文昌鱼Gsc基因在早期胚胎发育中的功能.pdf

第6 2卷 第5期厦门大学学报(自然科学版)V o l.6 2 N o.5 2 0 2 3年9月J o u r n a l o fX i a m e nU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)S e p.2 0 2 3 h t t p:j x m u.x m u.e d u.c nd o i:1 0.6 0 4 3/j.i s s n.0 4 3 8-0 4 7 9.2 0 2 2 0 9 0 3 2文昌鱼G s c基因在早期胚胎发育中的功能商留珂1,2,刘惠敏2,石成刚2,李 光2,王义权2*(1.洛阳职业技术学院医学技术学院,河南 洛阳4 7 1 0 0 0;2.厦门大学生命科学学院,福建 厦门3 6 1 1 0 2)摘要:同源异型盒基因G o o s e c o i d(G s c)在脊椎动物胚胎“组织者”和脊索前板形成中具有重要功能.为探究该基因在脊索动物胚胎发育中的功能演化,通过基因过表达、原位杂交等手段对其在文昌鱼胚胎发育中的功能展开分析.结果显示:向文昌鱼胚胎中注射G s cm R N A及其转录抑制形式E N-G s c(HD)m R N A,均导致胚胎发育出现相似的体轴发育畸形,说明G s c在文昌鱼胚胎发育中具有重要功能,且主要以抑制型转录因子形式发挥作用.基因表达分析显示,G s c过表达导致原肠胚期中胚层发育相关基因B r a c h y u r y、W n t 8和背部标记基因C h o r d i n、L e f t y的表达量下降,腹部标记基因V e n t表达范围向背部扩张;神经胚中期B r a c h y u r y在后端尾芽的中胚层祖细胞中表达量下降,体节标记基因m-a c t i n标记的体节数减少,神经管和尾芽标记基因W n t 3在尾芽处的表达量下降而在神经管处表达范围变宽.以上结果表明,文昌鱼G s c基因在胚胎早期发育过程中的体轴建立、中胚层形成及后期尾芽功能维持中均有重要功能.关键词:文昌鱼;G s c基因;中胚层形成;胚胎发育中图分类号:Q9 5 3 文献标志码:A 文章编号:0 4 3 8-0 4 7 9(2 0 2 3)0 5-0 8 5 8-0 7收稿日期:2 0 2 2-0 9-2 1 录用日期:2 0 2 2-1 2-2 7 基金项目:河南省卫生健康委员会医学教育研究项目(W j l x 2 0 2 0 2 6 2);国家自然科学基金面上项目(3 2 0 7 0 4 5 8,3 2 0 7 0 8 1 5)*通信作者:w a n g y q x m u.e d u.c n引文格式:商留珂,刘惠敏,石成刚,等.文昌鱼G s c基因在早期胚胎发育中的功能J.厦门大学学报(自然科学版),2 0 2 3,6 2(5):8 5 8-8 6 4.C i t a t i o n:S HA N GLK,L I UH M,S H ICG,e t a l.F u n c t i o no fG s cg e n e i ne a r l ye m b r y o g e n e s i s o f a m p h i o x u sJ.JX i a m e nU n i vN a tS c i,2 0 2 3,6 2(5):8 5 8-8 6 4.(i nC h i n e s e)“组织者”是指动物胚胎发育早期位于背部的一组具有“指导”或“组织”其他细胞分化能力的细胞,最早由德国科学家H a n sS p e m a n n在两种蝾螈(T r i t o nc r i s t a t u s和T.t a e n i a t u s)胚胎移植实验中发现并命名1.G o o s e c o i d(G s c)基因最早由C h o等2在爪蛙(X e n o p u s l a e v i s)胚胎的背唇同源异型盒基因文库中发现,其转录本存在于“组织者”区域,在爪蛙胚胎发育的4细胞时期,向腹部两个分裂球中注入G s cm R N A可诱导胚胎形成第二体轴,显示该基因具有“组织者”的功能.G s c基因广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中,在脊椎动物胚胎发育早期,该基因在“组织者”2-3及脊索前板4区域特异性表达.G s c基因突变的小鼠原肠胚期胚胎发育正常,但出生后不久即死亡,突变体小鼠颅面、颌骨发育不正常5-7,体轴发育亦受影响8.果蝇(D r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r)中与G s c基因同源的D-g s c基因也有类似功能,可挽救果蝇经紫外光照射引起的体轴异常9.敲低爪蛙胚胎中G s c基因表达,爪蛙胚胎腹部中胚层扩大1 0.由上可见,G s c基因参与胚胎的中胚层图式化和背腹轴的形成.