r: 磷化麦黄酮乙酰转移酶基因(p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s eg e n e)C P 4 - E P S P S: 根癌农杆菌C P 4蛋白基因和5 -莽草酸- 3 -磷酸合成酶基因(A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i nC P 4P r o d u c t:h e r b i c i d e t o l e r a n t f o r mo f 5 - e n o l p y r u v u l s h i k i m a t e - 3 - p h o s p h a t e s y n t h a s e)C r u A: 十字花科种子储藏蛋白基因(C r u c i f e r i nAg e n e)GO X: 草甘膦氧化还原酶基因(g l y p h o s a t eo x i d o r e d u c t a s eg e n e)h m g A: 高移动性蛋白家族基因A(h i g h - m o b i l i t y - g r o u pg e n eA)n p t I I: 新霉素- 3-磷酸转移酶基因(n e o m y c i n - 3 - p h o s p h o t r a n s f e r a s eg e n e)p C a MV 3 5 S: 花椰菜花叶病毒3 5 S启动子(3 5 Sp r o m o t e r f r o mc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s)p FMV 3 5 S: 玄参花叶病毒3 5 S启动子(3 5 Sp r o m o t e r f r o mam o d i f i e df i g w o r tm o s a i cv i r u s)t E 9: 源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因终止子(t e r m i n a t o ro f r i b u l o s e - 1,5 - b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l -a s eE 9g e n e f r o mp e a)t NO S: 源于 农 杆 菌 的 胭 脂 碱 合 成 酶 基 因 终 止 子 (t e r m i n a t o ro fn o p a l i n es y n t h a s eg e n ef r o mA g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n)1S N/T5 4 0 62 0 2 14 方法提要采用特异性的方法对食用植物油中基因组D NA进行富集、 提取和纯化, 使用脂溶性载体上的D NA亲和配体特异性结合食用植物油中残留D NA, 并形成配体- D NA复合物, 该复合物被吸附柱内吸附膜上的亲和配基捕捉, 利用工具酶A切除脂溶性载体并释放富集的D NA, 经释放的D NA经微量离心柱浓缩和纯化; 采用实时荧光P C R技术扩增食用植物油中基因组D NA特异性的内源基因和外源基因片段, 并根据检测结果判断样品的核酸中是否含有转基因成分。5 试剂和材料除另有规定外, 实验用水应符合G B/T6 6 8 2中一级水的规格, 所有试剂均为分析纯或生化试剂。5.1 异丙醇。5.2 无水乙醇。5.3 食用植物油D NA提取试剂1): 见附录A。1) 重鼎Z D - T G - 3 9 - 1 5食用植物油D NA提取试剂盒是适合的市售产品实例。给出这一信息是为了方便本文件的使用者。如果采用其他产品提取食用植物油中植物基因组D NA, 经本文件规定的荧光P C R检测可以得到相同或更好的检测效果, 经实验评估后可以使用这些等效产品。5.4 T a q M a n实时荧光P C R预混液:T a qD NA聚合酶、P C R反应缓冲液、 氯化镁、d NT P s( 含d AT P、d UT P、d C T P、d G T P) ) 和UNG酶按比例配制的溶液。5.5 引物和探针: 按照表1选择靶标基因, 靶标基因的引物探针序列见附录B。