组织切片技术.doc

(一) 取材与固定
1. 取材 在熟悉动物解剖结构的基础上,根据实验目的,有选择地取得新鲜的组织和器官.取材动作要轻而迅速,所取的材料要小而薄,并立即投入生理盐水漂洗.
2. 固定 固定的目的是尽量保持组织的生前状态,防止组织变化.固定时根据实验所需选择适当的固定剂.常用的固定剂见表1.固定组织所需固定剂量至少应大于组织块容积的20倍.固定后组织具有一定的硬度,易于处理且不易变形,同时组织可显示不同的折光率,有利于染色观察.
(二)固定后的处理
凡固定剂固定过的组织均要经过冲洗或漂洗、脱水、透明或媒浸及包埋等步骤处理才能切片。
1． 漂洗 固定后用流速适中的流水冲洗，有的组织在固定后要换用酒精定时定量漂洗，以洗去固定后组织所附的固定液。
2． 脱水 选用适当的脱水剂置换组织内所含的水分，使组织块内不含水分。常用的脱水剂为：酒精、二氧陆环、丙酮、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃等。
有用脱水剂脱水时为了达到将水分逐步置换的目的，将脱水剂配成几种浓度，按浓度从低到高逐级脱水，以酒精为例，组织从70%浓度开始脱水，然后转入95%酒精及无水酒精各换2-3次。应注意脱水要适当，脱水过度会使组织变脆，脱水不足会影响后面的工序。
(三)透明或媒浸
脱水后还需借助某种有机溶剂将残存的水分完全置换，有时还需用一定量的高浓度脱水剂与该有机溶剂混合使用一次。
经石蜡包埋的组织经过这道工序呈半透明状，因此称为“透明”，而火棉胶包埋的组织未呈半透明状，称为“媒浸”。
常用的透明或媒浸剂为：苯、甲苯、二甲苯、香柏油、氯仿、丁香油、四氯化碳、石油醚、松油醇、乙醚与无水酒精等量混合配成的火棉胶媒浸液等。
(四)包埋及切片
1.石蜡包埋及切片 该法是组织学技术的常用方法,通常将透时剂中取出的组织放入1/2甲苯和1/2蜡中2h以后在纯蜡内换3次每次1h.。选用熔温为56-58℃的石蜡作包埋。
浸蜡完成后将组织制成包埋蜡块，将标签插入蜡边。
蜡块制成后进行修整，将蜡块修成方形（组织切片面朝上），或略呈梯形。组织四周留3-4mm空隙，将蜡块贴于木托上。
用旋转式切片机切片，用毛笔从蜡片带背面托起蜡片带，背面朝下放在盘中，并加盖、贴片。
将已分离的蜡片放在已涂有蛋清甘油和加数滴水的玻片上，略加热使蜡片展平、晾干。
2.火棉胶包埋切片法 组织脱水后入无水酒精24-28h，再入无水酒精-乙醚等量混合液24-28h,再经5%、10%及20%浓度的火棉胶各1周浸胶后，用最后浓度的火棉胶包埋组织块，将包埋组织块放入氯仿至火棉胶块硬化，泡于70%酒精备切片。
该包埋法的切片采用滑动式切片机，操作过程在组织块面上滴加70%酒精，切片刀凹面向上加满70%酒精，该法可切大块组织及较硬组织。
(五)染色
染色可分为活体染色和固定染色。
1． 活体染色 采用无毒性染料，通过吞噬细胞摄取染料进行染色，常用的染料为台盼蓝、台盼红或墨汁。另外活体染色还可从活体动物取出的组织成分用特异性染料染色，常用染料为美蓝坚那绿B和中性红。
2． 固定后染色 如上组织经固定、切片贴片进行染色，根据实验需要选择染液（表2）进行染色。
表1 常用固定剂配制
名称
配法
10%福尔马林液
37%-40%福尔马林液10ml,加90ml蒸馏水
福尔马林生理盐水液
37%-40%福尔马林液10ml,加氯化钠0.85-0.9g再加蒸馏水90ml
福尔马林钙溶液（用前配制）
37%-40%福尔马林液10ml,加氯化钙2g再加蒸馏水至100ml
中性缓冲福尔马林液（NBF液）
37%-40%福尔马林液10ml,加蒸馏水90ml，再加磷酸二氢钠0.4g和磷酸氢二钠0.65g
福尔马林缓冲液（Carson改变液，1973）
37%-40%福尔马林液10ml,加普通水90ml，再加磷酸二氢钠1.86g和氢氧化钠0.42g
福尔马林-溴化铵液
37%-40%福尔马林液15ml,加蒸馏水90ml，加溴化铵2g，再加蒸馏水85ml
Helly固定液
氯化汞5g，重铬酸钾2.5g,硫酸钠(Na2SO4·10H2O)1g,蒸馏水100ml,用前临时加37%-40%福尔马林液5ml.