文昌鱼是头索动物亚门(C e p h a l o c h o r d a t a)动物的总称,是 最 接 近 脊 椎 动 物 直 接 祖 先 的 现 生 动物1 1-1 3,其成体的躯体构筑方式与脊椎动物相似但更简单1 4-1 5,是研究脊椎动物胚胎发育机制和起源演化的理想模型.1 9 6 2年T u n g等1 6开展的文昌鱼移植实验及2 0 0 7年Y u等1 7在文昌鱼中发现的脊椎动物“组织者”同源基因,均证实文昌鱼存在类似脊椎动物的“组织者”区域.文昌鱼G s c基因空间表达谱数据显示1 8:原肠胚期该基因的表达集中在背部中内胚层,该区域对应于脊椎动物“组织者”;神经胚早期该基因表达位于轴中胚层,将来发育成脊索;神经胚中期,除近尾端区域外,该基因在轴中胚层的表达完全消失.而在脊椎动物中,G s c基因在原肠胚晚期的头部组织区域表达,随后在脊索前板特异表达2,1 9,Y a s u o k a等2 0认为G s c基因表达模式的改变导致脊索动物进化过程中头部的发育.文昌鱼脊索贯穿全身,前端缺乏调节脊椎动物大脑发育的脊索前板,其大脑结构十分简单,仅神经管最前端膨大形成脑泡;表达谱数据提示文昌鱼G s c基因的功能与脊椎动物既有共同之处第5期商留珂等:文昌鱼G s c基因在早期胚胎发育中的功能h t t p:j x m u.x m u.e d u.c n又有差异,但尚缺乏实验证据.本研究通过活体注射m R N A过表达文昌鱼G s c基因,观察相应的胚胎形态结构并检测相关基因的表达情况,探讨文昌鱼G s c基因在早期胚胎发育中的功能.1 材料与方法1.1 材 料佛罗里达文昌鱼(B r a n c h i o s t o m af l o r i d a e)最初引种于Y u实验室,在厦门大学王义权教授实验室已连续繁育多代.利用光周期结合热诱导的方法诱导性成熟的雌雄个体产卵排精2 1.运用王义权教授实验室已建立的方法进行显微注射2 2,以同一雌性个体所产生的部分卵不经注射直接人工受精作为对照.1.2 方 法1.2.1 目的基因质粒构建以王义权教授实验室已构建的G s c-p G EM-T质粒 为 模 板,以 特 异 引 物B b-G s c-P C R-F 1(5 -C G G G G T A C C A T G A C T A C C G T C A C C A G-3,下 划线表 示K p n酶 切 位 点)和B b-G s c-P C R-R 1(5 -C G G A C T A G T T T A C T G T C C A T C G C T A G G-3,下 划线表示S p e酶切位点)扩增同属的白氏文昌鱼(B.b e l c h e r i)G s c基因的完整编码区序列;P C R产物经双酶切回收后,连接到p X T 7载体的T 7启动子下游多克隆位点中,构建B b-G s c-p X T 7质粒.将果蝇E n g r a i l e d基因编码转录抑制区域(E N)的序列2 3-2 4与编码G s c蛋白D N A结合区域(H D)的序列重组,由其转录出的m R N A可以翻译得一嵌合蛋白,该嵌合蛋白能起到转录抑制因子的作用2 5.以果蝇基因组D N A为模板,用特异引物D m E n-E x p-F 2(5 -g g G G T A C C A T G G C C C T G G A G G A T C G C T G C AG-3,下划线表示K p n酶切位点)和D m E n-E x p-R 2(5 -g A C T A G T A G A T C T G A A T T C C T C G A G A G A T CC C A G A G C A G A T T T C T C T G-3,下划 线 分 别 表 示S p e和X h o酶切位点),扩增E N序列,P C R产物经K p n和S p e双酶切回收后连接到p X T 7载体的T 7启动子下游多克隆位点中,构建E N-p X T 7质粒.以G s c-p G EM-T质粒为模板,用引物F u s e dB b G s c-F 1(5 -c c g C T C G A G A T C G G C C A G G C G AC C C A T C C C G-3,下划线表示X h o酶切位点)和B b-G s c-P C R-R 1(5 -C G G A C T A G T T T A C T G T C C A TC G C T A G G-3,下划线表示S p e酶切位点),扩增G s c(HD)序列,P C R产物纯化回收后连接到经相同的限制性内切酶(X h o及S p e)切割的E N-p X T 7载体中,构建E N-G s c(HD)-p X T 7质粒.1.2.2 m R N A的合成重组质粒线性化后体外转录合成m R N A,用其注射文昌鱼未受精的卵,随着胚胎发育进程可翻译成蛋白并发挥作用2 2.将测序无误的B b-G s c-p X T 7和E N-G s c(HD)-p X T 7质粒用B a mH线性化,线性化产物经纯化回收后按照m E S S A G EmMA C H I N E试剂盒(Am b i o n公司)说明书操作,体外转录合成带帽的m R N A.