抗原抗体反应的应用.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,抗原抗体反应的应用,抗原抗体反应的应用,第1页,一、免疫沉淀与免疫凝集,溶液中环状沉淀试验,在体外可溶性抗原与对应抗体形成肉眼看见沉淀物。,在液相中形成沉淀不轻易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间界面形成沉淀线便于观察。,抗原抗体反应的应用,第2页,对照,1:10 1:20 1:40 1:80 1:160,抗血清稀释度,抗原,沉淀线,抗血清,环状沉淀试验示意图,抗原抗体反应的应用,第3页,2.,凝胶扩散沉淀,抗原抗体在半透明半固相介质中进行沉淀试验。抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散，相遇形成沉淀。,以琼脂扩散试验较为常见。,单向免疫扩散：抗体混于琼脂中，小孔中加入抗原，抗原向周围均匀扩散，与抗体形成沉淀环。可用于定量测定免疫球蛋白和补体含量等。,双向免疫扩散：抗原和抗体向周围扩散后可在两孔之间形成白色沉淀线，可用于抗原或抗体定性检测。,缺点：时间长，灵敏度低,。,抗原抗体反应的应用,第4页,单向免疫扩散：常见于测定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。,抗体混于琼脂凝胶中制板,沉淀环,环直径与抗原含量成正相关,抗原抗体反应的应用,第5页,双向免疫扩散,沉淀线形状改变显示抗原间是否存在共同抗原决定簇,。,Ab,Ag1,，,3,Ab,Ab,抗原抗体反应的应用,第6页,3.,电泳条件下沉淀反应,血清免疫电泳：患者血清和正常人血清分别放在凝胶上近负极端小孔中进行电泳分离后，在两种抗原之间沿电泳方向挖一平行小槽，加入抗血清进行双扩散。,火箭电泳：单向免疫扩散与电泳结合一个方法。在电场作用下抗原向正极扩散，与抗体形成沉淀峰（火箭型沉淀线）。需时短，能检测微量抗原。,对流电泳,(,电渗析,),：在电场作用下抗原与抗体相对扩散，形成沉淀线。对流电泳较双扩快速和灵敏。,抗原抗体反应的应用,第7页,抗原抗体反应的应用,第8页,抗原抗体反应的应用,第9页,抗原抗体反应的应用,第10页,4.,免疫共沉淀,在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作用，能够经过免疫共沉淀惊醒判定和分离。,蛋白质相互作用经过非共价结合，用针对其中一个蛋白质特异性抗体进行免疫沉淀，与该蛋白相互作用其它蛋白也同时被沉淀下来。,假如第一抗体结合后再加入第二抗体或,A,蛋白可使抗原抗体形成更大复合物易于沉淀，也可经过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形成。,抗原抗体反应的应用,第11页,免疫共沉淀原理图解,抗原抗体反应的应用,第12页,5.,免疫凝集,大颗粒性抗原如细胞或细菌等与对应抗体结合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见凝集小块，即为免疫凝集。,凝集反应发生分为两个阶段：1、抗原抗体特异性结合阶段；2、出现肉眼可见凝集现象。,抗原抗体反应的应用,第13页,最常见免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。,血凝反应抗体识别抗原能够是红细胞表面天然抗原，如血凝判定试验；也能够经过交联将红细胞连接上其它抗原，如早期,HBsAg,血凝试验。,抗原抗体反应的应用,第14页,细菌血凝试验常见来 对细菌进行判定与分型，如沙门菌鞭毛抗原分析等。,免疫凝集试验即使简便，不过受反应灵敏度限制，在实际应用越来越少。,抗原抗体反应的应用,第15页,二、免疫标识,免疫标识技术：将已知抗体或抗原标识上易显示物质（示踪物），经过检测标识物反应有没有抗原抗体反应，从而间接测出微量抗原或抗体。,当前有四种方法：,放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最灵敏、可靠免疫标识技术。,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,荧光与发光免疫分析,亲和标识免疫分析,抗原抗体反应的应用,第16页,标识免疫技术,=,抗原抗体反应,示踪物标识,灵敏性,特异性,标识免疫技术主要特点：,高特异性,、,高灵敏性,免疫技术,+,标识技术,抗原抗体反应的应用,第17页,1.,放射免疫分析法,标识同位素：,125,I,，,131,I,、,3,H,和,35,S,检测方法：,液相体系用液体闪烁仪计数；,固相体系用,X,射线胶片显影。