HPLC科晓公司液相培训幻灯片讲稿.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,高效液相色谱仪,一,.,概述,二,.HPLC,系统：,高压输液系统,;,进样系统,;,分离系统,;,检,测系统,;,辅助系统,三,.,流动相和固定相介绍,四,.,如何选择液相色谱仪,五,.HPLC,常规分析操作步骤及规程,六,.HPLC,系统中气泡对检测的影响以及解决方法,七,.,六通阀进样器的使用及保养,八,.,色谱柱的应用,九,.HPLC,日常简易维护及保养,十,.HPLC,常见故障的判定及解决方法,1.1,概述,高效液相色谱,(HPLC),是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：,液液分配色谱；吸附色谱,(,液固色谱,),；离子交换色谱；尺寸排阻色谱,(,凝胶渗透色谱,),。此外，还有亲和色谱、薄层色谱等。,早期液相色谱，包括,Tswett,的工作，都是在直径,15cm,长,50500cm,的玻璃柱,中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在,150200,m,范围内。即,使这样，流速仍然很低,(7,时，该检测器不够灵敏。,3.,HPLC,流动相和固定相简介,与,GC,流动相不同，,HPLC,流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。,理想的溶剂应有下列特性：,1,）对待测物具一定极性和选择性；,2,）使用,UV,检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长,(,为什么？,),；使用示差折光检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；,3,）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；,4,）化学稳定性好；,5,）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。,3.1,流动相,3.,HPLC,流动相和固定相简介,原则上，用于,GC,的固定相也可用于,HPLC,作固定相。但,HPLC,固定液易流失，因此常用的只有机种，按极性由高到低为：,-,氧二丙腈,(ODPN),、聚乙二醇,(PEM),、三甲撑二醇,(TMG),、十八烷,(C18),、角鲨烷,(SQ),。,根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。,根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。,3.2,固定相,3.,HPLC,流动相和固定相简介,机械涂渍固定相：,将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型,(,0.5-1.5%,涂布量,),或全多孔型载体,(,5-10%,涂布量,),上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。,为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的,前置柱,，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。,3.,HPLC,流动相和固定相简介,化学键合固定相：,化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。,3.,HPLC,流动相和固定相简介,通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：,Si-O-R,：,对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。,Si-R(,或,Si-N),：,不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格式反应不方便。使 用水溶液作流动相时，其,pH,应在,4-8,之间。,Si-O-Si-R,：,不水解，热稳定性好，在,pH2-8,范围内对水稳定。,3.,HPLC,流动相和固定相简介,正相和反相键合色谱法,3.,HPLC,流动相和固定相简介,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,3.,HPLC,流动相和固定相简介,硅胶,-,烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响,1-,尿嘧啶；,2-,苯酚；,3-,乙酰苯；,4-,硝基苯；,5-,苯甲酸甲酯；,6-,甲苯,可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。,4.,选择液相色谱仪的选择,一台品质,好,的液相色谱系统应从以下几个方面考虑：,一主要技术指标的优异：,首先是如何看指标。液相色谱仪的指标很多，有泵的、检测器的、色谱柱等等。我们认为要看主要,1.,进样体积过大 同,(10.4)1,2.,在进样阀中造成峰,技术指标，根据国家标准，仪器的主要指标有,噪音,，,漂移,，,最小检测浓度,，,定性、定量重复性,等。这些指标都要放在系统，回路里去看，去比较。就是需要把各单元装置都要联接好，如接好色谱柱，进样阀，并且要通上流动相。因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的，而不是单单用检测器或是泵的。,然后在这个基础上，我们再去比较这些主要指标。,4.,液相色谱仪的选择,1,噪音,是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果。,4.,如何选择液相色谱仪,2,最小检测浓度（最小检测限）,最小检测浓度,是反映仪器灵敏度的重要参数。,CL=2NdC/H,（,CL,：最小检测浓度,Nd:,噪音,C,：样品浓度最小检测浓度,H,：样品峰高）,由上式可见，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。某些厂家回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音。,4.,液相色谱仪的选择,3,漂移,是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高了分析效率。,4.,如何选择液相色谱仪,4,定性、定量重复性,主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分优秀的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。,有的朋友会认为这些指标好像都是检测器的。对的，但是就前面所说条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。