经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测,合成所得G s cm R N A质量浓 度 为5 0 0n g/L,E N-G s c(HD)m R N A质量浓度为2 0 0n g/L.1.2.3 胚胎观察、固定及拍照活体观察比较注射G s cm R N A、E N-G s c(HD)m R N A(注射组)和未经注射(对照组)的胚胎发育情况.选取数枚胚胎置于滴加1%(质量分数)甲基纤维素溶液的载玻片上,于倒置显微镜(I X 7 1,O l y m p u s公司)下拍照记录.根据最新的文昌鱼胚胎发育时期划分标准2 6,在胚胎发育的G 5原肠胚期和N 4神经胚期分别取G s cm R N A注射组和对照组的胚胎数枚,用4%(质量分数)多聚甲醛-3-(N-吗啉基)丙磺酸固定,于4冰箱保存备用.1.2.4 文昌鱼整胚原位杂交王义权教授实验室前期已制备所涉及基因的地高辛标记反义探针.原位杂交方法参照S k y y u等2 7的报道稍作修改,将预杂交时间改为4h以上,染色底物更换为B MP u r p l e(R o c h e公司),待胚胎染色适宜后用含0.1%(体积分数)吐温-2 0的磷酸盐缓冲液洗涤终止染色,之后转移至8 0%(体积分数)丙三醇中,倒置显微镜下观察拍照.杂交后的胚胎长期保存于4冰箱中.2 结果与分析2.1 G s c基因过表达导致文昌鱼胚胎发育畸形如图1所示,G s cm R N A注射并不影响文昌鱼早期胚胎发育,但当胚胎发育至G 5原肠胚期时,经过注射的胚胎开始呈现一致的异样表型,主要表现在:与对照组相比,胚胎发育明显滞后,且原肠胚的外胚层与中内胚层分离,贴合不紧密 图1(a)和(a);在N 1神经胚期注射组的胚体后端向背面弯曲 图1(b)和(b);随着胚胎发育,在N 1至N 4神经胚期,注射组胚胎体长明显小于对照组胚胎体长,并且胚胎前端膨大 图1(c)(d);至T 1尾芽期,绝大多数注射组胚958厦门大学学报(自然科学版)2 0 2 3年h t t p:j x m u.x m u.e d u.c n胎不能形成口 图1(e)和(e);随着胚胎发育至L幼体期,头部和尾部畸形严重,身体卷曲,无法形成鳃裂等器官 图1(f)(g),最终由于胚胎严重畸形而逐渐死亡.图中标尺均为5 0m,(a)中标尺适用于(a)(e),(f)中标尺适用于(f)(g).图1 注射G s cm R N A后胚胎在发育不同时期的表型F i g.1 P h e n o t y p e so f t h e e m b r y o s i n j e c t e dw i t hG s cm R N Aa t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s2.2 G s c基因参与文昌鱼胚胎背腹轴建立及中胚层和尾芽发生 G s c基因过表达(G s cm R N A注射)导致胚胎发育自G 5期开始出现内外胚层分离,提示其可能影响胚层分化.为进一步了解文昌鱼G s c基因表达与胚层分化的关系,采用原位杂交方法检测G s c基因过表达后,文昌鱼G 5期胚胎轴中胚层发育相关基因B r a c h y u r y和W n t 82 8、背部标记基因C h o r d i n1 7和L e f t y2 9,以及腹部标记基因V e n t3 0-3 1的表达情况.如图2所示:G s c基因过表达导致B r a c h y u r y、C h o r d i n、L e f t y和W n t 8基因表达水平下降 图2(a)(h);而V e n t基因表达水平上升,表达范围向背部扩张 图2(i)(j).上述结果提示G s c基因可能在文昌鱼胚胎发育早期的背腹轴建立和中胚层发生过程中有重要作用.当文昌鱼胚胎发育至神经胚期后,在尾芽处不断形成新的体节和神经组织等,胚胎体长得以持续增加.G s c基因过表达引起文昌鱼神经胚体长变短且后端弯曲,推测其可能还影响尾芽的发育.为此在G s c基因过表达的神经胚中期(N 4期)胚胎中,分别检测体节标记基因m-a c t i n3 2、背部神经管和尾芽标记基因W n t 33 3,以及在进入神经胚期后又可作为脊索和尾芽标记基因的B r a c h y u r y表达情况.如图3所示:在G s cm R N A注射组胚胎中m-a c t i n标记的体节数(5个)明显少于对照组胚胎的体节数(7个)图3(a)和(a);B r a c h y u r y和W n t 3在G s cm R N A注射组胚胎尾芽处的表达水平明显低于对照组胚胎 图3(b)(c),W n t 3在G s cm R N A注射组胚胎背部神经管的表达范围变宽 图3(c)和(c).2.3 文昌鱼G s c可能为抑制型转录因子将E N-G s c(HD)m R N A注射到文昌鱼未受精的卵中,受精后待受精卵分别发育至N 4、T 0和L 0期时,观察E N-G s c(HD)m R N A注射对文昌鱼胚胎发育的影响.