结核CR培训ppt课件.pptx

一、结核分枝杆菌基础知识二、分子诊断PCR技术基础知识三、生产操作程序结核病是由结核结核病是由结核分枝分枝杆菌杆菌（MTBMTB）感染感染引起的慢性传染病。结核菌能侵入全身引起的慢性传染病。结核菌能侵入全身各个器官，但各个器官，但80%80%发生在肺部，常称肺发生在肺部，常称肺结核。结核。常见常见肺外结核：肺外结核：淋巴结核（最常见）、结核性脑膜炎淋巴结核（最常见）、结核性脑膜炎（最严重）、（最严重）、结核性结核性胸胸膜炎、肠结核、肾结核、膜炎、肠结核、肾结核、附附睾睾结核、结核、女性生殖女性生殖系统系统结核（引起不孕不育）、结核（引起不孕不育）、骨关节骨关节 结核结核等等。结核结核病病 中国结核病流行中国结核病流行现状现状5肺结肺结核核确诊病例确诊病例临床诊断病例临床诊断病例疑似病疑似病例例仅培阳肺结核肺部病变标本病理学诊断为结核病变者标本查到标本查到结核分枝结核分枝杆菌杆菌5 岁以下儿童TB密切接触史或PPD强阳性伴有肺结核病临床症状者3 份痰标本涂片阴性,或结核中毒症状胸部影像学检查怀疑有活动性TB可能性影像符合活动性TB,PPD强阳性具有可疑症状血清免疫学检查阳性;疑似TB经诊断性治疗和/或排除类似疾病结核病诊断标准结核病诊断标准（WS288-2008WS288-2008）在有在有DNADNA单链、与单链、与DNADNA单链互补的寡核苷酸单链互补的寡核苷酸引物、引物、dNTPsdNTPs及及DNADNA聚合酶的情况下，当引物与聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在单链的互补区结合后，在DNADNA聚合酶的催化作用聚合酶的催化作用下即可进行下即可进行DNADNA单链单链5-35-3合成反应。合成反应。通过特殊的仪器不断满足上述条件，则通过特殊的仪器不断满足上述条件，则DNADNA单链的单链的5-35-3合成反应可不断进行下去，直到合成反应可不断进行下去，直到条件不复存在。实际上是模拟天然条件不复存在。实际上是模拟天然DNADNA复制过程。复制过程。PCR技术技术原理原理PCR技术原技术原理理基本基本过程过程1 1.变性：双链变性：双链DNADNA解链成为单链解链成为单链DNADNA 2.2.退火：部分引物与模板的单链退火：部分引物与模板的单链DNADNA的特定的特定互补部位互补部位相配相配 对对和结合和结合3.3.延伸：以目的基因为模板，合成互补的延伸：以目的基因为模板，合成互补的新新DNADNA链链可能造成的污染可能造成的污染1 1.纯化纯化限制性酶切的目标片段限制性酶切的目标片段 2.2.包含包含目标序列的质粒目标序列的质粒DNADNA 3.3.处理处理PCRPCR产物过程造成的反产物过程造成的反应后污染应后污染PCRPCR技术原理技术原理防止污染的操作防止污染的操作1 1.实验室实验室要求：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物要求：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物分析区；提取或加样用的超净台或安全柜有排风管直通室外。分析区；提取或加样用的超净台或安全柜有排风管直通室外。2.2.操作操作要求：使用滤芯吸头；要求：使用滤芯吸头；10ul10ul吸头使用细长吸头、在准备新反应吸头使用细长吸头、在准备新反应前更换手套；试验用器材高压消毒或前更换手套；试验用器材高压消毒或1010次氯酸钠消毒、清洁实验台次氯酸钠消毒、清洁实验台面、面、254254nmnm波长紫外线照射；减少开盖次数。不用移液器吹吸混匀试剂，波长紫外线照射；减少开盖次数。不用移液器吹吸混匀试剂，以防止产生气溶胶污染移液器以防止产生气溶胶污染移液器。3.3.设置设置对照：阴性对照、阳性对照、内对照；使用预先混合的反应成对照：阴性对照、阳性对照、内对照；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。4.UNG4.UNG防污染：在防污染：在PCRPCR反应液配制时，将反应液配制时，将dUTPdUTP和和dTTPdTTP按一定的比按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNGUNG敏感，在敏感，在PCRPCR前对新配制的反应用前对新配制的反应用UNGUNG处理以破坏残余产物，杜绝污染。处理以破坏残余产物，杜绝污染。