例如：泵的脉动会直接影响噪音指标，泵的流量准确度、精确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标。例如：某些公司在公布的指标中，噪音和漂移指标写的条件是空池或有的干脆不写。这个指标只考核了,UV,检测器光学和电气的特性，与实际情况相差甚远，并没有考验泵的压力脉动，液流回路的阻尼和,UV,检测器流通池的性能。所以我们认为从以上的主要指标中可以反应出仪器的一些真实水平。,4.,如何选择液相色谱仪,二操作方便,操作方便性无论是对新手还是成熟的用户都是很重要的。操作越简单，有利于提高分析效率，也为以后分析方法的拓展提供有力的帮助。上海伍丰科学仪器有限公司的,WS-100,工作站软件实现了真正的智能化操作。它摒弃了以往工作站软件只能起到数据处理的理念，率先在国内推出了集控制与后处理于一身的软件，在操作使用上给用户带来了极大的方便。,4.,如何选择液相色谱仪,三系统的整体开发,这里指的是仪器的整体开发，是一个完整的系统。目前市场上有这个现象，说我的泵是进口的，或者是检测器怎么好，用了什么很多的进口件组装等等。其实这是个误区。液相色谱是个复杂的系统，不是整体开发的，各项指标之间、软件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整体水平不会高到哪里去，而且在售后服务方面对用户也是不负责任的。,整体开发的主要优点有：各项技术指标统一、仪器各单元的通信协调、能够建立一个整体的数字化评价系统、体现了企业的科技及开发实力。,国外知名的仪器生产厂家的产品也是整体开发的，所以能够保证仪器的整体水平。,4.,如何选择液相色谱仪,四稳定可靠，故障率低,5.HPLC,常规分析操作步骤及规程,1.,）严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜。,2.,）对抽滤后的流动相进行超声脱气,20-30,分钟。,3.,）打开色谱工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。,4.,）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，,直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，冲洗时速度不要超过,10 ml/min,5.),调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，,一般不要超过,2000psi,。选用合适的流速。,6.),设定不同样品的检测器分析参数。,7.),等基线走稳即可进样分析，分析样品时对样品的前处理非常重要。,8.),关机时，先关检测器，泵不要关掉，应改用流动相冲洗泵，不同的流动相冲洗,时间不同，一般冲洗,30min,以上，若是缓冲盐作流动相应先用水冲洗,30 min,，再,用纯甲醇冲洗。,9.),然后关液相泵。,10.),需要把进样阀冲洗干净，另把注射器等工具清理整洁。,11.),填写登记本，由负责人签字。,5.HPLC,常规分析操作步骤及规程,注意事项：,1).,1.,）试剂首先必须是,HPLC,级的。,2.),脱气,由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。因此，流动相在使用前必须经超声脱气,20,分钟以上。,3.),过滤,由于流动相里有很微小的颗粒杂质，如不经过过滤，会使单向阀堵塞，从而产生压力波动。这一点很多用户不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生的。,6.,HPLC,系统中气泡对检测的 影响及其解决方法,在我们进行液相色谱分析时，有时会遇到这样一个问题：,系统的流路中存在气泡,。,由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。,造成上述现象的主要原因有三条：,6.,HPLC,系统中气泡对检测的 影响及其解决方法,1.,是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；,2.,是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；,3.,是在注入样品时不注意混入了空气。,为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。,6.,HPLC,系统中气泡对检测的 影响及其解决方法,常用的脱气方法有以下几种：,1.,吹氦脱气法 使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在,0.1Mpa,压力下，以约,60ml/min,流速通入流动相,10-15min,以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂，脱气效果较好，但在国内因氦气价格较贵，本法使用较少；,2.,加热回流法 此法的脱气效果较好；,3.,抽真空脱气法 此时可使用微型真空泵，降压至,0.05-0.07MPa,即可除区溶解的气体。显然使用水泵连接抽滤瓶和,G4,微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。,6.,HPLC,系统中气泡对检测的 影响及其解决方法,4.,超声波脱气法 它是目前实验室使用最广泛的脱气方法，将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气,10-20min,即可。该方法操作简便，基本能满足日常分析的要求。,5.,在线真空脱气法 把真空脱气装置串联到储液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。,另外，还要注意：,1.,）在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净。,2.,）在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。,7.,手动进样阀的使用及保养,六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫,(,转子,),和固定底座,(,定子,),组成。美国,Rheodyne,公司的六通阀进样器最为通用，各大,HPLC,仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。,7.,手动进样阀的使用及保养,手动进样阀的工作原理,1,、手柄位进样,(Load),位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；,2,、将手柄转动至进样,(Inject),位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。,虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样,3,万次而无需维修。