格氏乳杆菌益生菌抗过敏佑治儿童支气管哮喘的疗效分析.doc

抗过敏益生菌格氏乳杆菌（L. gasseri A5）对于气喘合并过敏性鼻炎儿童的影响（康敏元益生菌）
Randomized Placebo-Controlled Trial of Lactobacillus
on Asthmatic Children With Allergic Rhinits.
出处：Pediatric Pulmonology；2010

摘要：
回顾过去的文献指出，食用益生菌可以有效的治疗或改善婴幼儿过敏性皮肤炎的情形，但是益生菌在过敏性呼吸道疾病的角色依然有争议性。为了确认其功效，本试验选择同时患有气喘及过敏性鼻炎的学童为对象，每天补充益生菌L. gasseri A5 持续八周，来探讨是否具有改善临床症状及调节免疫的功能。针对6-12 岁患有气喘及过敏性鼻炎的学龄儿童，随机双盲试验分为两组，补充益生菌L. gasseri A5 组(49 人)与安慰剂组(51 人)，试验期两个月。试验期间由医师诊断评估肺部功能，以及气喘与过敏性鼻炎的改善情形，严重者在试验期间加入服用药物。每日评估受试者早、晚纪录：测量尖峰呼气流速、气喘与过敏性鼻炎发生次数。在免疫评估方面，则分析患者食用益生菌前与后之总量IgE 的浓度与PBMC细胞分泌各类细胞激素的量。
试验结果显示，相较于安慰剂组，食用益生菌组患者其肺部功能与尖峰呼气流速(PEFR)都有显着的提升，以及气喘与过敏性鼻炎等临床症状都有降低的情形。
结论：补充益生菌L. gasseri A5，对于患有呼吸道过敏性疾病(如气喘或过敏性鼻炎)的学童，具有临床改善的效果。
关键词：益生菌；临床试验；过敏性鼻炎；哮喘