如图4所示,与G s cm R N A注射相似,E N-G s c(HD)m R N A注射同样引起胚胎弯曲、变短、前端膨大等表型,暗示文昌鱼G s c基因可能编码抑制型转录因子.3 讨 论3.1 文昌鱼G s c蛋白的转录调控活性G s c作为抑制型转录因子,在爪蛙胚胎发育中可以抑制其下游基因W n t 8的表达,维持胚胎前端正常发育3 4.果蝇E n g r a i l e d也是一种抑制型转录因子,将其转录抑制区域2 3-2 4与目的转录因子D N A结合域融合构成嵌合蛋白,可用于分析目的转录因子是抑制型068第5期商留珂等:文昌鱼G s c基因在早期胚胎发育中的功能h t t p:j x m u.x m u.e d u.c n图中标尺为5 0m.各图右下角数字含义:呈如图所示表达模式的胚胎数/该组用于原位杂交的胚胎总数(图3同).图2 G s cm R N A注射后G 5期胚胎标记基因的表达模式F i g.2 M a r k e r g e n e e x p r e s s i o np a t t e r n s i n t h e e m b r y o s i n j e c t e dw i t hG s cm R N Aa tG 5s t a g e以上均为侧面观,图中标尺为5 0m.图3 G s cm R N A注射后N 4期胚胎标记基因的表达模式F i g.3 M a r k e r g e n e e x p r e s s i o np a t t e r n s i n t h e e m b r y o s i n j e c t e dw i t hG s cm R N Aa tN 4s t a g e还是激活型.使用类似方法,本研究发现文昌鱼G s c基因过表达与胚胎显微注射E N-G s c(HD)m R N A均可导致文昌鱼胚胎出现一致的表型,暗示文昌鱼G s c基因编码抑制型转录因子,在胚胎发育早期对下游基因的表达可能有负调控作用.3.2 文昌鱼G s c基因参与胚胎中胚层形成和后端生长 文昌鱼胚胎发育过程与脊椎动物类似,也会形成168厦门大学学报(自然科学版)2 0 2 3年h t t p:j x m u.x m u.e d u.c n图中标尺为1 0 0m.图4 注射E N-G s c(HD)m R N A后不同发育时期的胚胎表型F i g.4 P h e n o t y p e so f t h e e m b r y o s i n j e c t e dw i t hE N-G s c(HD)m R N Aa t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s由中胚层细胞分化而来的脊索和体节等组织器官,通过尾芽不断分化形成新体节、神经管等组织,使体长不断增加(即后端生长).但与脊椎动物不同的是,文昌鱼胚胎不形成明确的脊索前板及与之相关的大脑3 5.基于爪蛙、斑马鱼(D a n i o r e r i o)等脊椎动物模型的研究表明,G s c、B r a c h y u r y、W n t 8和骨形成蛋白(B M P)信号是促进脊椎动物胚胎上述结构发生的重要参与者.在文昌鱼胚胎中,B r a c h y u r y和W n t 8基因的表达,以及B M P信号的活性区域与其在脊椎动物中的同源基因或信号相似,集中在中胚层祖细胞及其衍生组织中,暗示它们在文昌鱼胚胎中胚层祖细胞分化及其衍生组织的形成中具有保守的功能.本研究中G s cm R N A过表达结果显示,在文昌鱼胚胎中G s c基因对B r a c h y u r y和W n t 8基因的表达同样具有抑制作用.然而,虽然G s c基因在文昌鱼原肠胚及更早时期胚胎中的表达谱与脊椎动物胚胎的表达谱相似(均表达于胚胎背侧),但是在原肠胚之后并没有特异性地出现在脊索前板,而是持续表达于尾芽部分细胞中1 8.这种表达差异提示G s c基因获得脊索前端的表达可能是脊椎动物产生脊索前板及复杂大脑结构的关键,同时说明G s c基因在文昌鱼尾芽功能维持中扮演重要角色.本研究在文昌鱼胚胎中过表达G s c基因可导致B r a c h y u r y和W n t 3基因在尾芽处的表达下降,胚胎后端延伸无法正常发生(体节数减少),以及神经管膨大.脊椎动物胚胎后端生成主要依赖尾芽处的神经中胚层祖细胞,B r a c h y u r y基因功能异常会导致该类群细胞向中胚层分化的能力减弱,向神经外胚层分化的能力 增 强3 6;而 文 昌 鱼 同 样 存 在 后 端 生 长,且B r a c h y u r y基因特异表达于文昌鱼尾芽细胞中2 8,3 7,推测文昌鱼后端延伸机制可能与脊椎动物类似,都依赖B r a c h y u r y基因,而G s c基因过表达引起的文昌鱼后端延伸异常很可能是通过其对B r a c h y u r y基因表达的抑制引起的.但需要注意的是,上述结果也可能是由于G s c基因过表达对早期中胚层分化影响而间接造成的,阐明确切机制仍需更多精细研究.3.3 文昌鱼G s c基因参与胚胎背腹建立的机制与脊椎动物不同 位于原肠胚背侧背唇区域的“组织者”是调控脊椎动物背腹轴建立的信号中心.G s c基因是脊椎动物“组织者”最特异的标记基因之一,也是赋予“组织者”强大功能的关键基因.