,7,手动进样阀的使用及保养,1,、手柄处于,Load,和,Inject,之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在,HPLC,系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。,2,、六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的,75,，如,20gL,的定量环最多进样,15p,L,的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的,3,至,5,倍，即,20gL,的定量环最少进样,60,至,1001aL,的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用,100ul,的平头进样针配合,20ul,满环进样。,7,手动进样阀的使用及保养,3,、可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上,10uL,的定量环，实际是,9uL,还是,11uL,并不重要,，,因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。,4,、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用,0.45um,的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的,Load,和,Inject,位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。,8.,色谱柱的应用,8.1,色谱柱的选择,8.1.1,硅胶基质填料,8.1.2,聚合物填料,8.1.3,其它无机填料,8.,色谱柱的应用,8.1.1,硅胶基质填料,8.1.1.1,正相色谱,正相色谱用的固定相通常为硅胶（,Silica,）以及其它具有极性官能团,如胺基团（,NH2,APS,）和氰基团（,CN,CPS,）的键合相填料。,由于硅胶表面的硅羟基（,SiOH,）或其它极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。,正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正己烷（,Hexane,）、氯仿（,Chloroform,）、二氯甲烷（,Methylene Chloride,）等。,8.1.1.2,反相色谱,反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。,样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。,常用的反相填料有：,C18(ODS),、,C8(MOS),、,C4(Butyl),、,C6H5(Phenyl),等。,8.,色谱柱的应用,8.1.2,聚合物填料,聚合物填料多为聚苯乙烯,-,二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要优点是在,pH,值为,1,14,均可使用。,相对于硅胶基质的,C18,填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。,现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。,8.,色谱柱的应用,8.1.3,其它无机填料,其它,HPLC,的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体,又由于在,HPLC,流动相中不会被溶解,这类柱可在任何,pH,与温度下使用。氧化铝也可用于,HPLC,氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在,pH,高达,12,的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。新型氧化锆基质色谱填料也可用于,HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用,pH,范围,1,14,，温度可达,100,。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。,8.,色谱柱的应用,8.2,色谱柱的使用,色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行,(,出厂测试所使用的条件是最佳条件,),，只有这样，测得的结果才有可比性。,8.,色谱柱的应用,a,、最好使用流动相溶解样品。,b,、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。,c,、使用,0.45m,的过滤膜过滤除去微粒杂质,。,8.2.1,样品的前处理,8.,色谱柱的应用,液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：,a,、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中,(,或长时间保留在柱中,),。,b,、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应,(,特殊情况除外,),。,c,、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命,(,可运用提高温度的方法降低流动相的黏度,),。,d,、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用,UV,检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。,e,、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。,f,、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。,8.2.2,流动相的配制,8.,色谱柱的选择,8.2.3,流动相流速的选择,因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为,4.6mm,的色谱柱，流速一般选择,1ml,min,，对于内径为,4.0mm,柱，流速,0.8ml,min,为佳。,当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间,(,如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量,),。,8.,色谱柱的选择,a,由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系,(,必须使用乙腈的场合除外,),。