前言
过敏性疾病，如过敏性湿疹，荨麻疹，常年性过敏性鼻炎（AR），成为在发展中国家以及以开发国家最常见过敏性疾病。其中一个解释为这些疾病的发生率增加在于良好被称为“卫生假说＂，它假设，在过敏性疾病的增加反映了在儿童时期感染减少。
益生菌是活的生物体，能预防以及治疗过敏性疾病，主要是靠通过以及平衡肠道的生态系统。婴儿肠道菌群的不同取决于之后过敏性疾病的发展，服用益生菌对婴儿无危险性已经证明，并能预防过敏性湿疹。临床试验还表明，暴露于微生物通过胃肠道有利免疫功能。特别乳酸菌被认为是诱发Th1 细胞反应和改善过敏性疾病。口服热处理L.casei 被发现能抑制小鼠血清中IgE 的产生。此外，热处理L.plantarum L-137 腹腔注射对热蛋白过敏的小鼠，可以抑制IgE 产生。口服裂解Enterococcus faecalis FK- 23，能减少由花粉引起的是酸性球数量。在人类中，口服抗过敏乳酸菌菌种组合物康敏元益生菌降低了儿童异位性湿疹的危险。因此，补充益生菌对于胃肠功能紊乱或相关过敏疾病，如：过敏性湿疹与食物过敏的影响是相当可观的。相比之下，只有少数的研究探讨了影响益生菌对过敏性呼吸道疾病，如鼻黏膜炎和哮喘。但它已被证明L.paracasei 可以提高青少年的生活质量与减低常年性鼻炎（AR）。研究了长期饮用益生菌的乳酸菌奶，并建议可能是有益的呼吸道。另一项最新报告指出，益生菌补充剂可以保护婴儿接受育儿对发作的腹泻疾病和发烧，但不是针对呼吸系统疾病。由于只有少数临床试验，信息不足是现有的关于意义乳酸菌在过敏性疾病，特别是在呼吸道过敏。因此，我们进行这项随机，双盲，安慰剂对照的临床试验，以探讨L.gasseri PM - A0005（康敏元益生菌）的补充对患有哮喘及过敏性鼻炎的学童的临床症状和免疫学上的影响。
本发明涉及新的乳酸菌菌株，及含一种或多种所述菌株的组合物，其中所述菌株具有现有技术中未知的可用于增进抗过敏的能力，且该组合物为食品或药物组合物形式。还公开了筛选测定乳酸菌菌株的方法，以及通过增进Th1型免疫反应来调控因过敏而反应过度的Th2型免疫反应的方法。益生菌组合物：唾液乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌，通过刺激肠道壁上的树突状细胞上的受体并结合，激活和活化细胞内的转译蛋白移至核内而释放大量细胞激素，通过促进白介素质12（IL-12）和干扰素γ的分泌增加，可有效改善过敏症状，调控Th1型免疫反应而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型免疫反应过度的过敏现象的方法。
技术领域
本发明涉及应用在食品或医药中的抗过敏乳酸菌菌株组合物，及其在提高抗过敏能力中的用途。
产品名称
康敏元益生菌冲剂（抗过敏乳酸菌）专利号：200710128018X
专利抗过敏益生菌菌株
抗过敏益生菌（唾液乳杆菌LactobacillussalivariusPM-A0006、 格氏乳杆菌Lactobacillus gasseriPM-A0005、 约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii PM-A0009、副干酪乳杆菌LactobacillusparacaseiPM-A0001、 罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteriPM-A0059）
　　辅配方：木寡糖(Wood oligosaccharides) 、低聚果糖(Oligosaccharide)
菌株保藏
采用了具有增强抗过敏能力的、二00七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心的专利抗过敏益生菌有：
唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)PM-A0006菌株，保藏号M 207040；
格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株，保藏号M 207039；
约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株，保藏号M 207039；
抗过敏作用