PCR技术原理技术原理普通普通PCRPCR技术的优点及缺点技术的优点及缺点优点：高优点：高灵敏度灵敏度 高高特异性特异性 简便简便、快速、快速缺缺点点：对对PCRPCR扩扩增增反反应应的的终终点点产产物物进进行行定定量量和和定定性分析性分析。无法。无法对对 起始起始模板准确定量。模板准确定量。无法无法对扩增反应实时检测。对扩增反应实时检测。开开盖检测盖检测“气溶胶气溶胶”污染问题。污染问题。PCR技术技术原理原理配配制制标准标准环境：环境：十万十万级洁净生产区级洁净生产区。(1)(1)提前准备好配置所需的容器、化学试剂、原料等提前准备好配置所需的容器、化学试剂、原料等(2)(2)按照表中成分称取需要的化学试剂，并核对后置于适当的配制容器中。按照表中成分称取需要的化学试剂，并核对后置于适当的配制容器中。(3)(3)加入部分纯化水搅拌直至完全溶解，记录溶解开始时间；溶解结束时加入部分纯化水搅拌直至完全溶解，记录溶解开始时间；溶解结束时间；溶解间；溶解持续时间持续时间。(4)(4)如需调节如需调节PHPH值，值，必要时可用必要时可用HClHCl或或NaOHNaOH调调pHpH值至规定的范围内。值至规定的范围内。(5)(5)加纯化水定容到终体积，充分搅拌均匀，搅拌时间不少于加纯化水定容到终体积，充分搅拌均匀，搅拌时间不少于2020分钟并记分钟并记录。录。(6)(6)根据不同液体所需要的不同规格滤膜进行过滤，除去杂质。根据不同液体所需要的不同规格滤膜进行过滤，除去杂质。(7)(7)贴标签（注明名称、批号、批量、贮存温度、配制日期和配制人及保贴标签（注明名称、批号、批量、贮存温度、配制日期和配制人及保存期限）后于适当的条件保存。存期限）后于适当的条件保存。(8)(8)自检：确认核对制备程序符合工艺要求；确认核对配液记录填写真实、自检：确认核对制备程序符合工艺要求；确认核对配液记录填写真实、正确。正确。(9)(9)按相关按相关SOPSOP执行清场，填写清场记录。执行清场，填写清场记录。生产操作程生产操作程序序分装操作分装操作程序程序环境：环境：十万十万级洁净级洁净生产区生产区(1)根据生产指令领取根据生产指令领取试剂试剂瓶、盖瓶、盖和规定批号的耗材。和规定批号的耗材。(2)检查分装机工作状况，按检查分装机工作状况，按BT00-300T兰格蠕动泵标准兰格蠕动泵标准操作规程先调整相关的参数操作规程先调整相关的参数并进行试分装，分液量达标稳并进行试分装，分液量达标稳定后，按相关指令进行分装。定后，按相关指令进行分装。或者用移液器吸取规定的量与或者用移液器吸取规定的量与试剂瓶中。试剂瓶中。(3)实施分装，每分装完总批量的实施分装，每分装完总批量的20%后，至少取一瓶进行分液后，至少取一瓶进行分液量检验。如超出此范围，则刚量检验。如超出此范围，则刚分装过的总批量的分装过的总批量的20%应倒回应倒回原液中，并调整分装机的参数，原液中，并调整分装机的参数，重新分装。重新分装。(4)边分装边拧盖，并紧固瓶盖。边分装边拧盖，并紧固瓶盖。分装完毕，清点分装数量，计分装完毕，清点分装数量，计算得率并记录后，装箱贴标识算得率并记录后，装箱贴标识（注明名称、批号、批量、规（注明名称、批号、批量、规格、贮存温度、分装日期和分格、贮存温度、分装日期和分装人及保存期限）后移入一般装人及保存期限）后移入一般生产区粘贴标签，如不能及时生产区粘贴标签，如不能及时粘贴标签，应于适当条件保存。粘贴标签，应于适当条件保存。(5)按分装机清洁按分装机清洁SOP进行清洁。进行清洁。(6)自检：确认分装程序符合工艺自检：确认分装程序符合工艺要求；确认分装记录填写真实、要求；确认分装记录填写真实、正确。正确。(7)按相关按相关SOP执行清场，填写清执行清场，填写清场记录场记录生产操作生产操作程序程序贴贴签签环境：环境：一般一般生产区生产区。根据根据生产指令填写标签制备通知单。生产指令填写标签制备通知单。(1)(1)领取已打印好的标签和领取已打印好的标签和待贴签液体。待贴签液体。(2)(2)按相关按相关SOPSOP执行标签粘贴。更换不同产品时要清除执行标签粘贴。更换不同产品时要清除上批次的剩余物料。报废标签按标签报废上批次的剩余物料。报废标签按标签报废SOPSOP处理。处理。(3)(3)自检：确认贴签程序符合工艺要求；确认贴签记录自检：确认贴签程序符合工艺要求；确认贴签记录填写真实、正确。填写真实、正确。(4)(4)按相关按相关SOPSOP执行清场，填写清场记录。执行清场，填写清场记录。(5)(5)填写请验单交质量部，及时入库。填写请验单交质量部，及时入库。生产操作程序生产操作程序谢谢观谢谢观看看