,b,对于正相柱推荐使用沸程为,30-60,的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水,(,电阻率大于,18,兆欧,),，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。,c,含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。,d,流动相要求使用,0.45 m,滤膜过滤，除去微粒杂质。,e,使用,HPLC,级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。,8.2.4,注意,8.,色谱柱的选择,8.2.5,色谱柱常见故障与排除,柱子的维护：,1.,使用色谱柱前认真阅读使用说明书；,2.,使用保护柱及在线过滤器；,3.,大多数反相色谱柱的,pH,稳定范围是,2,7.5,，尽量不超过色谱柱的,pH,范围,4,避免流动相组成及极性的剧烈变化,5,流动相使用前必须充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒核强保留成分；,6,如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存在乙腈或甲醇中；柱子长期不使用应该用叠氮化钠保存，以抑制细菌的生长；,7.,经常以强溶剂冲洗色谱柱；,8.,压力升高是需要更换保护柱的信号。,8.2.5,色谱柱常见故障与排除,故障,现象,解决办法,旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷,填料被流动相溶蚀而流失。,用同型填料填补柱效可部分恢复。,对硅胶质填料，流动相,PH,值在,2,7,范围内，否则可能被溶蚀。,旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。,入口填料被污染变质所致。,用强溶剂冲洗。,刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。,污染严重，则废弃或重新填装。,柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。,柱入口床层被污染使柱填料变质。,用强溶剂冲洗除去杂质。,8.2.5,色谱柱常见故障与排除,故障,现象,解决办法,新柱接到仪器上后，柱头漏液。,柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。,用扳手顺时针方向拧紧,1,4,圈直到不漏液为止。,柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。,柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。,继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。,新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。,同上。,流动相脱气不彻底特别是,MeOH,H,2,0,体系由于氢键作用很容易出现气泡。,同上。,配好流动相后一定要进行脱气处理。,8.2.5,色谱柱常见故障与排除,故障,现象,解决办法,新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。,柱入口滤片被固体颗粒堵塞,(,或被霉菌堵塞,),。,更换或清洗柱入口滤片；用,0,45,m,过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。,进样次数增加柱压降逐渐增加。,样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。,样品在流动相中析出微小结晶。,用,0,.,45,m,过滤膜过滤样品。,推荐使用流动相溶解样品。,使用,段时间后，柱效下降，分离不好。,柱填料被流动相溶,解而流失。柱填料被样品杂质污染。,推荐使用予柱。如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。,推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。,8.2.5,色谱柱常见故障与排除,故障,现象,解决办法,柱使用,段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。,柱入口床层被污染。,用强溶剂冲洗,20-30ml,，若效果不明显应废弃。,进样量增大与峰面积增加不成正比即进样量与峰面积不是线性关系。,样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。,用流动相溶解样品。,样品的浓度不宜太大。,进样量不宜过大。,使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快,。,霉菌生长所致。,在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。,实验结束后先用纯水后用,MeOH,各冲洗,20-30ml,后关机。,8.2.5,色谱柱常见故障与排除,故障,现象,解决办法,用,5,m,颗粒填料柱时，,以,MeOH,H,2,0,作流动相柱压较高。,MeOH,与水之间由于氢键作用黏度增大。,可用乙腈水体系使柱压降低，分离效率更好。,长时间放置的色谱柱，出现双峰。,柱床层出现干裂。,柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。,流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。,强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。,不影响柱的性能。,8.2.5,色谱柱常见故障与排除,故障,现象,解决办法,柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。,柱中固定相流失所致。,更换色谱柱。,检查所用的色谱条件是否合适。,在,U V,色谱图中，靠近死时间处出现负峰。,进样时压力波动所致。,样品溶剂比流动相的,UV,吸收值低。,采用阀进样。,用流动相溶解样品。,9.,高效液相色谱日常简易保养及维护,1,、流动相的抽滤要求：,色谱纯试剂，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤；,流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法）,2,、吸滤头：,特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。,3,、单向阀：,如遇到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀出现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！