生物总复习选修1专题4公开课获奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,选修,1,生物技术实践,专题,4,DNA,和蛋白质技术,第1页,考纲内容及能力要求,考向定位,1.了解DNA物理化学性质和DNA溶解性,2.二苯胺法判定DNA方法和原理,3.掌握PCR技术基本原理,4.能够掌握PCR试验操作中主要步骤,5.了解PCR试验中每个步骤所发生改变,6.熟练进行试验操作，掌握试验方法,1.PCR反应过程,2.DNA合成方向,3.PCR反应所需试验条件,4.PCR反应缓冲液组成成份,5.TaqDNA聚合酶应用,6.PCR试验中详细操作步骤和试验操作中注意事项,7.PCR产物检测方法,第2页,基础梳理,第3页,DNA,粗提取与判定,基础梳理,1.提取DNA措施,提取生物大分子基本思绪是选用一定_,或_措施，分离具有不一样样_或_生物大分子。对于DNA粗提取而言，就是要运用DNA与_、_和_等在物理和化学性质方面差异，提取DNA，清除其他成分。,物理,化学,物理,化学性质,RNA,蛋白质,脂质,第4页,(1)DNA溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不一样样浓度氯化钠溶液中溶解度_，运用这一特点，选择合适盐浓度就能使DNA_，而使杂质沉淀；或者使杂质_，DNA被析出，以抵达分离目旳。,(2)DNA对酶、高温和洗涤剂耐受性 蛋白酶能水解_，不过对_没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080高温，而DNA在_以上才会变性。洗涤剂可以瓦解_，但对DNA没有影响。,(3)DNA鉴定在_条件下，DNA遇_会被染成_色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA试剂。,蓝,不一样样,充足溶解,溶解,蛋白质,DNA,80,细胞膜,沸水浴,二苯胺,第5页,2.试验设计,(1）试验材料选用 但凡具有_生物材料都可以考虑，不过，选用_生物组织，成功也许性会更大。在下面生物材料中选用适合试验材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养大肠杆菌。,(2）破碎细胞，获取含DNA滤液动物细胞破碎比较轻易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量_，同步用_搅拌，过滤后搜集滤液即可。假如试验材料是植物细胞，需要先用_溶解细胞膜。例如，提取洋葱DNA时，在切碎洋葱中加入一定_和_，进行充足搅拌和研磨，过滤后搜集研磨液。,DNA,DNA,含量相对较高,蒸馏水,玻璃棒,洗涤剂,洗涤剂,食盐,第6页,（3）清除滤液中杂质在滤液中加入NaCl溶液，使NaCl溶液浓度为2 mol/L，过滤除去不溶杂质，再调整NaCl溶液浓度为0.14 mol/L，析出DNA，过滤清除_中杂质,再用2 mol/LNaCl溶液溶解DNA。,（4）DNA析出与鉴定将处理后溶液过滤，加入与滤液体积_、冷却_，静置23 min，溶液中会出现_色_物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒_搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面水分。,取两支20 mL试管，各加入物质量浓度为_NaCl溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL_。混合均匀后，将试管置于_中加热5 min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色变化，看看溶解有DNA溶液与否变_。,蓝,溶液,相等,酒精溶液,白,丝状,沿一种方向,2 mol/L,二苯试剂,沸水,第7页,3.操作提醒,以血液为试验材料时，每100 mL血液中需要加入,3 g_，防止血液凝固。,加入洗涤剂后，动作要_、_，否则轻易产生大量泡沫，不利于后续环节操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要_，以免加剧DNA分子断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。,二苯胺试剂要_，否则会影响鉴定效果。,4.成果分析与评价。,现配现用,柠檬酸钠,轻缓,柔和,轻缓,第8页,归纳整合,一、DNA粗提取与鉴定过程,（详细见必修2第3章第1节“走进试验室”）,提取DNA第一步是材料选用，其目旳是选用DNA含量较高生物材料，否则会由于试验过程中或多或少损失而导致检测困难；第二步是DNA释放和溶解，这一步是试验成功与否关键，要尽量使细胞内DNA所有溶解；第三步是DNA纯化，即根据DNA溶解特性、对酶及高温耐受性不一样样等特性，最大程度地将DNA与杂质分开；第四步是对DNA进行鉴定，这是对整个试验成果检测。