藏药甘青乌头化学成分的研究---大学论文.doc

学 院 化 学 与 生 物 技 术

专 业 化学专业

届 别 2014届

题 目 藏药甘青乌头化学成分的研究

学生姓名

学 号 201013409116

指导教师

教 务 处 制

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日期： 年 月 日

目 录
摘要 ….1
关键词 .1
1. 前言 1
1.1乌头属简介 2
1.2乌头属药用植物的毒性介绍 2
1.3甘青乌头简介 3
2．实验部分 3
2.1 实验仪器与试剂 3
2.2甘青乌头浸膏的提取和洗脱分离方法 4
2.2.1化合物1的提取和洗脱分离 4
2.2.2化合物2的提取和洗脱分离 4
2.3洗脱和鉴定技术的方法原理以及化合物的分析鉴定
2.3.1样品洗脱分离方法原理 4
2.3.2化合物结构分析鉴定方法原理 5
2.3.3化合物1的分析鉴定 5
2.3.4化合物2的分析鉴定 5
3. 参考文献 6
4. 附件 7
致谢 14

藏药甘青乌头化学成分的研究

摘要：本文研究目的:研究甘青乌头（Aconitum tanguticum(Maxim.)Stapf）的化学成分。方法：全株甘青乌头粉末在乙醇中超声提取，回收提取液，得到浸膏。对浸膏采取萃取，旋转蒸馏等一系列操作，采用硅胶，SephadexLH-20凝胶，半制备高效液相等多种分离纯化技术进行化合物的洗脱分离纯化。通过MS，核磁共振等波谱技术鉴定化合物结构。结果从甘青乌头中分离鉴定得到2个化合物。分别为化合物1：咖啡酸(Coffee acid)和化合物2：3, 4-二羟基苯乙醇( 3, 4-dihydroxyphenethyl alcohol )。

关键词：甘青乌头；乌头属植物；化学成分；结构鉴定

Abstract:
In this paper, we isolated two compounds 1: Coffee acid and 2: 3, 4-dihydroxyphenethyl alcohol from the whole plant of Aconitum tanguticum. Chemical constituents were isolated and purified the title plant bu using a combination of various chromatographic techniques including column chromatography over silica gel, Sephadex LH-20 gel, Preparative HPLC. Their structure were determined by NMR, MS spectrogram.
Key words: Aconitum tanguticum; the genus Aconitum; Chemical composition; Structure identification
1. 前言
1.1 乌头属简介
乌头属（Aconitum）植物属于毛茛科（Ranunculaceae）,全世界约有350种，广泛分布于北半球温带地区。我国乌头属植物约有200种，分布广泛，除海南外，台湾和大陆各省区都有分布大多数分布于西南横断山区，如云南北部、四川西部、西藏东部的高山地带，其次分布于东北各省[1]。其中，青藏高原及其临近地区，包括四川、云南、西藏、青海、甘肃和宁夏是乌头属植物最丰富的地区，共有该属植物的全部3亚属约170个种[2]。在丰富的药用植物资源中，乌头属植物是被子植物中较大的药用属，有丰富的药用品种。乌头属植物是传统的药用植物，在我国乌头属植物有着悠久的药用历史，是我国各民族传统医药中常用的有毒植物药物。在丰富的药用植物资源中，乌头属植物是被子植物中较大的药用属，有丰富的药用品种。乌头属植物多具有祛风除湿和温经止痛之功效，主治跌打损伤、关节炎、神经性疼痛、中风瘫痪、胃冷痛、胃肠炎、月经不调和痈疽疮毒等症，但是，乌头属植物多具有显著的毒性，毒副作用成为限制乌头属植物药用的主要因素。我国各民族在长期的生产生活实践中，积累了丰富的乌头属药用植物“制毒”、用药经验，藏、苗、维、土家等我国少数民族在乌头属植物药用方面更因环境、文化、医学理论的各异而形成了不同用药习惯与方法[3]。乌头属植物是传统的药用植物，在我国约有76种可供药用，常用药材主要有乌头(川乌)、附子、北乌头(革乌)、黄花乌头（关白附)、短柄乌头（雪上一枝蒿）和甘青乌头等[4]。头属植物具有较高的药用价值和开发前景。但同时乌头属的植物又具有极大毒性，临床用之得当，每能起顽疾;用之不适，则有严重的毒副作用。地方和民间可用的药用种主要有铁棒锤、黄草乌、瓜叶乌头和聚叶花草乌头（活血莲）等。近年来其他许多品种也有大量生产和应用，如甘肃产的高乌头，其根含拉马巴乌头碱，有良好的镇痛作用，可用于治疗胃癌、肝癌和肺癌等，且无成瘾性，现已提取生产，而且引种栽培已成功[5]。伏毛铁棒锤是宁夏回族民间用药，经化学成析和药理研究，发现所含总生物碱有较强的抗炎、镇痛和局麻作用，现已成为当地大宗商品药材[6]。

