SN∕T 5359-2021 出口动物源食品中阿奇霉素残留量的测定 液相色谱-质谱∕质谱法[商检].pdf

I C S6 7. 0 5 0C C SC5 3中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 5 92 0 2 1 出口动物源食品中阿奇霉素残留量的测定液相色谱-质谱 / 质谱法D e t e r m i n a t i o n o f a z i t h r o m y c i n r e s i d u e i n f o o d s t u f f s o f a n i m a l o r i g i n f o r e x p o r tL C - M S/M S m e t h o d 2 0 2 1 - 1 1 - 2 2发布2 0 2 2 - 0 6 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 伊宁海关技术中心、 伊犁师范大学、 天津海关工业产品安全技术中心、 天津海关动植物与食品检测中心、 成都海关技术中心。 本文件主要起草人: 粟有志、 李艳美、 雷红琴、 周均、 李紫薇、 周磊 肖亚兵、 刘俊、 王兴磊、 李芳。S N/T5 3 5 92 0 2 1出口动物源食品中阿奇霉素残留量的测定液相色谱-质谱/ 质谱法1 范围本文件规定了动物源食品中阿奇霉素残留量的液相色谱-质谱/质谱检测和确证方法。 本文件适用于鸡肉、 牛肉、 羊肉、 猪肉、 猪肝、 鲤鱼、 蜂蜜、 蜂王浆、 牛奶、 奶粉、 肠衣等动物源食品中阿奇霉素残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法。3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法摘要 试样经加水涡旋分散均匀, 用乙腈震荡提取其中的阿奇霉素, 经N -丙基乙二胺(P S A) 净化, 正己烷脱脂, 采用高效液相色谱-质谱/质谱测定, 内标法定量。5 试剂与材料 除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T 6 6 8 2规定中的一级水。5. 1 乙腈: 色谱纯。5. 2 乙腈: 分析纯5. 3 正己烷: 色谱纯。5. 4 甲酸: 色谱纯5. 5 甲醇: 色谱纯5. 6 0. 1%甲酸水溶液( 体积分数) : 移取甲酸1 mL, 用水溶解并稀释至1 0 0 0 mL。5. 7 乙腈- 0. 1%甲酸水溶液(2 57 5, 体积比, 其中乙腈为色谱纯) 。5. 8 氯化钠。5. 9 微孔过滤膜:0. 2 2 m, 尼龙膜。5. 1 0 N -丙基乙二胺粉(P S A) 吸附剂5. 1 1 阿奇霉素(A z i t h r o m y c i n,C A S:8 3 9 0 5 - 0 1 - 5) 标准物质。5. 1 2 阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) (A z i t h r o m y c i n - D 5) 标准物质。 5. 1 3 阿奇霉素标准储备液: 准确称取折算纯度后的阿奇霉素标准物质(5. 1 1) ( 精确到0. 1 m g) 适量,1S N/T5 3 5 92 0 2 1用甲醇配制成1 0 0 0 g/mL的标准储备液( 避光4 保存, 有效期1 2个月) 。5. 1 4 阿奇霉素标准中间溶液: 移取阿奇霉素标准储备液(5. 1 3) 适量, 用甲醇稀释成5 0 g/mL( 避光4 保存, 有效期3个月) 。5. 1 5 阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) 储备液: 准确称取折算纯度后的阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素-D 5) 标准物质(5. 1 2) 适量, 用甲醇配制成1 0 0 0 g/mL的标准储备液( 避光4 保存, 有效期1 2个月) 。5. 1 6 阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) 中间溶液: 移取阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) 储备液(5. 1 5) 适量, 用甲醇稀释成5 0 g/mL( 避光4 保存, 有效期3个月) 。5. 1 7 标准工作溶液: 分别移取阿奇霉素标准中间溶液(5. 1 4) 适量和阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素-D 5) 中间溶液(5. 1 6) 用乙腈- 0. 1%甲酸水溶液(2 57 5, 体积比) (5. 7) 稀释成合适的标准工作溶液, 每毫升标准溶液中含有阿奇霉素氘代内标1 0 n g。5. 1 8 阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) 工作液: 移取阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) 中间溶液(5. 1 6) 适量, 用乙腈- 0. 1%甲酸水溶液(2 57 5, 体积比) (5. 7) 稀释成1 0 0 n g/mL。6 仪器和设备6. 1 液相色谱-串联质谱仪: 配有电喷雾离子源(E S I) 。6. 2 分析天平: 感量为0. 1 m g和0. 0 1 g。6. 3 组织捣碎机。6. 4 氮吹仪。6. 5 振动器。6. 6 离心机:1 0 0 0 0 r/m i n。6. 7 离心管:1 5 mL和5 0 mL。6. 8 涡旋器。7 试样制备与保存7. 1 动物组织、 内脏 鸡肉、 牛肉、 羊肉、 猪肉、 猪肝、 鲤鱼、 肠衣( 需预先置于-1 8 冰箱放置6 h以上) 等取有代表性样品约5 0 0 g, 经高速组织捣碎机捣碎, 均分成两份, 装入干净容器中, 加封后做出标记, 一份作为试样, 一份作为留样。