,第9页,二、DNA溶解度与NaCl溶液浓度关系,当NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，随浓度升高，DNA溶解度减少；当NaCl溶液浓度高于0.14 mol/L时，随浓度升高，DNA溶解度升高。,第10页,跟踪训练,（年江苏卷）如下论述中错误是（）,A.变化NaCl溶液浓度只能使DNA溶解而不能使其析出,B.在沸水浴中，DNA遇二苯胺试剂会展现蓝色,C.加盐和加酒都能克制微生物生长,D.密封瓶口前最佳将瓶口通过火焰以防杂菌污染,第11页,解析：当NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，随浓度升高，DNA溶解度减少；当NaCl溶液浓度高于0.14 mol/L时，随浓度升高，DNA溶解度升高；NaCl溶液浓度为0.14 mol/L时，DNA溶解度最低。因此，变化NaCl溶液浓度可以使其析出。,答案：A,第12页,血红蛋白提取和分离,基础梳理,1.凝胶色谱法,凝胶色谱法也称做_，是根据_大小分离蛋白质有效措施。大多数凝胶是由_构成多孔球体，在小球体内部有许多贯穿通道，当相对分子质量不一样样蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小蛋白质_进入凝胶内部通道，旅程_，移动速度_；而相对分子质量_蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在_移动，旅程_，移动速度_。相对分子质量不一样样蛋白质分子因此得以分离。,较快,分派色谱法,相对分子质量,多糖类化合物,轻易,较长,较慢,较大,凝胶外部,较短,第13页,2.缓冲溶液,缓冲溶液作用是_。缓冲溶液一般由12种_溶解于水中配制而成。生物体内进行多种生物化学反应都是在一定pH下进行，例如：血浆pH是_。为了可以在试验室条件下精确模拟生物体内过程，就必须保持体外pH与体内_。,基本一致,在一定范围内，抵制外界酸和碱对溶液,pH,影响，维持,pH,基本不变,缓冲剂,7.357.45,第14页,3.电泳,电泳是指带电粒子在_作用下发生_过程。许多重要生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离基团，在一定pH下，这些基团会带上_。在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_电极移动。电泳运用了待分离样品中多种分子_以及分子自身_、_不一样样，使带电分子产生不一样样_，从而实现样品中多种分子分离。两种常用电泳措施是_和_，在测定蛋白质分子量时一般使用_。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于_以及_等原因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移速率完全取决于蛋白质_。,分子大小,电场,迁移,正电或负电,相反,带电性质,大小,形状,迁移速度,琼脂糖凝胶电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,它所带净电荷多少,分子大小,第15页,4.蛋白质提取和分离,蛋白质提取和分离一般分为四步：_、_、_和_。,5.样品处理,血液由_和_构成，其中红细胞最多。红细胞具有_特点。红细胞中有一种非常重要蛋白质：_，其作用是_，血红蛋白由_个肽链构成，其中每条肽链围绕一种_基团，此基团可携带_。血红蛋白因具有_而展现红色。,红细胞洗涤洗涤红细胞目旳是_，采集血样要及时采用_分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明_，,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,血浆,多种血细胞,无细胞核，无细胞器，具有大量血红蛋白,血红蛋白,携带氧气和二氧化碳,4,亚铁血红素,一分子氧或一分子二氧化碳,血红素,清除杂蛋白,_,离心,血浆,第16页,将下层暗红色_倒入烧杯，再加入_，缓慢搅拌，低速短时间离心，如此反复洗涤三次，直至_，表明红细胞已洗涤洁净。,血红蛋白释放在_和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。,分离血红蛋白溶液将搅拌好混合溶液离心后，试管中溶液分为4层。第1层为无色透明_，第2层为白色薄层固体，是_，第3层是红色透明液体，这是_，第4层是其他杂质暗红色沉淀物。将试管中液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置半晌后，分出下层红色透明液体。,红细胞,生理盐水,上清液没有黄色出现,蒸馏水,甲苯层,脂溶性物质沉淀层,血红蛋白水溶液,第17页,透析取1mL血红蛋白溶液装入_中，将透析袋放入盛有300mL物质量浓度为20mmol/L磷酸缓冲液中，透析12 h。