1.2乌头属药用植物的毒性研究
据《中国有毒植物》记载，我国有毒植物约有1 300种，分布于140科，如毛茛科、百合科、豆科和杜鹃花科等。毛茛科是含有毒植物种类最多的科之一，约20属的植物有毒。
其中乌头属是我国最早记载的有毒植物。在我国本草著作诞生以前，乌头是以“堇”的名称出现的，左丘明《国语》记载有“堇于肉”用以毒人，堇就是乌头。前汉刘安编著的《淮
南子》一书中则更明确地指出“天下之凶药，莫凶于鸡毒”，鸡毒就是乌头。据考证，作为狩猎毒物的乌头，可能是东鎢各国的主要箭毒原料。由此可见，乌头属植物不仅具有药理活性，而且也具有较强的毒性。据《中国植物志》( 27卷)记载，乌头属大多数植物的根或者草均具有较强的毒性，有报道生川乌的块根2-4 g即可使人致死。近年来，乌头属植物及其制剂的中毒在我国颇为多见，死亡率较高。从化学成分看，乌头类的双酯型生物碱既是该类植物的生理活性物质，同时也是引起中毒的主要毒性物质。如乌头碱口服0. 2 mg即可中毒，3-5 mg可使人致死;肌肉注射0. 2-0. 3 mg可引起死亡。从毒性角度来看，乌头类中药中的主要毒性成分为双脂型生物碱、单脂型生物碱和氨基醇型生物碱。其中双脂型生物碱的毒性最大，主要有乌头碱、新乌头碱和次乌头碱3种，属于难溶于水的脂溶性成分；单脂型生物碱是双脂型生物碱C8位上的乙酰基水解失去一分子乙酸后的产物。属于亲水性成分，毒性较小，为双脂型生物碱的1/2 000；胺基醇型生物碱是脂型生物碱C14位上苯甲脂酰基水解失去一分子苯甲酸后的产物，属强亲水性成分，毒性甚微，仅是双脂型生物碱的1/2 00- 1/4 000。通常认为这3类生物碱既是乌头类中药的有效成分，也是其毒性成分[7]。乌头经过传统的炮制方法如盐溶液浸泡、水煮、硫磺熏等，双酯型乌头碱转化成乌头次碱和乌头原碱，毒性降低，但其药物效应并未明显降低。
乌头类生物碱中毒症状出现很快，主要表现为流诞、恶心、呕吐、腹泻、头昏、口舌四肢及全身发麻、呼吸困难、手足抽搐、神志不清、血压及体温下降和心律紊乱等，最后因呼吸及心脏衰竭而死亡。乌头碱毒性主要是对神经和心血管系统造成严重伤害。乌头碱先兴奋后麻痹感觉神经和中枢神经，其次是兴奋胆碱能使神经和呼吸中枢而出现一系列M样和N样症状，最后则由于呼吸麻痹和中枢抑制而导致机体死亡；心脏的毒性是其对钠通道的激动作用。心律失常、室颤以及猝死是乌头碱导致心肌兴奋性增高、促进膜去极化而产生异位节律的结果。研究证明，奎尼丁和裸翠雀亭等可抑制心肌细胞钠离子内流，而能对抗乌头碱引起的心律失常；高浓度的镁离子可抑制乌头碱引起的室颤与碎死[8]。乌头碱对乳鼠心肌细胞有明显的氧化损伤作用，同时表现出较强的细胞毒性[9]。乌头碱中毒后用阿托品解毒最有效，也可用普鲁卡因。由于乌头属药用植物大多毒性较强，因此这类药物一般要经过炮制后才能用于临床。常用的炮制方法有盐溶液浸泡、水煮、硫磺熏等多种方法，临床应用乌头属药用
植物时，除经炮制降低其毒性外，还应严格控制其用量、注意配伍禁忌、延长煎煮时间来预防这类药物中毒事件的发生。