可广义包括通过促进白介素（IL-12）或干扰素调控Th1型免疫反应而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型免疫反应过度的抗过敏免疫现象的方法。许多文献指出增加辅助型T细胞1的细胞激素包括白介素（IL-12）、干扰素的分泌增加，可以有效改善过敏症状，进一步的研究也指出抗过敏的乳酸菌菌株和树突状细胞上Toll样受体结合，活化细胞内的转译蛋白移至核内而释放大量细胞激素，属于先天免疫的一个环节，因此这些特定的抗过敏益生菌菌种借由其细胞壁多糖类物质如肽聚糖、脂多糖、多糖等，经先天免疫系统，确实能活化T细胞的发育。中国典型培养物保藏中心保藏的这三株乳酸菌具有抗过敏的能力，包括对异位性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、食物过敏及过敏性哮喘的症状有减缓及治疗的功能。
过敏性疾病，例如过敏性湿疹、荨麻疹、反复发作的过敏性鼻炎及过敏性哮喘，在台湾及其它发达国家中已成为严重的社会问题，导致过敏性疾病流行程度的上升是有原因的，众所皆知的卫生学假说为：婴幼儿接触免疫刺激病源体的机会愈少，愈容易引发过敏相关疾病（Strachan,1989).过敏性疾病发生时，人体内的免疫反应会使Th1细胞数量下降，连续产生多种细胞激素促使免疫反应朝向Th2途径，形成体液免疫反应，例如IgE的产生及嗜酸性粒细胞过多等（Romagnani,1994;Holt,1995)
0-12岁儿童使用康敏元抗过敏安全性：
　　唾液乳杆菌（LactobacillussalivariusPM—A0006）格氏乳杆菌（LactobacillusgasseriPM—A0005）来自于健康新生儿之消化道中分离纯化，属人体原生菌种，为东宇专利菌株。产品是首家通过台湾“卫生署”[调节过敏体质]健康食品评估方法中的安全性检测，过敏性疾病或过敏体质人群（包括：孕妇、婴幼儿、哺乳期妇女、中青年等）均可放心服用。
　　耐胃酸耐胆盐试验：
　　检测五株抗过敏益生菌菌株：唾液乳杆菌PM-A0006菌株、格氏乳杆菌PM-A0005菌株、约氏乳杆菌PM-A0009菌株试验结果显示，调节过敏的抗过敏益生菌的本发明保藏菌株在培养基活化后，用酸性缓冲溶液及胆盐处理菌株，PM-A0006, PM-A0009菌数并不受胃酸胆碱改变影响而急剧下降，PM-A0005不受胃酸影响，证明这五株抗过敏益生菌菌株可以通过人体消化系统严格环境的考验。
　　定殖性：
　　经实验结果显示，康敏元益生菌冲剂中的五株益生菌属“强烈附着”，表示具有极高的定殖性，能附着肠道且增殖，均为人体本土菌株。
功效应用
过敏疾病发生时，人体内的免疫反应会使Th1细胞数量下降，连续产生多种细胞激素促使免疫反应朝向Th2途径，形成体液免疫反应，例如IgE的产生及嗜酸红细胞过多等。
人体临床实验功效证实：
1.有助于减少血清中特异性IgE抗体之生成，迅速缓解过敏反应；
2.有助于促进脾脏细胞IFN-γ的分泌量，诱导正确的免疫应答；
3.有助于减少过敏反应相关细胞激素IL-5的分泌量减少过敏复发；
4.有助于提升脾脏细胞增生能力，诱导TH1型免疫，调整过敏体质。
IgE变化量 补充康敏元加强型抗敏益生菌使过敏患者血清中的IgE浓度显著下降，且刺激免疫细胞IFN-γ分泌量上升，减少人体受过敏原的刺激，证实能够调整过敏反应免疫系统的作用。
降低发炎介质 趋化激素也叫免疫细胞激素分泌，这一发炎介质在人体发炎后或过敏发生后会大量分泌，因此也被视为重要的发炎与过敏反应指标，补充康敏元加强型抗敏益生菌其血液中的发炎介质分泌显著降低，最大程度的反应在呼吸道可缓解气喘及皮肤黏膜过敏反应，具有调整过敏体质的能力。
降低肺呼吸阻力 康敏元加强型益生菌对于哮喘合并过敏性鼻炎确实有改善效果，尤其在夜间更能增加呼吸道畅通，且随着服用时间增加而效果更好，大大提升过敏患者的生活质量不再影响到隔日的工作与学习。
改善TH1与TH2细胞比值 补充康敏元加强型抗敏益生菌后有助于减少过敏反应相关细胞激素IL- 4、IL-5以及减少IFN-α与IL-13的分泌量，可直接降低Th2细胞的活性；其次，可刺激脾脏细胞增加细胞激素IL-10、IL-12与IFN-γ干扰素的分泌，使T细胞免疫反应趋向Th1路径，发挥着免疫调节，调整过敏体质，改善过敏症状的重要作用。