表1 进口食用植物油转基因成分检测的靶标基因植物油种类内源基因外源基因大豆油L e c t i np C a MV 3 5 S、t NO S、C T P 2 - C P 4 - E P S P S菜籽油C r u Ap C a MV 3 5 S、p FMV 3 5 S、GOX、t E 9棉籽油a d h Cp C a MV 3 5 S、t NO S、n p t I I玉米油h m g Ap C a MV 3 5 S、t NO S、n p t I I、b a r6 仪器和耗材6.1 离心机: 离心力1 20 0 0g, 转子适配5 0mL离心管和1.5mL离心管。6.2 涡旋混匀仪。6.3 恒温干燥箱/培养箱:5 31。6.4 实时荧光P C R仪。6.5 生物安全柜。6.6 超低温冰箱:-7 01。6.7 单道移液器:2L2 0L,1 0L1 0 0L,5 0L2 0 0L,1 0 0L10 0 0L,5 0 0L50 0 0L。6.8 无菌离心管:5 0mL、1.5mL、0.5mL和0.2mL。2S N/T5 4 0 62 0 2 17 试样制备按照G B/T1 9 4 9 5.7制备的实验室样品进行试样制备。实验室样品体积10 0 0mL, 充分混匀, 移取1 0 0m L用于植物基因组D NA提取纯化。凝固或流动性较差的样品, 加热至3 54 0, 待样品全部溶解混匀后再取样。8 植物基因组D N A的提取纯化8.1 在1 0 0mL试样中加入2 0 0LD NA结合液, 涡旋混匀后分次将全部液体转移至套有5 0mL收集管的m a x i吸附柱中并以50 0 0g离心2m i n, 每次移取试样体积不超过1 5mL, 每次离心后取出m a x i吸附柱、 弃去收集管中离心过滤的油液并将m a x i吸附柱重新套回收集管。8.2 全部试样过滤完成后, 向m a x i吸附柱中加入5mL异丙醇并以50 0 0g离心5m i n。弃去收集管中的离心滤液并将m a x i吸附柱重新套回收集管。重复本步骤一次。8.3 将吸附柱套在新的5 0mL收集管中, 在5 3恒温干燥箱中敞口直立静置1 0m i n除去残余的异丙醇。8.4 按照每个试样添加溶液UT6 0 0L和工具酶A2 0L, 在1.5mL离心管中加入适量的溶液UT和工具酶A, 配制酶消化液, 并涡旋混匀后在5 3恒温干燥箱/培养箱预热3m i n。8.5 向m a x i吸附柱的膜中央位置移入预热的酶消化液, 旋紧收集管盖后直立静置孵育3 0m i n。孵育结束后以50 0 0g离心5m i n, 弃去m a x i吸附柱。8.6 将收集管中离心过滤的液体移入新的1.5mL离心管中, 加入6 0L溶液A C, 颠倒混匀, 再加入6 6 0L异丙醇, 再次颠倒混匀, 静置1 5m i n。以1 20 0 0g离心1 0m i n。8.7 小心弃去全部上清液, 向管底加入2 0 0L溶液B J, 静置5m i n后用枪头轻柔地吹打润洗管内壁离心沉淀部位数次, 涡旋混匀管内液体, 再加入1 0 0L无水乙醇涡旋混匀。8.8 将全部液体移入套有1.5mL收集管的微量离心柱中, 以1 20 0 0g离心2m i n。检查微量离心柱, 如有残余液体应增加离心时间使全部液体离心过滤。8.9 弃去收集管中离心过滤的液体并将微量离心柱重新套回收集管中, 向微量离心柱的膜中央位置移入2 0 0L溶液W 2, 以1 20 0 0g离心1m i n, 弃去收集管中离心过滤的液体。再次按照前述方法用溶液W 2洗涤过滤。再次弃去收集管中离心过滤的液体后, 以1 20 0 0g离心2m i n甩干残余的液体。8.1 0 将微量离心柱套在新的1.5mL离心管中, 向微量离心柱的膜中央位置移入2 0L溶液T E, 静置3m i n, 以1 20 0 0g离心2m i n, 得到D NA提取物。8.1 1 D NA提取物贮4备用, 有效期为1 4d。9 实时荧光P C R9.1 阴性对照、 阳性对照和空白对照的设置9.1.1 阴性对照: 内源基因的阴性对照为其他植物物种的基因组D NA, 外源基因的阴性对照为非转基因同一植物物种的基因组D NA。9.1.2 阳性对照: 含有靶标基因的植物基因组D NA或人工合成的质粒D NA。9.1.3 空白对照: 包括D NA提取时的提取空白对照( 以水代替样品) , 以及P C R反应时的试剂空白对照( 以水代替D NA模板) 。3S N/T5 4 0 62 0 2 19.2 反应体系反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行。