将试样置于-1 8 条件下保存。7. 2 蜂王浆、 牛奶、 奶粉 取适量新鲜或者冷藏的样品约5 0 0 g, 充分混匀分成两份, 装入干净容器中, 加封后做出标记, 一份作为试样, 一份作为留样。将试样置于0 4 条件下保存。7. 3 蜂蜜 蜂蜜从全部样品中取出有代表性样品约5 0 0 g, 对无结晶样品的将其搅拌均匀, 均分成两份, 装入干净容器中, 加封后做出标记; 对有结晶的蜂蜜样品, 在密闭情况下, 将样品置于不超过6 0 水浴中温热,振荡待样品完全融化后搅匀, 迅速冷却至室温, 均分成两份, 装入干净容器中, 加封后做出标记。将试样置于0 4 条件下保存。2S N/T5 3 5 92 0 2 18 测定步骤8. 1 提取8. 1. 1 鸡肉、 猪肝、 肠衣等固态样品 称取样品2 g( 精确到0. 0 1 g) 于5 0 mL具塞离心管中, 加入阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) 工作液(5. 1 8)2 0 0 L, 加入8 mL水, 涡旋3 0 s, 将样品充分分散; 依次加入3 g氯化钠和1 0 mL乙腈(5. 2) ,水平振荡1 0 m i n,8 0 0 0 r/m i n离心1 m i n; 取6 mL上清液至1 5 mL具塞离心管中, 待净化。8. 1. 2 蜂蜜和牛奶等液体样品 牛奶等含水量较高的液体样品, 称取5 g( 精确到0. 0 1 g) 于5 0 mL具塞离心管中; 若是蜂蜜等粘性液体样品称取5 g( 精确到0. 0 1 g) 于5 0 mL具塞离心管中, 再加入5 mL水。加入阿奇霉素氘代内标( 阿奇霉素- D 5) 工作液(5. 1 8)2 0 0 L, 涡旋3 0 s, 将样品充分分散; 依次加入3 g氯化钠和1 0 mL乙腈(5. 2) , 水平振荡1 0 m i n,8 0 0 0 r/m i n离心1 m i n; 取6 mL上清液至1 5 mL具塞离心管中, 待净化。8. 2 净化 向6 m L上清液中加入1 0 0 m g P S A, 涡旋3 0 s, 以8 0 0 0 r/m i n的速度离心1 m i n; 取5 mL上清液至1 5 m L试管中, 于4 0 水浴氮吹至干, 用1. 0 mL乙腈- 0. 1%甲酸水溶液(2 57 5, 体积比, 乙腈为色谱纯) 溶解残渣, 加入2 mL正己烷, 涡旋1 0 s, 将溶液转移至1 5 mL离心管中, 以1 0 0 0 0 r/m i n的速度离心5 m i n; 取下层溶液过0. 2 2 m尼龙滤膜, 滤液待测。8. 3 测定8. 3. 1 液相色谱条件 液相色谱参考条件如下:a) 色谱柱:C1 8柱,2. 1 mm1 0 0 mm,3 m或相当; b) 流动相A: 含0. 1%甲酸水溶液(5. 5) ; 流动相B: 乙腈; 洗脱梯度参见表1;c) 柱温:3 5 ;d) 进样体积:1 0 L。表1 流动相及梯度洗脱条件时间/m i n流速/ (m L/m i n)流动相A(0. 1%甲酸水) /%流动相B( 乙腈) /%0. 0 00. 2 59 0. 01 0. 01. 0 00. 2 59 0. 01 0. 04. 5 00. 2 55. 09 5. 05. 5 00. 2 55. 09 5. 05. 5 10. 2 59 0. 01 0. 01 0. 0 00. 2 59 0. 01 0. 08. 3. 2 质谱条件 质谱参考条件如下:3S N/T5 3 5 92 0 2 1a) 电离方式: 电喷雾电离(E S I) ;b) 干燥气温度:3 5 0 ;c) 干燥气流量:9. 0 L/m i n;d) 鞘气温度:2 5 0 ;e) 鞘气流速:1 1. 0 L/m i n,f) 毛细管电压:4 k V;g) 扫描方式: 正离子扫描;h) 监测方式; 多重反应监测(MRM) , 监测条件参见表2。 表2 多反应监测条件化合物母离子(m/z)子离子(m/z)碎裂电压/v碰撞能量/e V阿奇霉素7 4 9. 5 5 9 1. 3*1 9 02 81 5 8. 11 9 04 0阿奇霉素- D57 5 4. 55 9 6. 3*1 9 02 8 *离子用于定量8. 3. 3 液相色谱-串联质谱测定8. 3. 3. 1 定性测定 按照上述条件测定样品和标准工作溶液, 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在2. 5%之内。定性离子对的相对丰度与浓度相当标准工作液的相对丰度一致, 相对丰度偏差不超过表3的规定, 且每个离子的信噪比均3, 可判断样品中存在相应的被测物。表3 定性时相对离子丰度的最大允许范围相对离子丰度范围/%5 02 05 0( 含)1 02 0( 含)1 0允许的相对偏差/%2 02 53 05 08. 3. 3. 2 定量测定 在仪器最佳条件下, 对样液及标准工作溶液( 阿奇霉素参考线性范围:0. 5 n g/mL1 0 n g/mL) 进样。内标法定量, 样液中待测物的响应值均在仪器测定的线性范围内。阿奇霉素及其内标物质的多重反应监测色谱图参见附录A的图A. 1和图A. 2。8. 3. 4 空白试验 除不称取试样外, 均按上述步骤操作。9 结果计算和表述 按式(1) 计算阿奇霉素残留量。计算结果需扣除空白值。 X=CVV11 0 0 0V2m1 0 0 0( 1 ) 式中:4S N/T5 3 5 92 0 2 1 X 试样中阿奇霉素的含量, 单位为微克每千克(g/k g) ; C 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度, 单位为纳克每毫升(n g/mL) ; V 试样定容体积, 单位为毫升(mL) ; V1 提取液乙腈的总体积, 单位为毫升(mL) , 即提取液1 0 mL V2 4 0 水浴氮吹至干的提取液体积, 单位为毫升(mL) , 即上清液5 mL。 