胶回收(课堂PPT).ppt

,生物实验培训,理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操,爱苏生物,口腔快检,基因检测,科研服务,健康管理,广 东 爱 苏 生 物 科 技 有 限 公 司,胶回收,生物实验培训系列之九,胶回收基础知识,一,目 录,试剂耗材与设备,三,操作流程,四,常见问题解答,五,方法及应用,二,胶回收基础知识,一,目 录,试剂耗材与设备,三,操作流程,四,常见问题解答,五,方法及应用,二,1.,胶回收的概念,2.,胶回收的原理,1.1,胶回收概念,从电泳后的凝胶中回收目的,DNA,的过程，其目的是将目标,DNA,重新利用。,Lane M:1kb DNA Marker,Lane 1:,胶回收前的,2.7kb DNA,段,Lane 2:,胶回收后的,2.7kb DNA,段,切割,Lane 1,后，经处理回收,DNA,，经电泳得到,Lane 2,。,切割,回收,4,1.2,胶回收原理,利用核酸在裂解液下与硅胶膜吸附柱特异性结合，在洗脱液条件下被洗脱，从而达到核酸纯化回收的目的。,电泳后，切下凝胶,称重后，加入等体积溶胶液,上柱吸附,DNA,除胶,脱盐,洗脱,5,胶回收基础知识,一,目 录,试剂耗材与设备,三,操作流程,四,常见问题解答,五,方法及应用,二,1.,分类,2.,应用,2.1,分类,7,2.1.1,硅胶柱法,采用可以高效、专一结合,DNA,的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从凝胶中回收,DNA,片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子等杂质。,最简单快速的回收方法。,不适合用于大片断的回收。,8,2.1.2,玻璃奶,/,纯化填料法,利用特殊玻璃微珠吸附,DNA,的特性，根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。,适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收。,玻璃奶,/,纯化,填料法,9,2.1.3,低熔点琼脂糖法,传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在,TE,溶液中,65,保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。,这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现已较少使用。,10,2.1.4,透析带电洗脱法,切下的条带放在充满,TAE,的透析带中电泳，让,DNA,跑出凝胶，跑向溶液中，再通过反向电泳，将附在透析带上的,DNA,赶回溶液中，取溶液部分，再用,TAE,洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀。再次电泳后的胶通常还要再染色看看残留。,由于绑透析带很难操作，只有在回收非常大的片断时才会考虑的。,丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。,11,2.1.5 DEAE,纤维素膜纸片法,将,DEAE,纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的,DEAE,纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳，条带上的,DNA,被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液,65,保温洗脱，直到膜上,DNA,被完全洗脱，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。,早期实验室最常用方法之一。,这个方法不适合做较大的,DNA,，因为洗脱比较困难。,12,2.2,应用,13,克隆,测序,文库筛选,限制性酶切,连接,胶回收基础知识,一,目 录,试剂耗材与设备,三,操作流程,四,常见问题解答,五,方法及应用,二,1.,试剂,2.,耗材,3.,设备,3.1,试剂,产品组成,平衡液,BL,（,Buffer BL,）,溶胶液,PN,（,Buffer PN,）,漂洗液,PW,（,Buffer PW),洗脱缓冲液,EB,（,Buffer EB,）,吸附柱,CA2,（,Spin Columns CA2,）,收集管（,2mL,）（,Collection Tubes 2mL),15,3.2,耗材,各种规格移液枪、枪头,离心管,16,3.3,设备,离心机,17,水浴锅,3.3,设备,凝胶成像系统,水平电泳仪,18,胶回收基础知识,一,目 录,试剂耗材与设备,三,操作流程,四,常见问题解答,五,方法及应用,二,1.,实验流程,2.,注意事项,4.1,实验流程,向吸附柱,CA2,柱,加入,500L,平衡液,BL,1,4.1.1,柱平衡步骤,12000rpm,离心,1min,2,弃废液，将吸附柱重新放回收集管中,3,20,4.1,实验流程,将目的条带从,琼脂糖凝胶中,切下,1,4.1.2,切胶，称重,放入干净的,离心管中,2,称取重量,3,21,4.1,实验流程,向胶块中加入,等体积溶液,PN,1,4.1.3,溶胶,50,水浴，不,断温和地上下翻,转离心管，确保,胶块充分溶胶,。