表2 荧光P C R反应体系试剂名称工作液浓度反应体系终浓度1 0P C R缓冲液( 不含氯化镁)1 01氯化镁溶液2 5mm o l/L2.5mm o l/Ld N T P s( 含d UT P)各2.5mm o l/L各0.2mm o l/LUNG酶5U/L0.0 7 5U/LT a q酶5 U/L0.0 5U/L上游引物(F)1 0m o l/L见附录B下游引物(R)1 0m o l/L见附录B探针(P)1 0m o l/L见附录BD NA模板5L超纯水补足至2 5L 注:建议选用商品化T a q M a n实时荧光P C R预混液。9.3 反应参数反应参数为:5 02m i n; 预变性9 51 0m i n;9 51 5s,6 01m i n,4 0个循环。注:不同型号仪器的使用可参考仪器使用操作说明。9.4 仪器检测通道的选择设置P C R反应管的荧光信号收集条件, 应与探针标记的报告基团一致。具体设置方式因仪器而异, 可参照仪器使用操作说明。1 0 质量控制1 0.1 空白对照: 无特异性扩增荧光增幅现象,C t值大于等于4 0。1 0.2 阴性对照: 无特异性扩增荧光增幅现象,C t值大于等于4 0。1 0.3 阳性对照: 内源基因C t值小于或等于3 0, 外源基因C t值小于或等于3 6。1 1 检测结果判定和表述1 1.1 试样内源基因C t值小于或等于3 6, 外源基因C t值小于或等于3 6, 判定检出外源基因, 检测结果表述为“ 该样品检出基因” 。1 1.2 试样内源基因C t值小于或等于3 6, 外源基因C t值大于或等于4 0, 判定未检出外源基因, 检测结果表述为“ 该样品未检出基因” 。1 1.3 试样内源基因C t值小于或等于3 6, 外源基因C t值在3 64 0之间, 应重新进行D NA提取和实时荧光P C R。第2次检测内源基因C t值小于或等于3 6, 外源基因C t值小于4 0, 检测结果表述为“ 该样4S N/T5 4 0 62 0 2 1品检出基因” , 外源基因C t值大于或等于4 0, 检测结果表述为“ 该样品未检出基因” 。1 1.4 试样内源基因C t值大于或等于4 0, 表明不能对该样品实施有效的D NA提取和实时荧光P C R检测, 检测结果表述为“ 该样品未能有效提取基因组D NA” 。注:为油料作物物种名称。1 1.5 试样内源基因C t值在3 64 0之间, 应重新进行D NA提取和实时荧光P C R。第2次检测内源基因C t值仍大于3 6, 表明不能对该样品实施有效的D NA提取和实时荧光P C R检测, 检测结果表述为“ 该样品未能有效提取基因组D NA” 。注:为油料作物物种名称。1 2 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照G B/T2 7 4 0 3和G B/T1 9 4 9 5.2中的规定执行。1 3 P C R反应检出限各基因片段实时荧光P C R扩增的最低检出限(L O D) 为0.0 1%。5S N/T5 4 0 62 0 2 1附 录 A( 规范性)食用植物油D N A提取试剂盒A.1 试剂盒组成重鼎Z D - T G - 3 9 - 1 5食用植物油D NA提取试剂盒包括:a) m a x i吸附柱:1 5个;b) 微量离心柱:1 5个;c)5 0m L离心管:1 5个;d)1.5mL离心管:5 0个;e)D NA结合液:1.2mL/管3管;f) 工具酶A:4 0 0L/管1管;g) 溶液UT:1 2mL/瓶1瓶;h) 溶液A C:1.0mL/管1管;i)溶液B J:1.2mL/管3管;j)溶液W 2:2.0mL/瓶1瓶;k) 溶液T E:1.0mL/管1管。A.2 试剂盒保存条件溶液A C长期保存贮在28。工具酶A长期保存应分装成小份后贮在-2 0, 从-2 0取出的工具酶A使用期间短期保存贮在28, 不得反复冻融。其他组分室温避光保存。6S N/T5 4 0 62 0 2 17S N/T5 4 0 62 0 2 1基因名称基因类别正向引物大豆内源反向引物Lectin 基因探针正向引物CruA 油菜内源基因反向引物探针正向引物adhC 棉内源基冈反向引物探针正向引物hmgA 玉米内源基冈反向引物探针正向引物pCaMV35S 外i原基同反向引物探针附录B(规范性)实时荧光PCR检测引物和探针表B.1实时荧光PCR检测引物和探针序列5 -CTTTCTCGCACCAATTGACA-3 5 -TCAAACTCAACAC汉、GACGAC-35 -FAM-CCACAAACACATGCAGGTTATCTTGG-BHQl-3 5 -GGCCAGGGTTTCCGTGAT-3 