m 样品称样量, 单位为克(g) 。 1 0 0 0 换算系数 计算结果保留三位有效数字。1 0 方法定量限 本方法的检出限和定量限均为1. 0 g/k g。1 1 回收率和精密度 本方法对鸡肉、 牛肉、 羊肉、 猪肉、 猪肝、 鲤鱼、 蜂蜜、 蜂王浆、 牛奶、 奶粉、 肠衣等基质进行添加回收率试验, 不同基质中不同添加水平下的回收率数据参见表4。表4 不同基质中不同添加水平下阿奇霉素的回收率和相对标准偏差(R S D)样品添加水平添加浓度1. 0 g/k g添加浓度2. 0 g/k g添加浓度1 0. 0 g/k g回收率/%R S D/%回收率/%R S D/%回收率/%R S D/%鸡肉9 5. 7 7. 0 1 0 2. 7 1 2. 6 1 0 6. 1 9. 5 牛肉1 0 9. 0 8. 7 1 0 2. 3 8. 1 1 0 5. 1 5. 0 羊肉8 5. 4 1 1. 6 8 5. 1 9. 4 9 5. 7 1 1. 6 猪肉1 0 2. 5 1 4. 6 1 0 0. 0 1 1. 0 9 5. 0 1 2. 6 猪肝9 1. 5 6. 9 8 9. 4 1 0. 7 9 4. 8 9. 8 鲤鱼9 8. 4 4. 5 1 0 5. 5 6. 8 9 1. 9 5. 5 蜂蜜1 0 3. 3 1 2. 6 9 4. 7 1 3. 6 8 5. 7 3. 6蜂王浆9 6. 3 9. 3 9 3. 0 1 3. 6 9 5. 7 6. 2 牛奶9 9. 5 9. 1 9 2. 4 8. 1 9 5. 4 1 4. 2奶粉1 0 3. 4 4. 7 1 0 1. 9 9. 1 1 0 7. 1 9. 0 肠衣1 0 4. 2 8. 5 9 1. 2 6. 2 1 0 8. 7 7. 1 5S N/T5 3 5 92 0 2 1附 录 A( 资料性)阿奇霉素及其内标物色谱图图A. 1 阿奇霉素标准溶液的提取离子色谱图(1. 0 n g/m L)图A. 2 阿奇霉素- D5内标物质的提取离子色谱图(1 0. 0 n g/m L)6S N/T5 3 5 92 0 2 1F o r e w o r dT h i s s t a n d a r d w a s d r a f t e d o n t h e b a s e o f t h e r e q u i r e m e n t o f G B/T 1. 12 0 2 0.T h i s s t a n d a r d w a s p r o p o s e d b y a n d w a s u n d e r t h e c h a r g e o f G e n e r a l A d m i n i s t r a t i o n o f C u s t o m s o f t h e P e o p l es R e p u b l i c o f C h i n a . T h i s s t a n d a r d w a s d r a f t e d b y Y i n i n g C u s t o m s T e c h n i c a l C e n t e r, Y i l i N o r m a l U n i v e r s i t y, T i a n j i n C u s -t o m s I n d u s t r i a l P r o d u c t S a f e t y T e c h n i c a l C e n t e r, T i a n j i n C u s t o m s A n i m a l a n d p l a n t a n d F o o d I n s p e c -t i o n C e n t e r, C h e n g d u C u s t o m s T e c h n i c a l C e n t e r . T h e m a i n d r a f t e r s o f t h i s s t a n d a r d a r e S u Y o u z h i, L i Y a n m e i, L e i H o n g q i n, Z h o u J u n, L i Z i w e i, Z h o u L e i, X i a o Y a b i n g, L i u J u n, W a n g X i n l e i, L i F a n g .7S N/T5 3 5 92 0 2 1D e t e r m i n a t i o n o f a z i t h r o myc i n r e s i d u e i n f o o d s t u f f s o f a n i m a l o r igi n f o r e xpo r tL C - M S/M S m e t h o d1 S c opeT h i s s t a n d a r d s p e c i f i e s t h e m e t h o d o f d e t e r m i n a t i o n a n d c o n f i r m a t i o n o f a z i t h r o m y c i n r e s i d u e i n f o o d s t u f f s o f a n i m a l o r i g i n b y L C - M S/M S m e t h o d f o r e x p o r t .T h i s s t a n d a r d i s a p p l i c a b l e t o t h e d e t e r m i n a t i o n a n d c o n f i r m a t i o n o f a z i t h r o m y c i n i n c h i c k e n, b e e f, m u t t o n, p o r