透析可以清除样品中_杂质，或用于更换样品_。,6.凝胶色谱操作,第一步要制作_，第二步要_，由于_，因此装柱前需要根据色谱柱内体积计算所需要凝胶量。在装填凝胶色谱柱时，不得有_存在。由于气泡会_，减少分离效果。第三步是_。,缓冲液,透析袋,分子量较小,变化不一样样大小分子蛋白质迁移次序,凝胶色谱柱,装填凝胶色谱柱,干凝胶和用缓冲液平衡好凝胶体积差异很大,气泡,样品加入和洗脱,第18页,归纳整合,一、凝胶色谱法分离蛋白质原理,凝胶色谱法也称为分派色谱法，它是根据相对分子质量大小分离蛋白质措施之一。所用凝胶实际上是某些微小多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，在小球体内部有许多贯穿通道，当一种具有多种分子样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内同步进行着两种不一样样移动，即垂直向下移动和无定向扩散运动，相对分子质量较大蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过旅程较短，移动速度较快；相对分子质量较小蛋白质分子比较轻易进入凝胶内通道，通过旅程较长，移动速度较慢。,第19页,因此，样品中相对分子质量较大分子先流出，相对分子质量中等分子后流出，相对分子质量最小分子最终流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶自身具有三维网状构造，相对分子质量大分子通过这种网状构造上空袭时阻力大，而相对分子质量小分子通过时阻力小，因此不一样样分子量蛋白质分子可以获得分离。,第20页,二、电泳作用及其原理,电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移过程。许多重要生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定pH下会带上正电或负电；在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极方向移动。电泳技术就是在电场作用下，运用待分离样品中多种分子带电性质以及分子自身大小、形状等性质差异，使带电分子产生不一样样迁移速度，从而抵达对样品进行分离、鉴定或提纯目旳。,第21页,跟踪训练,（年广东卷）（1）商品化植酸酶重要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生_，可根据其大小选择目旳菌株，所得菌株需要深入测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间_表达。,第22页,（2）运用上述所得菌株制备植酸酶流程如下图：,中重要成分为_；中包括多种酸酶等多种蛋白质。请写出一种纯化得到植酸酶措施及其根据。,_。,纯酶,发酵液,离心,菌体去除,含酶,发酵液,透析,透析液,(),去除,粗提物,(),纯化,第23页,(3)为建设基因工程菌，可用PCR等技术从上述菌株中克隆植酸酶基因。PCR反应包括一再循环，每次循环包括三步：_。反应过程中打开模板DNA双链措施是_。,(4)除植酸酶外，微生物还应用在_生产中。,第24页,解析：本题考察对微生物分离和培养、蛋白质纯化、酶活性鉴定等知识，结合实际应用。,答案：,（1）透明圈 植酸钠消耗量（肌醇和磷酸生成量）,（2）小分子杂质 凝胶色谱法：根据蛋白质之间分子大小、吸附性质等差异进行纯化（或电泳法：根据蛋白质之间电荷、分子大小等差异进行纯化）,（3）变性、复性和延伸 加热,（4）蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶,第25页,热点聚焦,第26页,DNA,粗提取,(双选)（年江苏卷）如下有关DNA和蛋白质提取与分离试验论述，对旳有（）,A.提取细胞中DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞,B.用不一样样浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可清除蛋白质,C.蛋白质提取和分离过程中进行透析可清除溶液中DNA,D.蛋白质和DNA都可以用电泳措施进行分离纯化,第27页,解析：A选项，在提取DNA时，假如是用动物细胞则需要用蒸馏水涨破，假如是用植物细胞则不能，而是用洗涤剂溶解细胞膜。用2 molLNaCl溶液溶解DNA，然后过滤出蛋白质，再减少NaCl溶液浓度，析出DNA。DNA和蛋白质样品都是带负电荷，从负极向正极移动，移动距离都和样品分子量有关。C中透析用以除去小分子物质，DNA是大分子物质。D是常规措施，如用十二烷基磺酸钠，可以根据其分子大小及所带电荷性质进行分离纯化。,答案：BD,第28页,名师点睛：提取DNA第一步是材料选用，其目旳是一定要选用DNA含量较高生物材料，否则会由于试验过程中或多或少损失而导致检测困难；第二步是DNA释放和溶解，这一步是试验成功与否关键，要尽量使细胞内DNA所有溶解；第三步是DNA纯化，即根据DNA溶解特性、对酶及高温耐受性不一样样等特性，最大程度地将DNA与杂质分开；最终一步是对DNA进行鉴定，这是对整个试验成果检测。