DNA重组技术的基本步骤(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2 基因工程的基本操作程序,1,目的基因的检测与鉴定,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤,2,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,3,RNA聚合酶,:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,4,不能转录为信使RNA，不能,编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞 基因结构,有调控遗传信息表达的核,苷酸序列.包括启动子和终止子,5,2.真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,转录,mRNA前体,加工,翻译,肽链,启动子,终止子,成熟mRNA,能够编码蛋白质的序列。,不能够编码蛋白质的序列。,外显子:,内含子:,6,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，,包括位于编码区上游的RNA,聚合酶结合位点（启动子）。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,7,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,8,阅读与思考,1、什么是目的基因？,2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？,请阅读P9第一和二两段,9,1、目的基因概念：,主要指的是,编码蛋白质的结构基因。,也可以是一些具有调控作用的因子。,2、目的基因获取方法：,、,从,基因文库,中获取目的基因,、,利用,PCR技术,扩增目的基因,、,化学方法直接,人工合成,一、目的基因的获取,10,、从,基因文库,中获取目的基因,基因文库,基因组文库,部分基因文库,11,基因文库的构建过程,限制酶,拼接到载体上,导入受体细胞扩增,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到,受体菌的群体,中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。,基因组文库,12,cDNA文库的构建-,反转录法：,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA,(目的基因),基因文库的构建过程,13,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,14,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,15,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,16,如何从基因文库中找到所需要的基因？,依据-目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因翻译产物蛋白质等特性。,17,构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的,A、染色体DNA B、线粒体DNA,C、总mRNA D、tRNA,目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是,A、某生物的全套基因就是一个基因文库,B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库,C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库,D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,18,、,利用,PCR技术,扩增目的基因,PCR的全称：,聚合酶链式反应,PCR的原理：,DNA复制,PCR技术扩增目的基因的前提条件：,要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。,选修3、P58,19,模板,原料,引物,酶,控制温度,利用,PCR技术,扩增目的基因,目的基因DNA,四种脱氧核苷酸,如单链DNA分子片段，使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,PCR仪自动调控,PCR的条件：,20,21,过程：,a、DNA变性,（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火,（,复性,55-65）：系统温度降低，,引物,与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在,Taq酶,的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.,重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,22,加热至,95,摄氏度的目的是使,DNA,中的,断裂，这一过程在细胞内是通过,的作用来完成的。,当温度降低时，引物与模板末端结合，在,DNA,聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成,2,个,DNA,分子，此过程中的原料,是,，遵循的原则是,。,Taq,酶的特点是（）,A.,耐强酸,B.,耐强碱,C.,耐高温,D.,最适温度,37,摄氏度,4.,请指出,PCR,技术与,DNA,复制过程的区别,解旋酶,C,脱氧核苷酸,碱基互补配对原则,23,DNA复制,PCR技术,场所,原理,条件,解旋方式,酶,特点,结果,PCR,技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、,边解旋变复制,半保留复制、,全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,24,用化学方法直接,人工合成,条件：,基因,较小,，核苷酸序列,已知,。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,化学法合成的目的基因含,内含子、启动子和终止子,吗？,25,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,人工合成法（,真核生物,）,推测,推测,单链DNA,合成,26,2、下列属于获取目的基因的方法的是(),利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取,从受体细胞中提取 利用PCR技术,利用DNA转录 人工合成,A.B.C.D.,1,在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A、化学合成法 B、基因组文库法,C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,27,3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540,B.8100 C.17280 D.7560,28,4、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是,双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温,A B,C D,D,5、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是,从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成,A B C D,D,29,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。,（2）用,_ _,切断目的基因，使其产生_,_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组,DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,二、基因表达载体的构建核心,30,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,31,2、基因表达载体的组成,目的基因,启动子:,终止子:,标记基因等,一段有特殊结构的,DNA片段,。,位于基因的首端。,一段有特殊结构的,DNA片段,。,位于基因的尾端。,32,启动子的作用：,终止子作用：,使转录在所需要的地方停止,。,标记基因作用：,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。,是,RNA聚合酶识别和结合的部位,，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,33,3、基因表达载体的构建目的：,a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。,b.使目的基因能够表达和发挥作用。,思考：,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,34,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；,（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,35,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,注意,36,目的基因与运载体结合所需的条件有,同一种限制酶 具有抗性基因的质粒,RNA聚合酶 目的基因,DNA连接酶 四种脱氧核苷酸,ATP,A B,C D,（多选）一个基因表达载体的构建应包括,A目的基因 B启动子,C终止子 D标记基因,ABCD,D,37,下列关于基因表达载体的叙述不正确的是,A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码,B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用,C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选,D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,38,1、什么是转化？,2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？,3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？,4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？,三、目的基因导入受体细胞,39,转化,目的基因,进入,受体细胞内，并且在受体细胞内,维持稳定和表达,的过程。,三、目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌,真核生物：酵母菌和动植物细胞,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,40,1.目的基因导入植物细胞,常用的方法:,农杆菌转化法,、基因枪法、花粉管通道法,农杆菌的特点:,c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,b.具有趋化性。,a.易感染双子叶植物和祼子植物。,41,（1）、农杆菌转化法,42,整合,到染色体上,转移,至受体细胞,43,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物(如小麦），从理论上说，你认为应该怎么做？,P15-2,思考与探究,因为单子叶植物不能分泌出大量的酚类化合物来吸引农杆菌，向单子叶植物的伤口处喷洒酚类化合物，使用基因枪法及花粉管道法。,44,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,1、常用于单子叶植物的转化方法,2、特点：成本高,45,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,46,.目的基因导入动物细胞,常用的方法:,显微注射技术,操作程序：,a.先提纯含目的基因的表达载体,b.从雌性动物体内取出卵（受精卵）,c.显微注射仪进行显微注射,d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体,47,常用法：,Ca,2+,处理,常用菌：,大肠杆菌,3.目的基因导入微生物细胞,原核生物的特点:,繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。,48,大肠杆菌的转化过程:,用Ca,2+,处理细胞,感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子。,增加细胞壁的透性，与细胞膜无关,49,将目的基因导入受体细胞,1.,将目的基因导入植物细胞,转化,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.,将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.,将目的基因导入微生物细胞,Ca,2+,处理,50,植物基因工程,动物基因工程,微生物基因工程,常用方法,受体细胞,比较目的基因导入不同细胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca,2+,处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,51,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是,A结构简单、操作方便 B繁殖速度快,C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少,2、基因工程常用的受体细胞有,大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞,A B,C D,B,D,52,1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？,2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？,3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？,四、目的基因检测与鉴定,53,检测内容,检测方法,1.目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上,2.目的基因是否转录出mRNA,3.目的基因是否翻译出蛋白质,4、个体生物学水平的鉴定,分子杂交技术,抗原抗体杂交,DNA分子杂交技术,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA探针：,用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。,54,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA,.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针,.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）,方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,55,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P,15,思考与探究,56,57,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分子杂交法,方法,:,抗原抗体杂交,过程:,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,58,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是,检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质,A B,C D,C,59,2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,A.人工合成基因,B.目的基因与运载体结合,C.将目的基因导入受体细胞,D.目的基因的检测和表达,C,60,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法、,Ca,2+,处理,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定：,61,