在爪蛙和斑马鱼等脊椎动物胚胎中过表达G s c基因可导致“组织者”变大,背侧组织向腹侧扩张(背部化);而敲低(或敲除)G s c基因表达则会使“组织者”变小,腹侧组织向背侧扩张(腹部化).机制分析显示,过表达G s c基因引起B M P信号抑制因子C h o r d i n表达区域从背侧向腹侧扩张,使得腹侧的B M P信号活性减弱,最终导致胚胎出现背部化表型;而敲低(或敲除)G s c基因表达则引起相反的结果3 8.本研究结果显示,文昌鱼也有类似脊椎动物的“组织者”区域,在文昌鱼胚胎中过表达G s c基因同样会影响其背腹轴建立,但效果却与脊椎动物相反:C h o r d i n(及L e f t y)在原肠胚背侧(“组织者”区域)表达量下降,而B M P信号通路下游基因V e n t的表达从胚胎腹侧向背侧扩张.引起这种差异的原因目前尚不清楚,推测这很可能是在两个类群生物中G s c对C h o r d i n基因表达调控机制上有差异所致:在脊椎动物中G s c促进C h o r d i n表达,而在文昌鱼中G s c抑制C h o r d i n表达.这种同源基因在头索动物和脊椎动物两个不同进化类群中的作用方式相反的现象,是否反映出进化上两个动物类群分化时选择了不同的体轴调控方式,或反映出调控胚胎体轴发生的信号网络的演化,都是有待深入研究的科学问题.参考文献:1 S P E MA N N H,MA N G O L D H.b e ri n d u k t i o n v o n268第5期商留珂等:文昌鱼G s c基因在早期胚胎发育中的功能h t t p:j x m u.x m u.e d u.c ne m b r y o n a l a n l a g e nd u r c hi m p l a n t a t i o na r t f r e m d e ro r g a n i-s a t o r e nJ.A r c h i vf r M i k r o s k o p i s c h e A n a t o m i eu n dE n t w i c k l u n g s m e c h a n i k,1 9 2 4,1 0 1(1):4 5 8.2 C HOKWY,B L UM B E R GB,S T E I N B E I S S E RH,e t a l.M o l e c u l a rn a t u r eo fS p e m a n n o r g a n i z e r:t h er o l eo ft h eX e n o p u sh o m e o b o xg e n eG o o s e c o i dJ.C e l l,1 9 9 1,6 7(6):1 1 1 1-1 1 2 0.3 G A U N TS J,B L UM M,D ER O B E R T I SEM.E x p r e s s i o no f t h em o u s eG o o s e c o i dg e n ed u r i n gm i d-e m b r y o g e n e s i sm a ym a r k m e s e n c h y m a lc e l ll i n e a g e si nt h ed e v e l o p i n gh e a d,l i m b sa n db o d yw a l lJ.D e v e l o p m e n t,1 9 9 3,1 1 7(2):7 6 9-7 7 8.4 S C HU L T E-M E R K E R S,HAMM E R S C HM I D TM,B E U C H L E D,e ta l.E x p r e s s i o no fz e b r a f i s hG o o s e c o i da n dn o t a i l g e n ep r o d u c t s i nw i l d-t y p ea n dm u t a n tn ot a i le m b r y o sJ.D e v e l o p m e n t,1 9 9 4,1 2 0(4):8 4 3-8 5 2.5 R I V E R A-P R E ZJA,MA L L OM,G E N D R O N-MA G U I R EM,e ta l.G o o s e c o i di sn o ta ne s s e n t i a lc o m p o n e n to ft h em o u s eg a s t r u l ao r g a n i z e rb u t i sr e q u i r e df o rc r a n i o f a c i a la n dr i bd e v e l o p m e n tJ.D e v e l o p m e n t,1 9 9 5,1 2 1(9):3 0 0 5-3 0 1 2.6 Y AMA