小鼠灌肠装置的改进与应用.pdf

济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2023.04.002小鼠灌肠装置的改进与应用孙芳1黄家辉1孙菲2颜晓智1张祺莲1,3徐正光1刘研展1陶春雪1姚静1基金项目国家级大学生创新创业训练计划项目(201810443007,cx2018019);济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金项目(JYHL2021MS30);山东省中医药科技青年项目(2020Q060);济宁医学院大学生创新训练计划项目(cx2022017z);齐鲁医药学院大学生创新训练计划项目(cxcy2019019)通信作者姚静,E-mail:yjing_87 (1济宁医学院基础医学院,济宁 272067;2齐鲁医药学院临床医学院,淄博 255300;3潍坊医学院基础医学院,潍坊 261000)摘 要 目的 改进小鼠灌肠实验装置,优化小鼠灌肠实验方法,解决传统灌肠方法的不足。方法使用6Fr 导尿管联合自制肛塞改进小鼠灌肠装置,优化小鼠灌肠方法,通过小鼠灌肠实验,与传统灌肠方法进行比较。将 60 只雌性昆明小鼠随机分为 5 组(n=12),空白组不做处理,A、B、C 组分别使用传统方法中的聚乙烯管、直头灌胃针、6Fr 导尿管进行实验,D 组使用改良后的灌肠装置 6Fr 导尿管联合自制肛塞进行实验,每组均给予 0.4ml生理盐水进行灌肠,每日 1 次,连续 14d。记录对比各组小鼠的一般状态及生存率;观察灌肠后漏液情况并进行评分;收集灌肠 14d 后小鼠的新鲜粪便并综合粪便性状和隐血或血便情况进行粪便评分;实验结束后,剖取肠组织,通过 HE 染色观察肠组织病理损伤情况。结果C、D 组小鼠一般状态稍好于 A、B 组,各组间小鼠的存活率均无统计学差异(P0.05);D 组灌肠后漏液评分低于 A、B 组(P0.05);D 组粪便评分低于 A 组(P0.05).The scores of post-enema leakage showed that the group D was significantly lower than that in groups A and B(P0.05);Fecal scores of group D was significantly lower than that in group A(P0.05);HE staining showed that the pathological injury of colon-ic tissue in group D was significantly reduced compared with that in groups A and B.ConclusionCompared with the traditional enema methods,the modified mice enema device can reduce the leakage after enema and reduce the damage of colon and perianal tissue.It is easy to operate and cheap,which can provide reference for related research.Keywords:Rectal administration;Enema devices;Plug device 灌肠疗法又称直肠给药法,是在继承中医传统的直肠给药方法的基础上,结合现代灌肠技术和中医辨证论治发展起来的一种独特的疗法,在很多疾病的治疗中都有显著的优势。比如,在肠道疾病的治疗中,灌肠疗法既避免了经口服药物存在的肝脏代谢的首过效应及消化酶对药物成分的破坏,又可以直接作用于局部病损,使药物有效成分直接发挥作用,起效更快捷而安全,对保护肠黏膜、治疗溃疡性结肠炎具有显著优势1-2。在一些基础医学研究中,小鼠灌肠疗法得到广泛应用。以往的小鼠灌肠实验,灌肠管使用的是聚乙烯管、灌胃针、小口径导尿管、塑胶软管等3-9,目前尚未有小鼠专用灌肠装置,且传统灌肠后的防漏肛塞装置鲜有报道,灌肠步骤和方法也不尽相同。传统的灌肠装置整体灌肠效果不理想,且存在费时费力、容易漏药从而影响药效以及造成肠道机械损伤甚至小鼠死亡等弊端。本课题组利用简便易得的相关材料,改良了小鼠灌肠装置,优化了小鼠灌肠操作步骤;通过小鼠动物实验,与常用的 3 种传统小鼠灌肠方法进行比较,记录对比了小鼠的一般状态、生存率、小鼠灌肠后的漏液情况、粪便变化等;进行了 HE 染色,观察了肠组织病理损伤情况,验证了改良后灌肠装置的创新性、实用性和可操作性。