,抗原抗体反应的应用,第18页,直接法与竞争法,检测,检测,抗原抗体反应的应用,第19页,竞争法基础原理,采取定量标识抗原（,Ag,）和非标识抗原（,Ag,）竞争性结合有限量特异性抗体（,Ab,）反应。,抗原抗体反应的应用,第20页,抗原抗体反应的应用,第21页,放射性同位素标识分析法示意图,抗原抗体反应的应用,第22页,抗原抗体反应的应用,第23页,2.,酶联免疫吸附试验,（,ELISA,）,(enzyme linked immunosorbent assay),(1),定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离抗原或抗体，而结合抗原或抗体上被标识酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。,(2),测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。,抗原抗体反应的应用,第24页,(3),测试过程,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性,（固相抗原抗体形成）,在测定时，把受检标本（测定其中抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不一样步骤与固相载体表面抗原或抗体起反应,（抗原抗体反应）,抗原抗体反应的应用,第25页,用洗涤方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其它物质分开，最终结合在固相载体上酶量与标本中受检物质量成一定百分比。,（酶标抗原抗体复合物分离）,加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物量与标本中受检物质量直接相关，故可依据颜色反应深浅进行定性或定量分析。,（显色反应）,抗原抗体反应的应用,第26页,酶,起源,底物,检测波长,/nm,碱性磷酸酶,牛小肠黏膜,对硝基酚磷酸盐,405,过氧化物酶,辣根,邻苯二胺,/,过氧化氢,492,-,半乳糖酶,大肠杆菌,对硝基酚,-,半乳糖,405,常见标识酶及其底物,抗原抗体反应的应用,第27页,(4),ELISA,技术类型,ELISA,可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有,3,种必要试剂：,固相抗原或抗体，,酶标识抗原或抗体，,酶作用底物。,抗原抗体反应的应用,第28页,双抗体夹心法,(,直接夹心法）,抗原抗体反应的应用,第29页,特点：,非竞争结合反应,常见于抗原检测,适合用于分子中含有最少两个抗原决定簇多价抗原，而不能用于小分子半抗原检测,所用两种抗体分别针对同一个抗原分子不一样抗原决定簇,抗原抗体反应的应用,第30页,间接法,抗原抗体反应的应用,第31页,抗原抗体反应的应用,第32页,捕捉法（反向间接法）,主要用于血清中某种抗体亚型成份（如,IgM,）测定。,抗原抗体反应的应用,第33页,直接法,用酶标识抗原或抗体直接检测包被在酶标板上抗体或抗原，其量与产物颜色成正比。,抗原抗体反应的应用,第34页,3,、均相酶免疫吸附测定,基础原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标识酶活性发生改变原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离情况下，直接测定系统中总标识酶活性改变，进而推算出待检样品中抗原量。,主要用于,小分子抗原,或,半抗原,检测,.,抗原抗体反应的应用,第35页,酶放大免疫测定技术,:,（,enzyme-multiplied immunoassay technique,，,EMIT,）,基础原理,:,半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标酶与抗体亲密接触，使酶活性中心受影响而活性被抑制。,抗原抗体反应的应用,第36页,斑点酶免疫试验,(dot-ELISA),抗原抗体反应的应用,第37页,3.,荧光与发光免疫分析,概念：以荧光素作为示踪物，经过荧光显微镜观察进行定位检测。