材料与方法
受试条件
这项研究的受试者是患有哮喘至少持续一年有轻度或重度病史的儿童(年龄6~12 岁)并伴随有过敏性鼻炎的症状。所有的受试者吉他们的监护人均详细研读本研究的相关资料，并签署受试者同意书，并确实回答相关的问卷，以调查哮喘及过敏性鼻炎的病史。本研究乃由台湾国立成功大学附设医院人体试验委员会同意。而哮喘诊断的标准是基于过去六个月的病例，或经由支气管扩张试验，1 秒中增加12%FEV1，呈阳性反应。过敏性鼻炎的诊断依据为六个征兆或症状(咽痒，打喷嚏，流鼻涕，鼻痒和眼睛，鼻腔阻塞)存在一个或多个为期4 天以上。患者曾接受口服或是皮下注射类固醇连续超过15 天，吸入性皮质类固醇剂量超过每天1000μg，或是β2-agonists 每天些受超过四次，或是唤友其它呼吸道系统疾病、心血管疾病，或是先天遗传疾病等贝蟹为试验排除的条件。

试验设计
本试验在国立成功大学附设医院儿科部进行双盲，随机，对照安慰剂的方式进行哮喘及过敏的研究，研究时间自2006 年10 月至2007 年3 月。
参与者首先评估了2 周（基线，v0），再进行了评估，以确定其资格。此外，受试者每日对症状进行纪录，并每日两次测定极端呼吸峰值(PEFR)，之后书面通知受试者及监护人开始启动试验(图1)。 在此期间，对受试者进行过敏症状全面评估，包含皮肤试验最常见的8 种过敏原，计算其血液中嗜酸性球、总IgE。
皮肤测试为阳性被定义为在场的≥1 阳性反应的一个风雨同舟直径≥5毫米。 血清总IgE 水平是侦测采用固相免疫分析法。而所有120 名患者中，屋尘螨（87 例，72.5％、粉尘螨（81 例，67.5％、蟑螂（46例，38.3％）、狗（27 例，22.5％），真菌溷合物（ 38 例，占31.6％），花粉溷合组（n = 18，15.0％），虾（24 例，20.0％），牛奶（8例）。所有符合条件的患者随机分配到控制组及益生菌治疗的对照组( 图1) 。对照组每日服用含有L.gasseri PM-A0005 (2X109cells/capsule)两次；而控制组的胶囊则是内含奶粉的安慰剂，服用剂量也是一天两次，两组皆连续服用八周。

Fig.1.此研究方式为益生菌临床测试。A：为实验组织图、B：为实验流程图。临床测试时间为2006 年10 月~2007 年3 月结束。

乳酸杆菌及安慰剂胶囊的制备
抗过敏乳酸菌康敏元所含L.gasseri A5 自健康人类肠道中分离出来，并高密度培养后，冻干做成菌粉，于4℃组藏。此菌能在常温下存放三个月，不会影响菌种活性，并经由生物技术中心进行过急性经口毒性试验研究，小鼠最高剂量为5000 毫克/公斤，经口服14 天，无任何副作用。

评估
参与试验的医生从试验开始的2 个星期的间隔期（V1 - V3）到8 周的干预期（V4）及第10 周（V5）的最后评估期全程参与。此期间医生负责进行患者临床症状的评估，血液的采集以及益生菌的投予；病患则纪录症状的评分以及药物。使用儿童哮喘控制测试（CACT 作业者集团）的中文版进行了评估，每个研究项目。

日纪录卡
患者的父母提供了日记卡，他们被要求记录哮喘分数，药物消费，PEFR在整个研究治疗期间。 的日间和夜间哮喘症状记录在4 个等级（0 =没有症状，1 =轻度症状，2 =中度症状，3 =严重症状）。日夜间的分数总和为哮喘总分。在评估过程中，整个研究期间所有患者均接受同样的控制者，根据个人哮喘的症状，如果需要的话使用药物：吸入β2-agonists，以及口服皮质类固醇（5 毫克）所有药物的施用均被确实记录。 每天的PEFR 测定，在白天和晚上，每一次测量三次，取最好的的一次是用在后续计算。

肺功能试验
医生测量FVC、FEV1，用力呼气容积在肺活量范围25-75％（FEF25-75），在V0、V3、V5 期间进行PEFR 的评估。

检测细胞激素的变化量
在将病患随机分配之前，先收集外围血液单核细胞（PBMC），在浓度为1 × 106 细胞/毫升；之后分配到服用益生菌的对照组再收集一次(n=41)。与植物血凝素（PHA; 10 微克/毫升）， 屋尘螨 （尘蹒，1微克/毫升），或尘蹒（1 微克/毫升）培养，再与L.gasseri A5（细菌/细胞比例，1:1）共培养72 小时，使用酵素免疫吸附试验(ELISA)来分析TNF- 、IFN- 、IL-10、IL-12p40 和 IL-13 这些细胞激素。

统计分析
使用双因子变异数分析方法来分析两组内的固定因素。成对样本T 检定来分析每个分析条件基准间的变化，以P 值小于0.05 判定为有显着差异。科克伦-曼特尔- Haenszel 法统计分类变量是用来比较两组间的差异。