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 SPF 级雌性昆明鼠 60 只,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,许可证号:SCXK(鲁)20220006。本实验符合实验动物伦理学要求,并得到济宁医学院动物伦理委员会的批准,伦理审批号:JNMC-2022-DW-162。所有小鼠饲养在环境温度(222)、湿度(555)%的 SPF 级动物房内,光暗循环 12h/12h,自由进食及饮水。1.1.2 主要试剂和器材 粪便隐血定性检测试剂盒(邻联甲苯胺法),购自上海源叶生物科技有限公司;一次性使用无菌导尿管(单腔儿童用,6Fr),购自湛江市事达实业有限公司;一次性使用静脉血样采集针,购自威海威高采血耗材有限公司;一次性医用注射器(1ml)及聚乙烯管,购自山东威高集团医用高分子制品股份有限公司;直头灌胃针,购自上海玻利鸽工贸有限公司。1.2 方法1.2.1动物实验及分组 60 只昆明小鼠适应性饲养1 周后,随机分为空白组、A 组、B 组、C 组和 D组(n=12)。A 组使用传统方法一:使用聚乙烯管灌肠,灌肠后保持肛门高位 2min 防止漏液;B 组使用传统方法二:使用直头灌胃针灌肠,灌肠后保持肛门高位 2min 防止漏液;C 组使用传统方法三:6Fr 导尿管灌肠,灌肠后采用夹闭小鼠肛门的方法防止药液漏出;D 组使用本课题组改良后的灌肠装置,应用 1.2.3 所述优化后灌肠操作流程进行灌肠。每组均给予 0.4ml 生理盐水进行灌肠,每日 1次,连续 14d。1.2.2 灌肠装置改良 1)灌肠装置。将 6Fr 导尿管出液口端剪短 3cm 后与 1ml 注射器连接,注意连接牢固,防止连接处漏液,导尿管头端不做任何处理,如图 1A 所示。2)肛塞装置。取采血针,将穿刺针和硅胶套部分分别截断至 1cm 左右后重新组装,剪断塑料管等多余部分,并用钢挫适当打磨光滑,如图 1B 所示。1.2.3 优化后的灌肠操作流程1)小鼠禁食不禁水 8h,灌肠操作前采用按摩腹部刺激法促进小鼠排出剩余粪便。2)腹腔注射 4%水合氯醛0.1ml/10g,使小鼠轻度麻醉。3)将药液吸入灌肠管内并排气,灌肠管顶端用生理盐水冲洗润湿,随后缓慢插入肛门 35cm 处,并轻轻按住肛门处,将药液缓慢注入,然后抽出灌肠管,迅速用顶端蘸取过液体石蜡的肛塞堵住肛门,防止药液漏出,放下小鼠使其呈自然放松状态,待药液完全吸收后取下肛塞,如图 1C 所示。1.2.4 小鼠一般状态观察 观察并记录小鼠的一般状态,包括进食水、精神状态、活动状况、皮毛光滑度、肛周大便污染等情况变化,记录小鼠的死亡532济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4情况。注:A.改进后小鼠灌肠管;B.小鼠灌肠肛塞;C.肛塞使用效果图。图 1 改进后小鼠灌肠装置及使用效果图1.2.5 灌肠后漏液情况评分 对小鼠灌肠后的漏药液情况进行评分(1 分:轻度漏药液或不漏药液;2 分:中度漏药液;3 分:严重漏药液)。1.2.6 小鼠粪便状态评分 采用按摩腹部法采集灌肠 14d 后每只小鼠新鲜粪便,观察粪便性状进行评分(1 分:正常粪便;2 分:松散粪便;3 分:稀便;4分:水样便),使用邻联甲苯胺法检测粪便隐血并进行评分(1 分:正常;2 分:隐血+/2+;3 分:隐血3+/4+;4 分:肉眼血便),合并两者得分即为粪便评分。1.2.7 结肠组织病理学观察 实验结束后处死小鼠,剖取出盲肠至直肠远端的肠组织,截取结肠至直肠末端 5cm 左右的肠管,随即用生理盐水洗净肠道内的粪便置于 4%多聚甲醛中固定后,进行石蜡包埋,切片,HE 染色,HE 染色按照常规流程进行操作10,使用光学显微镜观察肠组织病理学改变情况。1.3 统计学方法数据用 SPSS 25.0 进行分析。计量资料不服从正态分布以M(Q25,Q75)描述,采用非参数检验中的多个独立样本 Kruskal-Wallis H 检验,生存分析采用 Kaplan-Meier 法,组间比较采用 Log-rank检验。以 P0.05)。见图 2。图 2 各组小鼠灌肠 14d 的 Kaplan-Meier 生存曲线2.2 各组间小鼠灌肠后漏液和小鼠粪便评分D 组灌肠后漏液评分显著低于 A 组和 B 组(P0.05),说明改良后的灌肠装置相对于传统法A 和 B 能够减少灌肠后漏药液情况的发生。综合粪便性状和隐血或血便情况进行评分,结果显示,与空白组相比 A、B、C、D 组粪便评分有所提高,但D 组粪便评分低于 A 组,差异具有统计学意义(P0.05),这说明改良后的灌肠装置相对于传统的聚乙烯管能有效的缓解小鼠肠道和肛周机械损伤导致的粪便隐血和粪便性状改变情况。