,第29页,热点训练,在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取试验中，若需深入提取杂质较少DNA，可以根据原理是（）,A.在物质量浓度为0.14 molL氯化钠溶液中DNA溶解度最小,B.DNA遇二苯胺在沸水浴条件下会染成蓝色,C.DNA不溶于酒精而细胞中某些物质易溶于酒精,D.质量浓度为0.1 gmL柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用,第30页,解析：不溶于酒精溶液，不过细胞中某些蛋白质则溶于酒精，运用这一原理，可以将DNA与蛋白质深入地分离。,答案：C,第31页,走进试验室,第32页,基础再现,1.多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段技术，它能以很少许DNA为模板，在几小时内复制出上百万份DNA拷贝。被广泛地应用于遗传疾病诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。,试验课题：多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,第33页,2.PCR,技术,参加组成,在DNA复制中作用,解旋酶,打开,DNA,双链,DNA,母链,提供DNA复制模板,4,种脱氧核苷酸,合成子链原料,DNA,聚合酶,催化合成,DNA,子链,引物,使DNA聚合酶能够从引物3端开始连接脱氧核苷酸,第34页,（1）细胞内参与DNA复制多种构成成分及其作用,解旋酶：打开DNA双链。,DNA母链：提供DNA复制模板。,4种脱氧核苷酸：合成子链原料。,DNA聚合酶：催化合成DNA子链。,引物：使DNA聚合酶可以从引物3端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链一段碱基序列互补配对。用于PCR引物长度一般为2030个核苷酸）。,第35页,（2）DNA合成方向,DNA两条链是反向平行，一般将DNA羟基末端称为3端，而磷酸基团末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物3端开始延伸DNA链，DNA合成方向总是从子链5端向3端延伸。,(3）在80100 温度范围内，DNA双螺旋构造将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢减少后，两条彼此分离DNA链又会重新结合成双链。PCR运用了DNA热变性原理，通过控制温度来控制双链解聚与结合。,第36页,（3）在80100 温度范围内，DNA双螺旋构造将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢减少后，两条彼此分离DNA链又会重新结合成双链。PCR运用了DNA热变性原理，通过控制温度来控制双链解聚与结合。,（4）TaqDNA聚合酶应用，处理了高温导致DNA聚合酶失活问题，促成了PCR技术自动化；寻找目旳菌株时，要根据它对生存环境规定，到对应环境中去寻找；试验室中微生物筛选，是人为提供有助于目旳菌株生长条件，同步克制或制止其他微生物生长。,第37页,（5）PCR反应条件：稳定缓冲液环境、DNA模板、分别于两条模板链结合两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热DNA聚合酶、能严格控制温度变化温控设备。,（6）PCR一般要经历三十一再循环，每次循环可以分为变性（）、复性（）和延伸（）三步。从第二轮循环开始，上一次循环产物也作为模板参与反应。DNA聚合酶只能特异性地复制处在两个引物之间DNA序列，使这段固定长度序列呈指数扩增。,第38页,过程设计,1.,按配方将所需试剂摆放在试验桌上（准备）。,2.,用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）。,3.,盖严离心管口盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）。,4.,将微量离心管放在离心机上（离心）。,5.,将离心管放入,PCR,仪上，设置好,PCR,仪循环程序（反应）。,第39页,易错归纳,1.PCR试验很轻易出现假阳性或假阴性成果。出现假阴性成果常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到克制；引物设计不合理；提取模板质量或数量不过关以及PCR系统建立欠妥当；循环次数不够，等等。当试验中出现假阴性状况时，应首先在本来扩增产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增长510次循环。