,2,注：,1.,如果凝胶重,0.1g,，其体积可视为,100L,，则加入,100L,溶液,PN,。,2.,若胶块未完全溶胶，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解。,22,4.1,实验流程,将所得溶液加入,一个吸附柱,CA2,中，室温放置,2min,1,4.1.4,吸附,DNA,12000rpm,离心,3060sec,2,弃废液，将吸附柱重新放回收集管中,3,注：吸附柱容积为,800L,，若样品体积大于,800L,可分批加入。,23,4.1,实验流程,向吸附柱,CA2,中,加入,L,漂洗液,PW,1,4.1.5,洗去杂质,12000rpm,离心,3060sec,2,弃废液，将吸附,柱重新放回收集管中。重复操作,1,2,3,3,注：,1.,漂洗液,PW,使用前先检查是否已加入无水乙醇。,2.,如果回收的,DNA,是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议,PW,加入后静置,25min,再离心。,24,4.1,实验流程,将吸附柱,CA2,放回收集管中,1,4.1.6,去除漂洗液,12000rpm,离心,2min,2,将吸附柱,CA2,置于室温放置数分钟，,晾干,3,注：,1.,尽量除尽漂洗液，以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的实验（如酶切、,PCR,等）。,25,4.1,实验流程,将吸附柱,CA2,放到一个干净离心管中,1,4.1.7,收集,DNA,向吸附膜中间,位置悬空滴加适量,洗脱缓冲液,EB,，,室温放置,2min,2,12000rpm,离心,2min,收集,DNA,溶液,3,26,原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。,利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。,4.1,实验流程,4.1.8,结果分析,-,琼脂糖凝胶电泳,27,不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围,琼脂糖浓度（）,DNA,有效分离范围（,Kb,）,0.5,30,1,0.7,12,0.8,1.0,10,0.5,1.2,7,0.4,1.5,3,0.2,4.1,实验流程,28,在锥形瓶中加入,1mL 50 xTAE,、,49mL,蒸馏水、,0.4g,琼脂糖，混匀；,放,入微波炉中加热，约煮沸,三次，冷却至不,烫手；,加入,2.5LNuclleic,Acid Stain,核酸染料，轻轻摇匀,，避免,产生气泡，,倒入已垂直插好梳子的铺,胶版,中，待凝固。,琼脂糖凝胶制作,上样,电泳,取,1L,上样缓冲液与,5L,产物混匀,垂直加入上样孔中。,电泳条件：,140V,，,20min,。,4.1,实验流程,4.1.8,结果分析,-,琼脂糖凝胶电泳,29,4.2,结果分析,琼脂糖凝胶电泳,将电泳结束后的凝胶放在凝胶成像,系统中拍照保存。,对结果进行分析：,看有无目的带,看是否存在非特异带,看条带亮度,切割,回收,30,4.2,注意事项,1.,洗脱体积不应小于,30L,，体积过少影响回收效率。洗脱液的,pH,值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用,ddH,2,O,做洗脱液，并保证其,pH,值在,7.08.5,范围内，,pH,值低于,7.0,会降低洗脱效率。,31,4.2,注意事项,2.,平衡液,BL,的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温,/,潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响。使用前请先检查平衡液,BL,是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在,37,水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。,32,4.2,注意事项,3.,电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。,4.,如下一步实验要求较高，则应尽量使用,TAE,电泳缓冲液。