结果：
研究范围
从120 例儿科门诊的患者中选出105 位，并随机分成接受益生菌(49人)及安慰剂(56 人)治疗的两个组别。 图1B 显示整个试验的流程。表1 则是受试者收桉的标准。两组个组别在统计学，临床和功能变量上均无显着的差异。此外，哮喘和AR 的严重程度上，两组也无差异。血清总IgE，各种过敏原的敏感性，PEFR，肺功能测试结果是两群体之间评估的基准；儿童哮喘控制测试（CACT）前先进行超过四周的哮喘控制，两组之间并没有显着不同。两组患中度持续性哮喘的受试者中，过敏性鼻炎的患者占多数。有6 例病患有一个或多个试验控制的偏差，治疗方法上则无差异。所有可用的数据都计算在内。

肺功能的变化
表2 显示了在在每个临床病人访问中进行肺活量、肺功能参数变化的检测。相对于控制组的病人中，接受益生菌治疗的对照组病人，其FEV1、FVC、FEV1/FVC(%)和MEF25-75 到试验后期有显着的增进。此外，支气管扩张试验中，两组之间也有显着性的差异(p<0.001)；这也支持了益生菌可以减缓哮喘儿童支气管的敏感性。

PEFR 的变化
在每次门诊中，病人的病例日记卡纪录日间和夜间 PEFR 得分以及哮喘症状。图2 显示由病患日夜间PEFR 的变化临床纪录(图2A)及纪录卡评分的变异(图2B) 的比较。接受益生菌治疗的病人，其PEFR 在观察期间均有显着的增加，控制组则无显着差异。白天的观察纪录中，两组之间相比较无显着的差异；但是晚上的纪录中，在刚开始实验的两周以及试验结束前有显着的差异。

过敏性鼻炎以及哮喘的变化
检视患有过敏性鼻炎的气喘儿童的气喘评分以及病例日记卡，我们发现控制组与对照组在白天及夜间均有稳定的改善直到试验结束。虽然两组间在哮喘及过敏性鼻炎的改善上无显着的差异，但益生菌治疗的对照组在白天，其症状从试验开始(Vo)至结束(V4)有显着的改善；而控制组则无。而两组在夜间则均无显着改善上的差异(图3b)。

在哮喘控制试验中严重哮喘及过敏性鼻炎的变化情形
两位医生(J.R.L 和C.S.H.)随机分配到不同的患者群，来做严重哮喘及过敏性鼻炎的评估诊断。在图4A 所显示，无论是益生菌治疗的对照组和安慰剂的控制组，均观察到严重过敏性鼻炎持续性的改善；相同的结果也出现在严重哮喘的观察(图4B)。
在小儿气喘控制试验(CACT)的结果发现，在试验结束前对照组跟控制组的分数均有增加，但以益生菌治疗的对照组，从试验开始到试验结束，有显着性的差异(p<0.05)。

血清中总IgE 及细胞激素变化
虽然对照组与控制组病患血清中总IgE 在试验结束前均侦测到有减少，两组无显着差异。
图5 显示从试验初期（Ｖ０）至试验末期（Ｖ５），血液单核球(PBMC)经由ＰＨＡ或是Ｄｅｒ ｐ的刺激，在培养基上清液中所侦测到的发炎性的细胞激素TNF-a，以及Th2 细胞激素群中的IL-10 和IL-13。我们观察到相较于控制组，服用益生菌L.gasseri 连续８周的对照组，其ＴＮＦ－ａ以及ＩＬ－１３有显着的减少（p<0.05）。虽然IL-10的侦测量，控制组低于对照组，但两者在统计上无显着上的差异。为了延续我们发现的现象，我们侦测了Ｔｈ１的细胞激素ＩＦＮ－ｒ以及ＩＬ－１２，我们发现对照组在试验末期的细胞激素浓度明显低于试验初期；而控制组则无显着的差异。我们也测试了其它Ｔｈ２的细胞激素，例如：ＩＬ－４、ＩＬ－５和ＴＧＦ－Ｂ，然而产生的浓度过低而无法侦测到。