见表 1。表 1各组小鼠漏液评分及灌肠 14d 后粪便评分比较组别灌肠后漏液评分nM(Q25,Q75)粪便评分(性状+隐血/血便)nM(Q25,Q75)空白组-122(2,2)A 组122.5(2,3)104(4,5)B 组122(1,2.75)84(3,4.25)C 组121(1,1)104(3,4.25)D 组121(1,1)103(2.75,4)H 值24.29631.433P0.0010.001注:与 D 组比较,P0.05。2.3 各组别小鼠结肠组织病理形态学变化通过小鼠结肠组织 HE 染色实验,镜下可见A、B 组结肠隐窝上皮局灶减少,黏膜间质水肿伴灶性淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞浸润,C、D 组以上肠组织损伤明显较轻(图 3),说明 6Fr 导尿管灌肠相较于聚乙烯管和灌胃针能更好的保护小鼠肠道。632济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4图 3 不同组别小鼠结肠组织病理形态学变化3 讨论灌肠疗法为基础医学研究中常用的给药方法,有着其他疗法不可替代的独特优势。报道小鼠灌肠方法的文献很多,有些虽具有可操作性,但各自有其缺点。本研究改进了小鼠灌肠装置并与传统的 3 种灌肠装置进行比较发现,传统的聚乙烯管或直头灌胃针灌肠,由于材质较硬,很容易造成肠道的机械损伤,使肠道出现炎症、溃疡等病理性改变,小鼠出现稀便、水样便、血便等肠道症状,严重者可能导致小鼠死亡,而灌肠疗法又是肠道疾病治疗研究中常用的疗法,小鼠肠道的损伤究竟是疾病原有的损伤还是灌肠治疗所带来的二次损伤常常无法区分,导致实验失败。传统方法中灌肠后保持肛门高位 2min 防止漏液的方法并不能防止药液漏出,甚至漏药情况严重从而影响实验结果,而灌肠后夹闭肛门防止漏液的方法费时费力,且小鼠肛周组织比较脆弱,操作者的手对小鼠肛门处的机械挤压也会造成肛周组织的物理损伤。本课题组改良后的灌肠装置采用的 6Fr 导尿管质地柔软且口径较细,相较于传统的聚乙烯管、直头灌胃针降低了对小鼠肠壁组织的损害,肛塞的使用在保护小鼠肠道、肛门的同时能更好防止漏液,延长药物在肠道的保留时间,更有利于药液吸收和药效发挥。另外,改进的灌肠装置均采用的是一次性材料,成本低廉,易于获得。优化后的灌肠方法,明显优于传统的灌肠方法,可以为相关实验提供借鉴。但是,灌肠肛塞的使用要求较高的熟练度,如何简化装置、降低对熟练度的要求,有待进一步革新和改进。利益冲突:所有作者均申明不存在利益冲突。参考文献:1方震,杨雪,蔺晓源,等.溃疡性结肠炎的中西医治疗研究进展J.湖南中医杂志,2021,37(12):181-183.DOI:10.16808/ki.issn1003-7705.2021.12.055.2杨振斌,邱伟,王庆娜,等.近 5 年溃疡性结肠炎的中医灌肠疗法研究概况J.现代中西医结合杂志,2020,29(31):3521-3525.DOI:10.3969/j.issn.1008-8849.2020.31.023.3广布加甫藏登,布图雅.灌肠疗法研究中小鼠灌肠器的制作与应用J.亚太传统医药,2014,10(6):29-30.4姬盼盼,周中银,李櫆,等.粪菌移植在小鼠实验性结肠炎中的疗效研究J.医学研究杂志,2016,45(2):54-58.DOI:10.11969/j.issn.1673-548X.2016.02.015.5李球,丁健.小鼠灌肠方法的总结与优化J.实验动物科学,2020,37(2):70-72.DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2020.02.012.6刘顺,孙科明,杨后涞,等.雷帕霉素对克罗恩病小鼠模型的治疗作用及机制研究J.中国地方病防治杂志,2016,31(2):121-123.7罗丹,高路,仝战旗,等.五味苦参肠溶胶囊对溃疡性结肠炎小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶 1、白细胞介素-1蛋白的影响J.解放军医学院学报,2018,39(2):140-143,149.DOI:10.3969/j.issn.2095-5227.2018.02.014.8马琼,安晓霞,杜丽,等.Foxp3、IL-1 和 iNOS 在结肠炎小鼠治疗前后表达规律的初步研究J.中国体视学与 图 像 分 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