k, p i g l i v e r, c a r p, h o n e y, r o y a l j e l l y, m i l k, m i l k p o w d e r a n d c a s i n g o f a n i m a l s a m p l e s .2 N o r m a t i v e R e f e r e n c e s T h e f o l l o w i n g d o c u m e n t s i s n e c e s s a r y f o r t h i s s t a n d a r d. F o r d a t e d r e f e r e n c e, o n l y d a t e d e d i t i o n s s h a l l a p p l y t o t h i s s t a n d a r d. F o r u n d a t e d r e f e r e n c e, t h e l a t e s t e d i t i o n o f t h e n o r m a t i v e d o c u m e n t r e -f e r r e d t o a p p l i e s . G B/T 6 6 8 2 W a t e r f o r a n a l y t i c a l l a b o r a t o r y u s eS p e c i f i c a t i o n a n d t e s t m e t h o d s3 T e r m s a n d d e f i n i t i o n sT h e r e a r e n o t e r m s a n d d e f i n i t i o n s t o b e d e f i n e d i n t h i s d o c u m e n t .4 P r i n c ipl eT h e t e s t s a m p l e i s d i s p e r s e d b y w a t e r a n d t h e n w h i r l p o o l e d. T h e t e s t s a m p l e w a s e x t r a c t e d b y a c e -t o n i t r i l e a n d p u r i f i e d b y N - p r o p y l e t h y l e n e d i a m i n e (P S A) , d e f a t t e d b y n - h e x a n e, d e t e r m i n e d b y H P L C/M S a n d q u a n t i f i e d b y i n t e r n a l s t a n d a r d m e t h o d.5 R e age n t s a n d m a t e r i a l sU n l e s s o t h e r w i s e s p e c i f i e d, a l l r e a g e n t s s h o u l d b e o f a n a l y t i c a l g r a d e . W a t e r i s t h e f i r s t g r a d e w a t e r p r e s c r i b e d b y G B/T 6 6 8 2.5. 1 A c e t o n i t r i l e: H P L C G r a d e .9S N/T5 3 5 92 0 2 15. 2 A c e t o n i t r i l e: a n a l y t i c a l G r a d e .5. 3 N - h e x a n e: H P L C G r a d e . 5. 4 F o r m i c a c i d: H P L C G r a d e5. 5 M e t h a n o l: H P L C G r a d e5. 6 0. 1% f o r m i c a c i d s o l u t i o n (v o l u m e f r a c t i o n) : D i l u t e 1 m L f o r m i c a c i d(5. 4) t o 1 L w i t h w a t e r .5. 7 A c e t o n i t r i l e - 0. 1% f o r m i c a c i d i n a q u e o u s s o l u t i o n (2 57 5, v o l u m e r a t i o, i n w h i c h a c e t o n i t r i l e i s c h r o m a t o g r a p h i c p u r e).5. 8 S o d i u m c h l o r i d e .5. 9 M i c r o p o r o u s f i l t r a t i o n m e m b r a n e: 0. 2 2 m, n y l o n m e m b r a n e .5. 1 0 N - p r o p y l e t h y l e n e d i a m i n e p o w d e r (P S A) a d s o r b e n t .5. 1 1 A z i t h r o m y c i n, C A S:8 3 9 0 5 - 0 1 - 5: s t a n d a r d s u b s t a n c e .5. 1 2 A z i t h r o m y c i n D e u t e r i u m i n t e r n a l s t a n d a r d (A z i t h r o m y c i n - D 5) : s t a n d a r d s u b s t a n c e .5. 