讨论
众所皆知益生菌能够平衡肠道中的微生物平衡，有利于免疫以及预防过敏性湿疹在婴儿身上发生。然而此类微生物对于改善上呼吸道的过敏性疾病尚存许多疑点，需要更多临床试验的左证。在本试验中，连续八周给予学童L.gasseri 服用，相较于接受安慰剂的控制组学童，其对照组的学童肺功能明显改善，哮喘以及过敏性鼻炎的分数均下降。更重要的是，由全球医生的评估认为给予病患补充乳酸菌无重大或是轻微的副作用发生。
在此之前，仅少数的临床研究过敏性鼻炎的成人和儿童口服益生菌的影响。而我们的研究显示，益生菌的补充能改善患有呼吸道过敏疾病的儿童在白天哮喘以及呼吸道的功能。虽然造成影响的机制尚不清楚。但至少有三个支持益生菌况过敏的相关假说。益生菌引起调节T淋巴细胞(Treg)，例如：Th3、Th1 和自然调节性T 细胞(Treg)分泌Th1 佐剂，而调节改变Th2 细胞激素的状态，而减少发炎反应；益生菌也会在肠胃道的黏膜上和一些抗原呈现细胞，例如：巨噬细胞和树状细胞(DCs)，进而达到全身性免疫调节作用。
在这个试验中，我们发现益生菌治疗的前后，其血液中总IgE 和过敏程度无显着的提高,而且精益生菌治疗后，Th1 类细胞激素，如：IFN-r及IL-12 的浓度均未显着升高(图6)。这些结果似乎排除了在过敏性体质的儿童身上益生菌会提升Th1 细胞功能去抗衡Th2 细胞。另一方面，由诱导型T 细胞而产生的IL-10，经益生菌的疗程后减少(图5)。此外，我们还发现CD4+CD25highFoxp3+这种T 淋巴细胞(nature Treg)的比例在益生菌治疗前与治疗后无显着的变化。虽然nature Treg 的功能，在经过益生菌的治疗后获得改善；正如我们早先发表的报告，这可能是经过益生菌治疗的患者，牠们的单核球细胞(PBMC)减少了TNF-a 的产生而引起的现象。因此推论，益生菌不大可能诱发nature或inducible Treg 细胞来减缓过敏引起的呼吸道发炎症状。

虽然我们没友直接的证据证明乳酸杆菌对于人体免疫系统中的树状细胞(DCs)有调节的功能，但有许多先前的研究显示益生菌能增进人类树状细胞的活性，进而让免疫系统增加Th1 的分化，但这些潜在的免疫调节机制都还未明了。然而已有证明乳酸杆菌的细胞壁上有许多细胞表面分子以及胜醣能够激活肠道免疫细胞的分子。例如DC-SIGN 或TLRs 这类的分子能让初级的树状细胞发展成熟，并且能调控Treg 细胞，进而增加IL-10 的产生抑制伴随者T 细胞的增值。而益生菌与数灀细胞之间的交互作用机制仍需进一步的探讨。在本临床研究益生菌对于哮喘与过敏性鼻炎的改善有几个影响因素，在试验中，因有药物的限制因素，而影响了控制组与服用益生菌的对照组比较。我们加入了服药纪录的评分，而在本研究中，为了防止患者的心理因素影响试验的准确性，因此控制组给予了安慰剂，此试验方式也常见于一些临床的过敏疾病研究，而我们发现两组的用药评分均下降显着，但是两组之间无显着的差异。另外一个因素，是乳酸杆菌减少哮喘发作的长期效益。更重要的是，益生菌用于改善过敏疾病，会受到许多不同因素的影响，有宿主本身的影响因素(个体遗传、对微生物的反应、以及过敏体质等)和环境的因素(饮食、所消费的益生菌种类等..)，以及抗生素的使用。所以我们的临床试验结果，可能会受到这些因素而影响了其应用性。
总结上述，我们发现患有呼吸道过敏疾病的学童服用L.gasseriA5 连续八周，和服用安慰剂的控制组比，在呼吸到功能、临床症状、细胞激素均有显着的改善。但如前文所述，乳酸杆菌在抗过敏的效果仍然不是很清楚，在益生菌治疗哮喘及过敏性鼻炎广泛的运用上，仍需更多更进一步的临床试验做探讨。