5 -CCGTCGTTGT AGAACCATTGG-3 5 -FAM-AGTCCTT ATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA-BHQl-3 5 -CACA TG ACTT AGCC丁(、ATCTTTGC-3 5 -CCCACCCTTTTTTGGTTT AGC-3 5 -FAM-TGCAGGTTTTGGTGCCACTGTGAATG-TAMARA-3 5 -TTGGACTAGAAATCTCGTC汉、TGA-35 -GCT ACATAGGGAGCCTTGTCCT-3 5 -F AM-CAA TCCACACAAACGCACC汉、GTA-TAMARA-3 5 -CGACAGTGGTCCCAAAGA-3 5 -AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3 , 5 -FAM-TGGACCCCCACC丁(、ACGAGGAGCATC-BHQl-3 扩增片段长度反应体系终浓度bp nmol/L 200 102 200 200 200 101 200 200 200 73 200 200 300 79 300 160 200 110 200 100 8S N/T5 4 0 62 0 2 1表B.1实时荧光PCR检测引物和探针(续)基因名称基因类别序列扩增片段长度反应体系终浓度bp nmol/L 正向引物5 -ATCGTTCAAACATTTGGCA-3 200 l.fOS 外源基因反向引物5-ATTGC(ACTCT AATCAT A-3 1自5200 探针5 -FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQl-3 100 正向引物5 -GGG A TG ACG TT AA TTGGCTCTG-3 400 CTP2-CP4 外i原基同反向引物5 -GGCTGCTTGCACCGTGAAG-3 88 /100 EPSPS 探针5 -FAM-CACGCCGTGGAAACAGAAGACATGACC-BHQl-3 200 正向引物5 -C(AAACTTAAATTAGTGGGCATCT-3 400 pFMV35S 外源基因反向引物5 -TTTGTCTGGTCCCCACAA-3 79 400 探针5 -FAM-TGAAAGTAATCTTGTCAACATCGAGCAGCTGG-BHQl-3 200 正向引物5 -GTCTTCGTGTTGCTGG A ACCGTT -3 /100 GOX 外i原基同反向引物5 -GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT-3 121 /100 探针5 -F AM-TGCTCACTTCTCTACACTCcCTCG-BHQl-3 200 正向引物5 -TGAGAATGAACAAAAGGACCATATCA-3 200 tE9 外i原基同反向引物5 -TTTTT A TTCGGTTTTCGCT A TCG-3 87 200 探针5 -FAM-TCATTAACTCTTCTCCATCCATTTCCATTTCACAGT-BHQl-3 200 正向引物5 -AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3 200 nplII 外源基因反向引物5-GCACGAGAAGCGGTCA-3 79 200 探针5 -FAM-CACCCAGCCGGCCACAGTCG-BHQl-3 100 正向引物5 -CAAGCACGGTCAACTTCC-3 J:10 bar 外i原基同反向引物5 -GAGGTCGTCCGTCCACTC-3 175 J:10 探针5 -F AM-T ACCG AGCCGCAGG AACC-BH Q 1-3 100 12026045T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进口食用植物油中转基因成分检测方法S N/T5 4 0 62 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 0 9网址www.c u s t o m s k b .c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张 字数 千字2 0 2 1年 月第一版 2 0 2 1年 月第一次印刷印数1 *书号:1 5 5 1 7 57 6 0 定价 .0 0元