1 3 A z i t h r o m y c i n s t a n d a r d r e s e r v e s o l u t i o n: A n a p p r o p r i a t e a m o u n t o f t h e a z i t h r o m y c i n s t a n d a r d s u b s t a n c e (5. 1 1) (a c c u r a t e t o 0. 1 m g) w a s a c c u r a t e l y w e i g h e d a n d p r e p a r e d i n t o 1 0 0 0 g/m L s t a n d a r d r e s e r v e s o l u t i o n w i t h m e t h a n o l (T h e r e s e r v e s o l u t i o n s t o r e d a t 4 i n d a r k ,c a n u s e f o r 1 2 m o n t h s).5. 1 4 A z i t h r o m y c i n s t a n d a r d i n t e r m e d i a t e s o l u t i o n: A p p r o p r i a t e a m o u n t o f a z i t h r o m y c i n s t a n d a r d r e s e r v e s o l u t i o n (5. 1 3) w a s d i l u t e d i n t o 5 0 g/m L w i t h m e t h a n o l (T h e i n t e r m e d i a t e s o l u t i o n s t o r e d a t 4 i n d a r k,c a n u s e f o r 3 m o n t h s).5. 1 5 A z i t h r o m y c i n - D5 r e s e r v e s o l u t i o n: A n a p p r o p r i a t e a m o u n t o f t h e a z i t h r o m y c i n i n t e r n a l s t a n d -a r d (A z i t h r o m y c i n D5) (5. 1 2) w a s a c c u r a t e l y w e i g h e d a n d p r e p a r e d i n t o 1 0 0 0 g/m L s t a n d a r d r e -s e r v e s o l u t i o n w i t h m e t h a n o l (T h e r e s e r v e s o l u t i o n s t o r e d a t 4 i n d a r k ,c a n u s e f o r 1 2 m o n t h s).5. 1 6 A z i t h r o m y c i n - D5 i n t e r n a l s t a n d a r d i n t e r m e d i a t e s o l u t i o n: D i l u t e A z i t h r o m y c i n - D5 r e s e r v e s o l u -t i o n (5. 1 5) t o 5 0 g/m L w i t h m e t h a n o l (T h e i n t e r m e d i a t e s o l u t i o n s t o r e d a t 4 i n d a r k, c a n u s e f o r 3 m o n t h s).5. 1 7 S t a n d a r d w o r k i n g s o l u t i o n: D i l u t e a z i t h r o m y c i n i n t e r m e d i a t e s o l u t i o n (5. 1 4) a n d A z i t h r o m y -c i n - D5 i n t e r n a l s t a n d a r d i n t e r m e d i a t e s o l u t i o n (5. 1 6) t o a n a p p r o p r i a t e s t a n d a r d w o r k i n g s o l u t i o n w i t h w i t h a c e t o n i t r i l e - 0. 1% f o r m i c a c i d a q u e o u s s o l u t i o n (5. 7) , p e r m i l l i l i t e r s t a n d a r d s o l u t i o n c o n -01S N/T5 3 5 92 0 2 1t a i n i n g a z i t h r o m y c i n - D5 1 0 n g .5. 1 8 Wo r k i n g A z i t h r o m y c i n - D5 s o l u t i o n: D i l u t e A z i t h r o m y c i n - D5 i n t e r m e d i a t e s o l u t i o n (5. 1 6) t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 n g/m L w i t h a c e t o n i t r i l e - 0. 1% f o r m i c a c i d(5. 7).6 Ap pa r a t u s a n d equ ipm e n t6. 