Zenker固定液
配法同Helly,唯用前不加福尔马林液而加5ml醋酸
Susa固定液
蒸镏水80ml,37%-40%福尔马林20ml,冰醋酸4ml,三氯醋酸2g,氯化汞4.5g,氯化钠0.5g
Bouin固定液
苦味酸饱和水溶液75ml,37%-40%福尔马林25ml,冰醋酸5ml
Gendre固定液
苦味酸95%酒精饱和液80ml,37%-40%福尔马林15ml,冰醋酸5ml
Rossman固定液
苦味酸无水酒精液90ml(4.9g苦味酸加无水酒精100ml),中性浓福尔马林(约40%)10ml
Muller液
重铬酸钾2.5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml
Regaud液(Moller)
3%重铬酸钾80ml,临用时加40%福尔马林液20ml
Orth液
重铬酸钾2.5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml,临用时加37%-40%福尔马林10ml
Barcroft
5%重铬酸钾水溶液60ml,1mol/L醋酸钠10ml,40%甲醛溶液12ml,蒸馏水18ml
Carnoy固定液
无水酒精60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml(临用前配)
Carnoy-Lebrun液
无水酒精15ml,氯仿15ml,冰醋酸15ml,氯化汞4g(临用前配)
Flemming强固定液(Lillie)
2%饿酸水溶液20ml,1%铬酸75ml,冰醋酸5ml(临用时配)
Altmann固定液
2%饿酸水溶液10ml,5%重铬酸钾水溶液10ml(两液临用时混合)
1%饿酸-0.12mol磷酸缓冲葡萄糖液(Millonig,1962)
贮存液A: 2.26%NaH2PO4·2H2O
B: 2.52%NaOH
C: 5.4%葡萄糖
将A液41.5ml与B液8.5ml混合后调至PH7.3-7.4,取A、B混合液45ml加C液5ml,最后加0.5g饿酸
戊二醛固定剂（光镜用）
25%戊二醛水溶液10ml，0.06mol/L磷酸钠缓冲液(PH7.2-7.4)加至100ml
常用染液
名称
配制
Delafield苏木精液
苏木精4g,无水或95%酒精25ml,待溶后加10%铵矾水溶液400ml,摇匀后过滤,再加甘油及甲醇或95%酒精各100ml,暴露于空气中3-4个月
Ehrlich苏木精液
苏木精2g,95%酒精100ml溶后加蒸馏水及甘油各100ml,摇匀加钾钒3g和冰醋酸10ml,暴露于空气中2周,染色后20min略水洗,需经1%盐酸分色
Harris苏木精液
苏木精1g,无水酒精10ml,铵矾或钾矾20g,蒸馏水200ml,氧化汞0.5g,冰醋酸8.0ml
Mayer苏木精液
苏木精1g,钾矾或铵矾50g,碘酸钠0.2g,蒸馏水1000ml,水合氯醛50g,枸橼酸1g
Hansen苏木精
A液:铬矾10g,蒸馏水250ml,煮沸全溶后,冷后备用;
B液:苏木精1g,蒸馏水15ml,略加热至苏木精全溶;
C液:10%硫酸水溶液5ml;
D液:重铬酸钾0.55g,蒸馏水20ml.
将B液加入A液,充分摇匀后加入C液,最后加入D液,加热至煮沸,上述各液混匀后待冷,过滤使用
Carazzi苏木精液
苏木精0.5-1g,甘油100ml,钾矾25g,蒸馏水400ml,碘酸钾0.1g
磷钨酸苏木精液
苏木精0.5g,磷钨酸5.0g,蒸馏水500ml
Weigert氯化铁苏木精
苏木精1g,95%或无水酒精100ml,30%氯化铁水溶液4ml,蒸馏水95ml,浓盐酸1ml,使用时将二液等量混匀
Grenacher硼砂卡红液
卡红2g,硼砂4g,蒸馏水100ml,混合后加温溶解,冷后过滤,再加70%酒精100ml,切片染5-10min,用盐酸酒精分色
Mayer矾卡红液
卡红酸1g,铵矾或钾矾10g,蒸馏水200ml,加热使上列各成分溶解,冷后加水杨酸0.2g
Coffler碱性美蓝
95%酒精美蓝饱和液(约0.2)30ml,0.01%氢氧化钠水溶液100ml,置361个月
Pappenhein甲基绿染液
甲基绿1g,蒸馏水100ml,无水酒精25ml
伊红
一般选伊红B或伊红Y配成0.5%-1%水溶液或酒精溶液,在染蓝色核后,红伊红复染,用95%酒精分色