1.3 甘青乌头简介
甘青乌头Aconitum tanguticum为毛茛科乌头属植物甘青乌头的干燥全草，是多年生草本植物，块根小，纺锤形或倒圆锥形，长约2厘米，茎高8-50厘米，不分枝或分枝。基生叶7-9枚，叶片圆形或圆肾形，顶生总状花序有3-5花；苞片线形，萼片蓝紫色，偶尔淡绿色，上萼片船形，下萼片宽椭圆形或椭圆状卵形；花瓣稍弯，瓣片极小，种子倒卵形，具三纵稜，只沿稜生狭翅，7-8月开花[10]。生长于海拔3200-4800m的高山草甸及碎石带，主要分布于青海东部、西藏南部、甘肃南部、四川西部和云南西北部，陕西秦岭也有分布，为藏医常用药物榜嘎的药材来源之一。榜嘎始载于藏医的医药古籍《月王药诊》(公元710年)中，其后《四部医典》、 《四部医典注释本》、 《晶珠本草》等历代藏医药书籍中均有记述。榜嘎性凉、味苦，有小毒，具清热解毒功效，多入丸散用于治疗传染病发热，流行性感冒和食物中毒等。现代药理研究表明甘青乌头具有抗炎，抗病毒，抗癌等多种药理活性[11]。
甘青乌头内的生物碱类化合物具有心血管系统、中枢神经系统、抗炎、抗病毒、保肝、抗癌等多方面的药理活性。二萜类化合物是其中一类，这类化合物的多数都具有α、β-不饱和双键结构片断目前发现的二萜类生物碱大部分在药理方面表现为既是有效成分又是毒性成分，它们的结构和活性之间有着密切的关系。乌头碱类化合物的各种单体对急性炎症模型均具有抑制作用，仅在强度上稍有差异；而对慢性炎症的作用,不同的实验研究结果有差异。二萜生物碱是该属植物的主要及特征性化学成分。实验研究表明它们中间很多具有较强的生物活性，具有很好的研究前景和应用开发价值。目前国内外对于甘青乌头的生物活性研究还未见报道[12]。

2. 实验部分
2.1 实验仪器与试剂

所用试剂：纯净水、蒸馏水、甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚。显色剂：5%的稀硫酸溶液，固体碘。

所用仪器：产品指标：粒度：100-200，200-300，300-400mm的柱层层析硅胶，加热减量<2.0%,氯化物<0.02%,铁<0.02%，pH（10%水悬浮液）6.0-7.0；厂地：青岛海洋化工厂分厂。MCI-gel CHP-20P (75-150 μm)规格的填充材料：MCI。Merck公司生产的Sephadex LH-20凝胶。硅胶板高效板，GF254，规格：200×200mm,厚度：0.20-0.25mm，产地：青岛海洋化工厂分厂。不锈钢电热板，SG-1501A，厂地：上海硕光电子科技有限公司。旋转蒸发仪，规格：N-1100D-WD（18ml/min），厂地：云南科仪化玻有限公司。SHZ-D循环水式真空泵，产地：巩义市予华仪器有限责任公司。一次性使用无菌注射器，棉花，厂地：南宁双健医疗器械有限责任公司。数控超声波清洗器，规格：AS20500A，厂地：云南科仪化玻有限公司。DF-4型压片机，厂地：天津市港东科技发展有限公司。高效液相色谱仪规格：1260，编号：S20120834，厂地：云南科仪化玻有限公司。400M（Bruker）核磁共振仪，厂地：美国。