1 L i q u i d c h r o m a t o g r a h y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y .6. 2 B a l a n c e s(0. 1 m g, 0. 0 1 g).6. 3 T i s s u e b l e n d e r 6. 4 N i t r o g e n e v a p o r a t o r s6. 5 V i b r a t o r6. 6 C e n t r i f u g e: 1 0 0 0 0 R /m i n .6. 7 C e n t r i f u g e t u b e s: 1 5 m L a n d 5 0 m L.6. 8 V o r t e x d e v i c e7 S a mpl e pr epa r a t i o n a n d s t o r age7. 1 A n i m a l t i s s u e s a n d v i s c e r aA b o u t 5 0 0 g r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e s o f c h i c k e n, b e e f, m u t t o n, p o r k, p i g l i v e r, c a r p a n d c a s i n g s (t o b e p l a c e d i n t h e r e f r i g e r a t o r a t -1 8 f o r m o r e t h a n 6 h o u r s i n a d v a n c e) s h o u l d b e t a k e f r o m a l l s a m p l e s, t h e n g r i n d e d a n d b l e n d e d b y a t i s s u e b l e n d e r t o p r o d u c e h o m o g e n o u s s a m p l e s . T h e s a m p l e s w e r e d i v i d e d i n t o t w o p a r t s, p l a c e d i n a c l e a n c o n t a i n e r, s e a l e d a n d m a r k e d, w i t h o n e p a r t a s t h e s a m p l e a n d t h e o t h e r a s t h e r e t e n t i o n s a m p l e . T h e s a m p l e s w e r e s t o r e d a t -1 8 .7. 2 R oya l je l ly, m i l k a n d m i l k po w d e rT a k e a n a p p r o p r i a t e a m o u n t o f f r e s h o r r e f r i g e r a t e d s a m p l e s o f a b o u t 5 0 0 g, t h o r o u g h l y m i x t h e m i n -t o t w o p a r t s, p u t t h e m i n t o a c l e a n c o n t a i n e r, s e a l t h e m a n d m a r k t h e m, o n e p a r t a s t h e s a m p l e a n d t h e o t h e r p a r t a s t h e r e t e n t i o n s a m p l e . T h e s a m p l e s w e r e s t o r e d a t 0 4 .11S N/T5 3 5 92 0 2 17. 3 h o n eyA b o u t 5 0 0 g r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e s s h o u l d b e t a k e f r o m a l l s a m p l e s . T h e n o n - c r y s t a l l i z e d s a m p l e s w e r e s t i r r e d e v e n l y, d i v i d e d i n t o t w o p a r t s, p u t i n t o a c l e a n c o n t a i n e r, s e a l e d a n d m a r k e d. T h e c r y s t a l l i z e d h o n e y s a m p l e s w e r e p l a c e d i n t h e w a t e r b a t h o f n o m o r e t h a n 6 0 f o r w a r m u n d e r t h e s e a l e d c o n d i t i o n u n t i l t h e s a m p l e s w e r e c o m p l e t e l y m e l t e d, m i x e d w e l l, a n d q u i c k l y c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e . T h e s a m p l e s w e r e d i v i d e d i n t o t w o p a r t s, p l a c e d i n a c l e a n c o n t a i n e r, s