D A G,MA N S O U R I A,T O R R E S M,e ta l.T a r g e t e dm u t a t i o no ft h em u r i n eG o o s e c o i dg e n er e s u l t si n c r a n i o f a c i a l d e f e c t s a n d n e o n a t a l d e a t hJ.D e v e l o p m e n t,1 9 9 5,1 2 1(9):2 9 1 7-2 9 2 2.7 B E L OJA,L E Y N SL,Y AMA D AG,e ta l.T h ep r e c h o r d a lm i d l i n e o f t h e c h o n d r o c r a n i u mi s d e f e c t i v e i nG o o s e c o i d-1m o u s em u t a n t sJ.M e c h a n i s m s o fD e v e l o p m e n t,1 9 9 8,7 2(1/2):1 5-2 5.8 F I L O S AS,R I V E R A-P R E ZJA,G M E ZAP,e ta l.G o o s e c o i da n dHN F-3g e n e t i c a l l yi n t e r a c tt or e g u l a t en e u r a l t u b ep a t t e r n i n gd u r i n gm o u s ee m b r y o g e n e s i sJ.D e v e l o p m e n t,1 9 9 7,1 2 4(1 4):2 8 4 3-2 8 5 4.9 H A H NM,J C K L EH.D r o s o p h i l aG o o s e c o i dp a r t i c i p a t e si nn e u r a l d e v e l o p m e n t b u t n o t i nb o d y a x i s f o r m a t i o nJ.T h eE M B OJ o u r n a l,1 9 9 6,1 5(1 2):3 0 7 7-3 0 8 4.1 0 S T E I N B E I S S E R H,F A I N S O DA,N I E H R SC,e ta l.T h er o l eo fG s ca n dBMP-4i nd o r s a l-v e n t r a lp a t t e r n i n go ft h em a r g i n a lz o n ei nX e n o p u s:al o s s-o f-f u n c t i o ns t u d yu s i n ga n t i s e n s eR N AJ.T h eE M B OJ o u r n a l,1 9 9 5,1 4(2 1):5 2 3 0-5 2 4 3.1 1 B L A I RJE,H E D G E SSB.M o l e c u l a rp h y l o g e n ya n dd i v e r g e n c e t i m e so fd e u t e r o s t o m ea n i m a l sJ.M o l e c u l a rB i o l o g ya n dE v o l u t i o n,2 0 0 5,2 2(1 1):2 2 7 5-2 2 8 4.1 2 D E L S U CF,B R I N KMA N NH,C HO U R R O U TD,e t a l.T u n i c a t e s a n dn o t c e p h a l o c h o r d a t e s a r e t h e c l o s e s t l i v i n gr e l a t i v e so fv e r t e b r a t e sJ.N a t u r e,2 0 0 6,4 3 9(7 0 7 9):9 6 5-9 6 8.1 3 P U T N AMNH,B U T T ST,F E R R I E RDEK,e t a l.T h ea m p h i o x u sg e n o m ea n dt h ee v o l u t i o no ft h ec h o r d a t ek a r y o t y p eJ.N a t u r e,2 0 0 8,4 5 3(7 1 9 8):1 0 6 4-1 0 7 1.1 4 B E R T R A N DS,E S C R I V A H.E v o l u t i o n a r yc r o s s r o a d si nd e v e l o p m e n t a lb i o l o g y:a m p h i o x u sJ.D e v e