,.,如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测,pH,值，如,pH,值大于,7.5,，可向含有,DNA,的胶溶液中加,1030L3M,醋酸钠（,pH5.2),将,pH,值调制,57,之间。,33,4.2,注意事项,.,切胶是，紫外照射时间应尽量短，以免对,DNA,造成损伤。,7.,回收,10kb,的,DNA,片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。,8.,回收率与初始,DNA,量和洗脱体积有关，初始量越少、洗脱体积越少，回收率越低。,34,胶回收基础知识,一,目 录,试剂耗材与设备,三,操作流程,四,常见问题解答,五,方法及应用,二,5,常见问题解答,36,36,问题,可能原因,用胶回收试剂,盒从凝胶中回,收,DNA,得率低,是什么原因？,胶溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例,胶体积太大，可用枪头捣碎，若不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收,紫外灯下切胶时间过长，导致,DNA,部分降解，应尽量把切胶时间控制,在,30s,以内,洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率,TAE,电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致,pH,值升高，降低,DNA,和膜的吸,附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好,回收前的样品量太少，加大点样量,洗脱前，预先,65,预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可,以有效提高回收率,30%,以上,5,常见问题解答,37,问题,解决方法,加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？,胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶,胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收,水浴温度是否达到规定温度,65,，用温度计检测,琼脂糖凝胶块不溶？,琼脂糖质量不好,含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于,4,或,-20,制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧,问题解答,胶回收标准实验流程,试剂耗材与设备,试剂产品组成,平衡液,BL,（,Buffer BL,）,溶胶液,PN,（,Buffer PN,）,漂洗液,PW,（,Buffer PW),洗脱缓冲液,EB,（,Buffer EB,）,吸附柱,CA2,（,Spin Columns CA2,）,收集管（,2mL,）（,Collection Tubes 2mL),耗材,移液枪,枪头,离心管,设备,凝胶成像系统,离心机,水浴锅,水平电泳仪,胶回收标准实验流程,实验流程,向吸附柱,CA2,柱,加入,500L,平衡液,BL,1,12000rpm,离心,1min,2,弃废液，将,吸附柱重新放回收集管中,3,柱平衡,步骤,将目的条,带从琼脂糖,凝胶中切下,1,放入干净的,离心管中,2,称取重量,3,切胶,胶回收标准实验流程,实验流程,溶胶,吸附,向胶块中加入,等体积溶液,PN,1,50,水浴，不,断温和地上下翻,转离心管，确保,胶块充分溶胶,。,2,将所得溶液加,入,一个吸附柱,CA2,中，室温放置,2min,1,12000rpm,离心,3060sec,2,弃废液，将吸,附柱重新放回收集管中,3,胶回收标准实验流程,实验流程,除杂质,去漂洗液,向吸附柱,CA2,中,加入,L,漂洗液,PW,1,12000rpm,离心,3060sec,2,弃废液，将吸,附柱重新放回收,集管中。重复操作,1,2,3,3,将吸附柱,CA2,放回收集管中,1,12000rpm,离心,2min,2,将吸附柱,CA2,置于室温放置数分钟，晾干,3,胶回收标准实验流程,实验流程,将吸附柱,CA2,放到一个干净离心管中,1,向吸附膜中间,位置悬空滴加适量,洗脱缓冲液,EB,，,室温放置,2min,2,12000rpm,离心,2min,收集,DNA,溶液,3,收集,收集,胶回收标准实验流程,实验流程,结果分析,在锥形瓶中加入,1mL 50 xTAE,、,49mL,蒸馏水、,0.4g,琼脂糖，混匀；,放,入微波炉中加热，约煮沸,三次，冷却至不,烫手；,加入,2.5LNuclleic,Acid Stain,核酸染料，轻轻摇匀,，避免,产生气泡，,倒入已垂直插好梳子的铺,胶版,中，待凝固。,琼脂糖凝胶制作,上样,电泳,取,1L,上样缓冲液与,5L,产物混匀,垂直加入上样孔中。,电泳条件：,140V,，,20min,。,谢谢聆听！,