为了防止假阴性成果出现，在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好酶。同步，在提取DNA模板时，应尤其注意防止提取物中具有克制酶活性污染物，如酚、氯仿等存在。尽TaqDNA聚合酶对模板纯度规定不高，但也不容许有机试剂污染。PCR扩增先决条件以及特异性高下，很大程度上取决于引物与靶DNA互补状况，尤其需要保证引物3端与靶基因互补。,第40页,2.PCR技术高度敏捷，极其微量靶基因污染都会导致非目旳DNA片段大量扩增，因此模板DNA污染是PCR假阳性成果重要原因。此外，样品中存在靶基因同源序列也也许导致假阳性成果。为了防止因污染而导致假阳性成果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。,第41页,精题演练,1.如下有关PCR描述，不对旳是（）,A.是一种酶促反应,B.引物决定了扩增特异性,C.扩增产量按y（1X）n,D.扩增对象是氨基酸序列,2.PCR反应需要条件为缓冲溶液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热DNA聚合酶，为何？_。,在PCR反应中，与解旋酶作用相似操作是：_。,第42页,解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段技术，它以很少许DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物作用下使DNA聚合酶从引物3端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份DNA拷贝，其扩增产量为y（1X）n，y代表DNA片段扩增后拷贝数，X表达平均每次扩增效率，n代表循环次数，扩增对象是DNA序列。,答案：D,2.PCR 反应本质是DNA复制，其需要条件类似于生物体内DNA复制 95 变性,第43页,课时作业,第44页,1.在哪个温度范围内，DNA双螺旋构造解开（）,A.1020 B.80100,C.2030 D.4060,解析：,蛋白质大多不能忍受,6080,高温，而,DNA,在,80,以上才会变性。,答案：,B,第45页,2.在制备鸡血细胞液过程中，加入柠檬酸钠目旳是（）,A.防止凝血 B.加紧DNA析出,C.加紧DNA溶解 D.加速凝血,解析：柠檬酸钠作用是运用柠檬酸根离子与血浆中Ca2+离子结合成柠檬酸钠，减少Ca2+离子浓度，使有关凝血酶活性减少。因此柠檬酸钠是抗凝血物质，防止凝血，有助于鸡血细胞液制备。,答案：AD,第46页,3.DNA粗提取试验材料中有三次过滤：（1）过滤用蒸馏水稀释过鸡血细胞液；(2)过滤含粘稠物0.14 mol/L NaCl溶液；(3)过滤溶解有DNA2 mol/L NaCl溶液。以上三次过滤分别为了获得（）,A.含核物质滤液、纱布上粘稠物、含DNA滤液,B.含核物质滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA滤液,C.含核物质滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上DNA,D.含较纯DNA滤液、纱布上粘稠物、含DNA滤液,第47页,解析：用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质滤液，这种滤液必须通过试验中其他环节得相继处理，方能得到较纯DNA。DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可通过滤留在纱布上。,答案：A,第48页,4.一种由15N标识DNA分子，放在没有标识环境中培养，运用PCR循环5次后含标识DNA分子占总数（）,A.1/10 B.1/5,C.1/16 D.1/25,第49页,解析：一种DNA分子运用PCR技术循环5次后产生DNA分子数目为2n。而DNA复制是半保留复制，其特点是：新形成DNA双链，一条是来自亲代DNA分子母链，另一条是新形成子链。这样最初由15N标识DNA分子复制后，其标识两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标识了。后来均是在没有标识环境中培养，不管通过多少次复制，最初标识两条链一直存在于两个DNA分子占总数，这样通过n次循环后，标识DNA分子占总数2/2n,即1/2n-1。,答案：C,第50页,9填写本试验完毕如下试验操作时所用试剂。,(1)提取鸡血细胞中核物质：。,(2)溶解核内DNA：。,(3)析出2 mol/L NaCl溶液中DNA：。,(4)DNA粘稠物再溶解：。,(5)提取杂质较少DNA白色乳状丝状物：。,(6)DNA鉴定：。,第51页,答案：,(1),蒸馏水,(2)2 mol/LNaCl,溶液,(3),蒸馏水,(4)2 mol/L NaCl,溶液,(5),冷却,95%,酒精,(6),二苯胺,第52页,祝,您,学业有成,第53页,