,9.,高效液相色谱日常简易保养及维护,4,、泵头：,泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等）,5,、过滤器：,当色谱峰出现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。,6,、排液阀：,此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。,7,、手动进样器：,平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维修或更换配件。,9.,高效液相色谱日常简易保养及维护,8,、流通池：,在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可根据说明书进行操作或申请维修）。,9,、工作站：,出现死机可重启计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.1,保留时间变化,1.,柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱,2.,等度与梯度间未能充分平衡 至少用,10,倍柱体积的流动相平衡柱,3.,缓冲液容量不够 用,25mmol/L,的缓冲液,4.,柱污染 每天冲洗柱,5.,柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相,6.,柱快达到寿命 采用保护柱,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.2,保留时间缩短,1.,流速增加 检查泵,重新设定流速,2.,样品超载 降低样品量,3.,键合相流失 流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀,5.,温度增加 柱恒温,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.3,保留时间延长,1.,流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡,2.,硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱,3.,键合相流失 同前,(10.2)3,4.,流动相组成变化 同前,(10.2)4,5.,温度降低 同前,(10.2)5,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.4,出现肩峰或分叉,1.,样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂,3.,柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,4.,柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,进样器损坏 更换进样器转子,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.5,鬼峰,1.,进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗,2.,样品中未知物 处理样品,3.,柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂,(,尤其是离子对色谱,),4.,三氟乙酸,(TFA),氧化,(,肽谱,),每天新配,用抗氧化剂,5.,水污染,(,反相,),通过变化平衡时间检查水质量，用,HPLC,级的水,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.6,基线噪声,1.,气泡,(,尖锐峰,),流动相脱气,加柱后背压,2.,污染,(,随机噪声,),清洗柱,净化样品,用,HPLC,级试剂,3.,检测器灯连续噪声 更换氘灯,4.,电干扰,(,偶然噪声,),采用稳压电源,检查干扰的来源,(,如水浴等,),5.,检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.7,峰拖尾,1.,柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相,2.,峰干扰 清洁样品,调整流动相,3.,硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相,PH,值,钝化样品,4.,死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管,5.,柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱,10.HPLC,常见故障的判定及解决方法,10.8,峰展宽,1.,进样体积过大 同,(10.4)1,2.,在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散,3.,数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于,10,点,4.,检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的,10%,5.,流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相,6.,检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器,7.,保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.,柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小,9.,样品过载 进小浓度小体积样品,科晓仪器公司联系方式：,杭州科晓化工仪器设备有限公司（本部）,地址：杭州市文三路,199,号,电话：,0571-56803999,传真：,0571-88086641,杭州科晓化工仪器设备有限公司合肥分公司,地址：合肥市宿松路南园新村,23,幢,110,室,电话：,0551-3633520,传真：,0551-3639013,杭州科晓化工仪器设备有限公司苏州分公司,地址：苏州市学士街,25,号,胥门大厦,306,室,电话：,0512-65194398,传真：,0512-65194166,杭州科晓化工仪器设备有限公司济南分公司,地址：济南市华能路,19,号,446,室,电话：,0531-88034128 88039532,传真：,0531-88035501,杭州科晓化工仪器设备有限公司广东分公司,地址：广州市先烈中路,102,号华盛大厦南塔,电话：,020-37664004 37664024,传真：,020-37663473,杭州科晓化工仪器设备有限公司沈阳分公司,地址：沈阳市和平区南京北街,107,号,电话：,024-22837877 22837577,传真：,024-22833828,谢 谢！,