,荧光化合物：异硫氰荧光素、罗丹明荧光素。,抗原抗体反应的应用,第38页,基础原理,利用荧光素标识抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中待检抗原特异结合，采取高发光效率点光源，透过滤色板发出一定波长光，使结合在标本上荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有没有待检抗原或抗体。,抗原抗体反应的应用,第39页,抗原抗体反应的应用,第40页,荧光免疫测定技术,时间分辨荧光免疫分析法,原理：稀土铕离子,Eu,3+,螯合物标识抗体后，抗体与固相抗原结合，抗体上,Eu,3+,在紫外光（,340nm,）激发下，与增强液中,-,二酮体重新形成一个微胶体螯合物，发出长寿命高强度荧光（,613nm,），比未激发时增强了,100,万倍，可用时间分辩荧光计统计。,抗原抗体反应的应用,第41页,Eu,Eu,Eu,Eu,Eu,发射高强度荧光,时间分辩荧光计统计,加入增强液,紫外光激发（,340nm,）,时间分辨荧光免疫分析原理,直接法,间接法,夹心法,间接夹心法,抗原抗体反应的应用,第42页,4.,亲和标识免疫分析,亲和标识物：金黄色葡萄球菌,A,蛋白、生物素（维生素）、地高辛（小分子药品）,原理：金黄色葡萄球菌,A,蛋白与,IgG,Fc,有高度亲和力。用酶、同位素和荧光素等标识,A,蛋白，与抗体结合，可用于抗原抗体反应分析。,抗原抗体反应的应用,第43页,A,蛋白,亲和标识免疫分析,抗原抗体反应的应用,第44页,三、免疫定位分析,1.,免疫荧光定位分析,2.,酶标识免疫定位,3.,免疫电子显微镜技术,抗原抗体反应的应用,第45页,1.,免疫荧光定位分析,用不一样发光颜色荧光化合物标识抗体用于免疫细胞化学、免疫组织化学检测。,（荧光化合物,+,抗体）,-,生物大分子（抗原）在细胞或组织中表示和定位,荧光素：异硫氰荧光素、异硫氰四甲基罗丹明,荧光显微镜观察,荧光激活细胞分拣器（,流式细胞仪）,应用：,CD4+,、,CD8+T,细胞亚群计数,原理：流式细胞仪产生分析电信号生要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据细胞流经光照射区时电压讯号强弱来分析和分选细胞。,抗原抗体反应的应用,第46页,抗原抗体反应的应用,第47页,抗原抗体反应的应用,第48页,2.,酶标识免疫定位,抗原（组织或细胞内）,+,第一抗体,+,第二抗体酶,+,底物,不溶于水有色产物,（,1,）酶标免疫组织化学,固相抗原为组织切片或细胞样品。,抗原抗体反应的应用,第49页,（,2,）,免疫印迹法,（,immunoblottingtest,，,IBT,）,蛋白质经凝胶电泳后，形成不一样条带，转移至硝酸纤维膜上，用酶标识抗体进行显色反应，可确定目标蛋白有没有，或分子量大小。,分三个阶段进行,:,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）,转移,硝酸纤维素膜,酶免疫定位,抗原抗体反应的应用,第50页,免疫印迹法原理示意图,抗原抗体反应的应用,第51页,3.,免疫电子显微镜（,IEM,）技术,电子显微镜技术与免疫反应相结合一项技术。,优点：提升了电镜观察特异性。,如形态相同，但结构和组成不一样生物粒子，细胞器或病毒粒子。,种类：,一类是先用抗体捕捉抗原，然后用磷钨酸负染色观察。,另一类是用金标识抗体进行抗原定位。胶体金与抗体,Fc,段结合。,抗原抗体反应的应用,第52页,四、抗原抗体反应其它应用,免疫亲和层析,原理：任何一反抗原,-,抗体组分之一与固相基质交联后均可用于另一组分纯化。广泛用于蛋白质抗原分离纯化。,固相基质：琼脂糖、葡聚糖,抗原抗体反应的应用,第53页,抗体,+,琼脂糖,上样,洗涤,洗脱,免疫亲合层析示意图,OD,280,检,测,凝胶电泳,抗原抗体反应的应用,第54页,2.,生物感应器与抗体芯片,机理：抗原与抗体在相互结合后，它们结构发生了改变，一些次级键参加结构改变。这种结构改变经过电场效应改变能够被检测到。,能够判断抗原抗体结合是否发生及发生强度。,抗原抗体反应的应用,第55页,组成：,生物受体（抗体）,转导体,电子放大处理器,转 导 体,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,信号放大,抗原抗体反应的应用,第56页,