2.2 甘青乌头浸膏的提取与洗脱分离方法
2.2.1 化合物1的提取与洗脱分离
5.4 Kg全株甘青乌头粉末在95%的乙醇中超声提取11次，每次3小时，把每一个乙醇提取液用旋转蒸发器蒸出溶剂，回收利用。得到浸膏794.0 g，用适量的40℃热水搅拌溶解浸膏，等到冷却后倒入适量的石油醚进行萃取，分离石油醚相作旋蒸得到石油醚萃取部分的浸膏为：101.0 g；再用氯仿萃取水相，蒸出提取液后得到浸膏：71.0 g；最后用乙酸乙酯萃取，蒸出提取液后得到浸膏：61.0 g。水相部分浸膏：523.0 g。
61 g乙酸乙酯部分的浸膏和50.0 g硅胶拌样，约800mL，387.0 g硅胶填柱。用乙酸乙酯：甲醇=2：1的混合溶剂洗脱得组分A，再过二次凝胶（纯甲醇作为洗脱剂），通过TLC合并后得样品B1、B2。
样品B2过液相，以甲醇：水=3：7的洗脱剂冲洗，得化合物1。
化合物1淡绿色固体，荧光弱显，碘显呈黄色，烤板呈淡褐色，m=7.20 mg，用石油醚：乙酸乙酯=4：3的体系作为展开剂，Rf = 0.33。
2.2.2 化合物2的提取与洗脱分离
71.0 g浸膏来自氯仿部分加入甲醇和乙酸乙酯的混合溶剂溶解后和60.0 g硅胶拌样，用495.0 g（200-300目）的硅胶填柱。当洗脱剂为乙酸乙酯时洗脱下来的样品量（17.0 g）。标志为：D。
样品D再过MCI，以甲醇和水作为混合洗脱体系，甲醇百分含量为：60%时洗脱下来的样品D1的量（8.0 g）。
样品D1过凝胶用纯甲醇为洗脱剂，经TLC显色合并后过半制备高效液相，得到化合物2。

2.3 化合物的洗脱和分析鉴定
2.3.1样品洗脱分离技术原理

柱层析硅胶：是具有固体特性的胶态体系，由形成凝集结构的胶体粒子构成。胶体粒子的集合体的间隙形成试剂柱层析硅胶颗粒内部的微孔隙结构。因此，它是一种具有丰富微孔结构，高比表面积、高纯度、高活性的优质吸附材料。柱层析硅胶精选透明度高的优质硅胶制成，优良的吸附性能，对性质、结构相似乃至同分异构体都有理想的分离功能。柱层析硅胶具有良好的热稳定性和化学稳定性能，从多组分溶液中有选择地吸附提纯同分异构体组分。柱层析硅胶纯度高达99%以上，与有机柱填料相比，硅胶为固体以SiO2为基质的胶体，结构致密。

高效液相色谱仪（HPLC）：高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时， 经过反复多次的吸附解吸的分配过程， 各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时， 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

2.3.2 化合物结构分析鉴定方法技术原理

核磁共振仪（NMR）：是一种生物磁自旋成像技术，它是利用原子核自旋运动的特点，在外加磁场内，经射频脉冲后产生信号，用探测器检测并输入计算机，经过处理转换在屏幕上显示图像。在利用核磁共振的原理分别对化合物进行检测，利用核磁技术能更快更准确的分析出实验所得化合物的成分，并能写出它的化学式，对实验的鉴别起到了最重要的作用。是本实验最重要的一个部分。通过对比该化合物文献的核磁谱图就能充分的肯定实验所提取化合物。

质谱（MS）：是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。质谱仪器一般由样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统等部分组成。

2.3.3 化合物1的分析鉴定
咖啡酸(Coffee acid)。ESI-MS m/z:179[M－H]－, 203[M＋Na]+; 1H-NMR ( 400MHz, CO3OD ) δ: 6.23 ( 1H, d, J = 16.0 Hz, H-7 ), 6.77 ( 1H, d, J = 8.4 Hz, H-5 ), 6.92 ( 1H, dd, J = 8.4, 1.6 Hz, H-6 ), 7.03 ( 1H, d, J = 1.6 Hz, H-2 ), 7.49 ( 1H, d, J = 16.0 Hz, H-8 ); 13C-NMR ( 100MHz, CO3OD ) δ: 115.0 ( C-2 ), 116.5 ( C-5 ), 116.7 ( C-8 ), 122.7 ( C-6 ), 128.0 ( C-1 ), 146.2 ( C-7 ), 146.7 ( C-3 ), 149.2 ( C-4 ), 170.3 ( C-9 )。与参考文献[13]基本一致。