l o p m e n t,2 0 1 1,1 3 8(2 2):4 8 1 9-4 8 3 0.1 5 S H I M E L DSM,HO L L A N DND.A m p h i o x u sm o l e c u l a rb i o l o g y:i n s i g h t si n t ov e r t e b r a t ee v o l u t i o na n dd e v e l o p-m e n t a lm e c h a n i s m sJ.C a n a d i a nJ o u r n a lo fZ o o l o g y,2 0 0 5,8 3(1):9 0-1 0 0.1 6 T U N GY F,Y E H Y.E x p e r i m e n t a ls t u d i e so nn e u r a li n d u c t i o n i na m p h i o x u sJ.S c i e n t i aS i n i c a,1 9 6 1,1 1(6):8 0 5-8 2 0.1 7 Y UJK,S A T O U Y,HO L L A N D N D,e ta l.A x i a lp a t t e r n i n g i nc e p h a l o c h o r d a t e sa n dt h ee v o l u t i o no f t h eo r g a n i z e rJ.N a t u r e,2 0 0 7,4 4 5(7 1 2 8):6 1 3-6 1 7.1 8 N E I D E R T A H,P A N O P O U L O U G,L A N G E L A N DJA.A m p h i o x u sG o o s e c o i da n dt h ee v o l u t i o no f t h eh e a do r g a n i z e r a n d p r e c h o r d a l p l a t eJ.E v o l u t i o n&D e v e l o p m e n t,2 0 0 0,2(6):3 0 3-3 1 0.1 9 S U D O UN,Y AMAMO T OS,O G I N OH,e t a l.D y n a m i ci n v i v ob i n d i n go f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t oc i s-r e g u l a t o r ym o d u l e so fc e ra n dg s ci nt h es t e p w i s e f o r m a t i o no f t h eS p e m a n n-M a n g o l do r g a n i z e rJ.D e v e l o p m e n t,2 0 1 2,1 3 9(9):1 6 5 1-1 6 6 1.2 0 Y A S U O K A Y,T A N D O Y,K U B O K AWA K,e ta l.E v o l u t i o n o fc i s-r e g u l a t o r y m o d u l e s f o r t h e h e a do r g a n i z e rg e n eG o o s e c o i di n c h o r d a t e s:c o m p a r i s o n sb e t w e e nB r a n c h i o s t o m aa n dX e n o p u sJ.Z o o l o g i c a lL e t t e r s,2 0 1 9,5:2 7.2 1 L IG,S HUZH,WA N GYQ.Y e a r-r o u n dr e p r o d u c t i o na n d i n d u c e d s p a w n i n g o f C h i n e s e a m p h i o x u s,B r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i,i nl a b o r a t o r yJ.P L o S O n e,2 0 1 3,8(9):e 7 5 4 6 1.2 2 L I UX,L IG,F E N GJ,e t a l.A ne f f i c i e n tm i c r o i n j e c t i o nm e t h o d f o r u n f e r t i l i z e d e g g s o f A s i a n a m p h i o x u sB r a n c h i o s t o m ab e l c h e r iJ.D e v e l o p m e n t G e n e sa n dE v o l u t i o n,2 0 1 3,2 2 3(4):2 6 9-2 7