2.3.4 化合物2的分析鉴定
3, 4-二羟基苯乙醇( 3, 4-dihydroxyphenethyl alcohol )。ESI-MS m/z: 153[M－H]－, 177[M＋Na]+; 1H-NMR ( 400MHz, CO3OD ) δ: 2.66 ( 2H, t , J = 7.2, 7.2Hz, H-7 ), 3.67 (2H, t , J = 7.2, 7.2Hz, H-8 ), 6.53 ( 1H, d, J = 8.0Hz, H-6 ), 6.66 (1H, s, H-2 ), 6.68 ( 1H, d, J = 8.0Hz, H-5 ); 13C-NMR ( 100MHz, CO3OD ) δ: 39.6 ( C-7), 64.6 ( C-8 ), 116.2 ( C-5 ), 117.0 ( C-2 ), 121.2 ( C-6 ), 131.7 ( C-1 ), 144.5 ( C-4 ), 146.0 ( C-3 )。与参考文献[14]基本一致。

3. 参考文献
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[3]. 李志勇，李彦文，图雅，黄秀兰，张嫚，崔箭. 乌头属植物在少数民族医药中的应用[J]. 中央民族大学学报（自然科学版），第19卷第2期，2010.5.
[4]. 饶冉. 乌头属药用植物研究进展[J]. 安徽农业科学，2012,40(29):14227-14230.
[5]. 张继，王一峰. 高乌头资源的开发利用研究[J]. 中国野生植物资源，1998,17(1):10-12.
[6]. 陈永康，刘茂坤. 家种与野生雪上一枝篙总生物碱毒性及药理的比较研究[J]. 中国民族民间医药杂志，1997(1):38.
[7]. 周玲. 乌头类中药化学成分及其生物碱含量测定方法的研究概况[J]. 中国中医药现代远程教育，2011,9(2):223-224.
[8]. 周远鹏等. 附子及其主要成分的药理作用和毒性[J]. 药学学报，1983,18(5):394-400.
[9]. 王衍堂，李宏霞. 乌头碱对乳鼠心肌细胞的毒性作用[J]. 华西药学杂志，2007 ,22 (1) ;4-6.
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[11]. 罗明，林丽美，李春，王智民，郭五保. 藏药甘青乌头化学成分的研究[J]. 中国中药杂志，第37卷9期，2012.5.
[12]. 瞿燕. 藏药榜嘎总生物碱的抗炎实验研究[J]. 时珍国医国药，2009.20(10):2412.
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4. 附件
4.1 化合物1结构、核磁C，H谱图和MS谱图

化合物1结构式
化合物1的氢谱图
化合物1的碳谱图1

化合物1的碳谱图2

化合物1的MS谱图

4.2 化合物2的结构、核磁C，H谱图 和MS谱图

化合物2的结构式
化合物2的氢谱图

化合物2的碳谱图

化合物2的MS谱图

致 谢
通过一段时间的努力和付出，我的毕业论文《藏药甘青乌头的化学成分研究》终于完成了，这也意味着我的大学四年生活即将结束。在大学阶段，我在学习和思想上都受益匪浅，这除了自身的努力外，和各位老师、同学和朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。
本论文是在李干鹏老师的悉心指导下完成的。从毕业设计题目的选择、到选到课题的研究和论证，再到本毕业设计的编写、修改，每一步都有李老师的细心指导和认真的解析。在李老师的指导下，我在各方面都有所提高，老师以严谨求实 朴实无华平易近人的人格魅力对我影响深远，一丝不苟的治学态度和勤勉的工作态度深深感染了我，给我巨大的启迪，鼓舞和鞭策，并成为我人生路上值得学习的榜样。使我的知识层次又有所提高。在此诚恳的向老师说声“谢谢”。同时感谢所有教育过我的专业老师，你们传授的专业知识是我不断成长的源泉也是完成本论文的基础。同时还有特别感谢云南民族大学研究生罗阳师兄的支持和帮助，是他在我实验过程中的悉心帮助和耐心讲解、指导，论文写作时遇到难题时帮我找到大量资料，解决难题。本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助，再次真诚感谢所有帮助过我的老师同学。
通过这次毕业设计我收获了不少，不仅提高了我独立思考问题解决问题的能力而且培养了认真严谨，一丝不苟的学习态度。由于经验匮乏，能力有限，设计中难免有许多考虑不周全的地方，希望各位老师多加指教！

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